Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare ibridi R-N-A-D-N-A a livello cromosomico in cellule di lievito vive, trasformando le cellule di lievito con oligonucleotidi contenenti R-N-A. Questo viene ottenuto introducendo un oligonucleotide a singolo filamento contenente R-N-A in cellule di lievito in divisione. L'oligonucleotide si appaierà quindi alla regione complementare di un gene marcatore mutato localizzato su un cromosoma del lievito, formando un ibrido R-N-A-D-N-A. Nella seconda fase, le cellule trasformate dall'oligonucleotide contenente R-N-A vengono seminate su un terreno selettivo.

Questo permette la crescita di cellule in cui la porzione di RNA dell'oligo funge da stampo per la correzione del gene marcatore mutato. Successivamente, le colonie di lievito cresciute su terreni selettivi vengono contate al fine di determinare la frequenza di correzione genica mediata dall'oligo contenente RNA; i risultati ottenuti mostrano il trasferimento di informazione genetica dal tratto di RNA dell'oligo al gene marcatore mutato nel genoma del lievito. Ciò è evidente dall'analisi di digestione con enzimi di restrizione, dall'analisi della sequenza e dal saggio di instabilità alcalina.

Ciao, sono il fondatore di HIN, il laboratorio della dottoressa Francesca della scuola di biologia del Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare ibridi R-N-A-D-N-A a livello cromosomico in cellule di lievito vive. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come la presenza di RNA incorporato nel DNA genomico venga tollerata dalle cellule e per determinare quali fattori influenzano la stabilità degli ibridi R-N-A-D-N-A in vivo.

Iniziamo. Prima di iniziare questa procedura, pulire tutti i materiali che verranno utilizzati per l'esperimento, inclusi i tubi per oligonucleotidi, le pipette, i portaprovette per vortex, l'area sperimentale e i guanti indossati dall'investigatore, con una soluzione di decontaminazione per RNAsi. Per rimuovere eventuali contaminazioni da RNAsi, utilizzare acqua priva di RNAsi, reagenti chimici, tubi e punte per pipetta durante tutta la procedura.

Ottenere un oligonucleotide contenente RNA per trasferire informazioni genetiche al DNA genomico di cellule di lievito. Il ceppo di lievito utilizzato contiene un gene trip five mutante con una delezione di due basi e una mutazione nonsenso. Tale ceppo di lievito è un mutante atrofico per il triptofano e non forma colonie su mezzi privi di triptofano.

L'oligonucleotide contenente RNA è un 65 MER con un'inserzione di due basi di DNA progettata per correggere la mutazione da delezione. Inoltre, l'oligonucleotide presenta un ribonucleotide per correggere la mutazione nonsense dell'allele trip cinque. Una volta ottenuto, preparare l'oligonucleotide contenente RNA in una soluzione madre di 250 micromolare come descritto nel protocollo scritto. 16 ore prima della trasformazione con l'oligonucleotide contenente RNA, effettuare l'inoculo.

Aggiungere 5 millilitri di mezzo liquido ricco di peptoni di lievito e destrosio (YPD) contenente le cellule di lievito mutanti trip five e coltivare le cellule a 30 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna, trasferire 1,5 millilitri della coltura notturna in 50 millilitri di mezzo liquido YPD. Incubare le cellule in un agitatore a 30 gradi Celsius a 225 rotazioni al minuto per quattro ore immediatamente prima della trasformazione criogenica.

Gli oligo contenenti RNA e i corrispondenti oligo solo DNA vanno tenuti sul ghiaccio. I corrispondenti oligo solo DNA vengono utilizzati come controllo positivo. Diluire gli oligo a 50 micromolari con acqua priva di RNA in provette prive di RNA.

Preparare 70 microlitri di ogni oligo per avere campione sufficiente per tre trasformazioni di un mol, con un eccesso. Denaturare immediatamente gli oligo contenenti RNA e gli oligo solo di DNA sul blocco riscaldante a 100 gradi Celsius per due minuti per eliminare le strutture secondarie degli oligo. Mettere i tubi sul ghiaccio, mantenendoli lì fino alla trasformazione. Preparare immediatamente prima della trasformazione la soluzione uno e la soluzione due in tubi privi di RNAs. Trasferire la coltura cellulare in un tubo da 50 millilitri privo di RNAs e centrifugare a 3000 giri al minuto, corrispondenti a 1.562 volte la forza di gravità, per due minuti.

Rimuovere il sopranatante e lavare le cellule con 50 millilitri di acqua priva di RNA. Centrifugare nuovamente le cellule a 3000 giri al minuto per due minuti. Ripetere questo processo cinque volte per eliminare il mezzo di coltura e qualsiasi RNA che potrebbe essere presente dopo l'ultima centrifugazione.

Rimuovere il sovranatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di soluzione uno. Centrifugare il campione a 3000 giri al minuto per due minuti, scartare il sovranatante e aggiungere 250 microlitri di soluzione uno alle cellule. Questa quantità di cellule è sufficiente per sette-otto trasformazioni.

Aliquotare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna di sette provette microcentrifuga prive di RNAsi. Successivamente, aggiungere 20 dei 50 micromolar di oligo contenente RNA in tre provette, 20 microlitri dei 50 micromolar di oligo solo DNA in tre provette e 20 microlitri di acqua sterile senza oligo per il controllo negativo in una provetta.

Quindi aggiungere 300 microlitri della soluzione due per ciascuna delle sette reazioni di trasformazione. Vortexare vigorosamente i campioni per mescolare i componenti. Incubare le reazioni di trasformazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un agitatore dopo l'incubazione.

Incubare i campioni a shock termico a 42 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, centrifugare le cellule a 5.000 giri al minuto, corrispondenti a 2.236 ×g, per quattro minuti. Rimuovere l'agente SUP e risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua sterile per ciascuna delle tre provette.

Prelevare un'aliquote di questa sospensione cellulare e diluire ciascuna alique con acqua sterile di 100.000 volte. Aggiungere circa 15 perle di vetro sterili per piastra e seminare 100 microlitri delle cellule diluite 100.000 volte su tre piastre YPD. Seminare 100 microlitri delle cellule risospese di ciascuna reazione di trasformazione su una piastra di Petri contenente mezzo solido sintetico completo privo di triptofano e agitare uniformemente le piastre.

Quindi rimuovere le perle. Incubare le cellule su piastre YPD a 30 gradi Celsius per due giorni e incubare le cellule piastrate su mezzo solido sintetico completo senza triptofano a 30 gradi Celsius per quattro-cinque giorni. Contare e confrontare il numero di colonie cresciute sul mezzo selettivo e sul mezzo YPD per calcolare la frequenza di correzione genica per l'oligonucleotide contenente RNA, per l'oligonucleotide solo di DNA e per il controllo senza oligonucleotide.

Non ci si aspetta alcuna formazione di colonie sul mezzo selettivo quando non vengono aggiunti oligonucleotidi alle cellule. Streakare diverse colonie trasformate scelte casualmente su mezzo YPD per ottenere isolati di colonie singole. Incubare le cellule per due giorni a 30 gradi Celsius per favorire la crescita delle colonie. Al termine dell'incubazione, selezionare diverse colonie singole e realizzare patch su mezzo YPD e sul mezzo selettivo.

Un mezzo solido sintetico completo privo di triptofano mostra crescita cellulare dopo un giorno di incubazione nelle cellule trasformate con gli oligonucleotidi, ma non nella ceppa controllo senza oligonucleotidi, coltivata sul mezzo solido sintetico completo selettivo privo di triptofano. Successivamente, progettare una coppia di primer per amplificare la regione bersaglio dell'oligonucleotide a RNA mediante PCR da colonia, iniziando così la PCR da colonia. Sospendere nuovamente le cellule prelevate dalle singole colonie in 50 microlitri di acqua contenente un'unità di liasi; incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da incubazione in un blocco termico a 100 gradi Celsius per cinque minuti, al fine di rompere le cellule e rilasciare il DNA genomico in soluzione.

Preparare le reazioni PCR in provette PCR, aggiungendo 10 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta e procedere con la reazione di amplificazione come descritto nel protocollo scritto. Eseguire i campioni ottenuti su un gel all'1% di agarosio per osservare il prodotto PCR. Poiché l'informazione genetica trasferita dall'oligonucleotide contenente RNA in questo esperimento genera un nuovo sito di restrizione VAN 91 1 nella regione genomica bersaglio del lievito, è possibile verificare il corretto trasferimento dell'informazione digerendo il prodotto PCR con l'enzima di restrizione van 91 1.

Impostare la reazione di digestione aggiungendo sei microlitri di prodotto PCR, buffer BSA, 0,5 microlitri dell'enzima di restrizione e acqua sterile fino a un volume finale di 15 microlitri. Incubare i campioni per un'ora a 37 gradi Celsius. Eseguire un campione non digerito insieme ai campioni digeriti sulla stessa riga di un gel di agarosio al 2% per osservare la modifica genetica trasferita dal tratto di RNA dell'oligonucleotide contenente RNA.

Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR e prepararli per il sequenziamento del DNA. Inviare i campioni per il sequenziamento con i stessi primer utilizzati per amplificare il prodotto. Infine, analizzare i risultati del sequenziamento del DNA mediante un software che consente l'allineamento di sequenze multiple con una sequenza di riferimento scelta per eseguire il trattamento alcalino dell'oligo contenente RNA per ogni reazione, con un mol dell'oligo contenente RNA o dell'oligo solo DNA in un tubo da 1,5 millilitri.

Quindi aggiungere quattro microlitri di idrossido di sodio uno molare per l'idrolisi oppure quattro microlitri di acqua come controllo negativo. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius in un bagno termico per un'ora dopo l'incubazione. Trasferire la reazione sul ghiaccio.

Neutralizzare la reazione di idrolisi con due microlitri di acido cloridrico 1,2 molare, quattro microlitri di tris cloridrico 1 molare e quattro microlitri di acqua per il controllo negativo. Aggiungere sei microlitri di acqua e quattro microlitri di tris cloridrico 1 molare. Mantenere i campioni sul ghiaccio fino alla trasformazione, che può essere eseguita.

Come appena descritto, le cellule di lievito trasformate senza oligo non formano alcuna colonia nel mezzo solido sintetico completo privo di triptofano fan. Al contrario, le cellule cresciute nel mezzo solido sintetico completo privo di triptofano dopo essere state trasformate con un oligo contenente RNA mostrano ora delle colonie.

Anche le colonie di lievito crescono su mezzo solido sintetico completo privo di triptofano dopo che le cellule sono state trasformate con un nanomole dell'oligo di controllo corrispondente; il trasferimento di informazione genetica dall'oligo contenente RNA al DNA cromosomico del lievito è evidente in seguito alla digestione con l'enzima di restrizione VAN 91 1 del prodotto di PCR che amplifica la regione genomica target, come mostrato. Il prodotto di PCR del locus trip. Five amplificato dal DNA genomico della ceppa mutante trip. Five è visibile.

È inoltre mostrato il prodotto della PCR amplificato da DNA genomico derivato da una colonia triplo positiva bersagliata dall'oligo contenente solo DNA. I prodotti della PCR amplificati da DNA genomico derivato da colonie triplo positive bersagliate dall'oligo contenente RNA sono stati anch'essi sottoposti ad elettroforesi su gel. I risultati della digestione con l'enzima di restrizione van 91 1 degli stessi prodotti della PCR rivelano una banda amplificata di 278 paia di basi e le bande dei prodotti di digestione ottenuti con van 91 1 di 177 e 101 paia di basi.

Il sequenziamento del DNA rivela la correzione genica mediata dall'oligo contenente RNA. Viene mostrato un elettroferogramma del DNA della regione genomica bersagliata dall'oligo contenente RNA. La g nella sequenza del DNA deriva dall'RG presente sull'oligo contenente RNA.

È inoltre indicata la sequenza di inserimento delle basi CG nella regione trip cinque dei trasformanti trip più, indirizzata dall'oligo contenente solo DNA e dall'oligo contenente RNA, che corrispondono alla sequenza consenso e vengono confrontati con quelli del trip. Cinque cellule mutanti prima dell'indirizzamento mediante gli oligo. L'oligo contenente RNA per la riparazione, in basso, presenta un'inserzione di due basi di DNA e una sostituzione di una base di RNA.

La regione delimitata in blu con ombreggiatura gialla mostra che l'oligo contenente RNA e l'oligo contenente solo DNA hanno corretto con precisione la mutazione di delezione e la mutazione nonsense in tutti i campioni testati; le linee tratteggiate indicano la posizione della sequenza dell'oligo contenente RNA. Il trattamento alcalino impedisce la correzione genica da parte dell'oligo contenente RNA; è mostrata la frequenza di trasformazione ottenuta con l'oligo contenente RNA e con l'oligo contenente solo DNA. I barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre trasformazioni indipendenti per ciascun oligo.

L'oligo solo di DNA mostra una frequenza di trasformazione simile in assenza e in presenza di trattamento con idrossido di sodio. Al contrario, la frequenza di trasformazione mediata dall'oligo contenente RNA scende a zero dopo il trattamento con idrossido di sodio. Pertanto, la preparazione contenente l'oligo con RNA non è contaminata dall'oligo solo di DNA.

Pertanto, la frequenza di trasformazione osservata è specifica per l'oligonucleotide contenente RNA. Vi abbiamo appena mostrato come formare un ibrido R-N-A-D-N-A a livello cromosomico e il trasferimento dell'informazione genetica da RNA a DNA genomico nelle cellule di lievito. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare oligonucleotidi contenenti RNA di ottima qualità e di lavorare in condizioni prive di RNA.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.