Name: Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 42 s
Description: Scopri come generare ibridi DNA/RNA nel genoma di lievito usando oligonucleotidi contenenti RNA. Questo metodo permette di studiare il trasferimento di informazione genetica da RNA a DNA.

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Fondamento logico Sfruttando l'uso di Thermo Scientific Dharmacon oligos, da 50 a 80-mers, qui vi presentiamo una procedura, basata su un test di correzione gene, con la quale oligo possibile trasferire le informazioni genetiche del DNA genomico di cellule di lievito, a seguito di ricottura al DNA bersaglio cromosomico. Successo targeting per oligo è segnato dalla comparsa di colonie di lievito visualizzare il fenotipo atteso. Se la modifica desiderata genetica avviene in una o più ribonucleotidi incorporato nella sequenza oligo, l'informazione genetica fluisce direttamente dal tratto RNA al DNA cromosomico obiettivo, quindi, un RNA / DNA forme ibride, a livello dei cromosomi durante il processo di targeting. La ribonucleotide / s di un comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo può servire come modello per gene targeting mediante sintesi di riparazione del DNA o possono essere incorporati nel DNA e fungono da modello durante la replicazione del DNA. In questi esperimenti si usa il lievito / Saccharomyces cerevisiae / sistema modello eucariotico, tuttavia, un approccio simile può essere applicato anche in altri organismi o di tipi di cellule. In questo video, usiamo un Thermo Scientific Dharmacon oligo progettato con omologia di un locus genomico obiettivo lievito e contenente uno ribonucleotide nel mezzo per correggere una mutazione del gene bersaglio. Dopo la trasformazione con l'RNA contiene oligo, osserviamo la correzione del sito mirato ad una certa frequenza, che indica che il tratto di RNA di oligo potrebbero essere inserite nel DNA cromosomico e servire da modello per la sintesi del DNA durante la replicazione del DNA. L'informazione genetica effettuata all'interno del tratto RNA è stabilmente trasmesso alle generazioni seguenti cellulari. Qui sono descritte le fasi di trasformazione di lieviti dal comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo e l'approccio per rilevare il trasferimento di informazioni RNA in DNA cromosomico. A. Progettazione del RNA contenenti oligo utilizzati in questo esperimento Abbiamo progettato un RNA che contiene oligo per correggere un difetto genetico nel lievito S. Saccharomyces DNA cromosomico a livello del locus trp5. Il ceppo di lievito utilizzato nel protocollo contiene un gene mutante trp5 con due-base cancellazione e una mutazione nonsense (Figura 1A). Tale ceppo di lievito è un mutante auxotrophic triptofano e non formano colonie su supporti senza triptofano. La sequenza di DNA del gene TRP5 è disponibile presso il Genome Database cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). L'RNA contenenti Thermo Scientific Dharmacon oligo utilizzati in questo protocollo è un 65-mer con un 2-base di inserimento del DNA, progettata per correggere la mutazione cancellazione e uno ribonucleotide progettato per correggere la mutazione nonsense dell'allele trp5 (Figura 1A). La sequenza dei oligo è concepito come segue: 5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Questo oligo è sintetizzato da Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) a 200 nM scala, ed è dissalati, deprotetto e utilizzati senza purificazione PAGINA. B. Preparazione del RNA contenenti Oligo per la trasformazione del lievito (modificato da Storici et al., 2007 1) <ol><li> Pulire i materiali che verranno utilizzati per l'esperimento compresi i tubi oligo, pipette, vortice, rack, area sperimentale e guanti indossati dallo sperimentatore con la soluzione di decontaminazione da RNasi per rimuovere il potenziale contaminazione RNasi prima inizia tutto. Utilizzare acqua priva di RNasi, reagenti chimici, tubi e puntali in tutte le fasi. Ogni passo in questo esperimento dovrebbe essere RNasi-free. </li><li> Risospendere il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligo ricevuto da parte della società a 250 pmoli / soluzione madre microlitri con RNase-free vortice d'acqua e vigorosamente per dissolvere il pellet. Conservare a -80 ° C. </li><li> Immediatamente prima della trasformazione, il disgelo RNA contenenti oligo su ghiaccio e diluire a 50 pmoli / mL con acqua RNase-free in RNasi-free tubi. Ogni trasformazione richiede 1 nmole del RNA contenenti oligonucleotidi. </li><li> Denaturare una quantità scelta del RNA contenenti oligonucleotidi sul 100 ° blocco di calore C per 2 minuti per eliminare le strutture secondarie di oligo. </li><li> Immediatamente dopo denaturazione posto il tubo sul ghiaccio. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione. </li><li> Come controllo nell'esperimento un DNA sola corrispondente oligo viene utilizzato. Questo oligo è scongelato da -20 ° C e preparate per la trasformazione come l'RNA contenenti oligo, come descritto sopra. </li></ol> C. Trasformazione di cellule di lievito con l'RNA contenenti Oligo <ol><li> Inoculare 5 ml di liquido ricco YPD con il trp5 cellule di lievito mutanti e crescere a 30 ° C durante la notte (vedi Materiali). </li><li> Trasferire 1,5 ml della cultura durante la notte in 50 ml di YPD mezzo liquido. </li><li> Incubare cellule di 30 ° C shaker (225 rpm) per 4 ore. </li><li> Preparare Soluzione 1Soluzione 2 e immediatamente prima della trasformazione in RNasi-free tubi (vedi Materiali). </li><li> Trasferire la coltura cellulare ad una da 50 ml RNasi-free tubo e far girare a 3000 giri, corrispondenti a 1562 g, per 2 minuti. Il pellet della precipitazione cellula è di ca. 0,3 centimetri 3. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e lavare con 50 ml di acqua RNase-free e far girare a 3000 rpm per 2 minuti. </li><li> Ripetere il passaggio 6 per 5 volte per sbarazzarsi del terreno di coltura e RNasi che potrebbero essere presenti nel terreno il più possibile. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di soluzione 1 e far girare a 3000 rpm per 2 minuti. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 250 microlitri di Soluzione 1. Questa quantità di cellule sufficiente per 7-8 trasformazioni. </li><li> Aliquota 50 ml di sospensione di cellule in RNasi-free microprovette, aggiungere 20 ml di RNA contenenti soluzione di oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di DNA unica soluzione oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di acqua sterile senza oligo per il controllo negativo. Poi aggiungere 300 ml di soluzione di 2 per ogni reazione di trasformazione. Non c'è bisogno di aggiungere DNA spermatico salmone nel processo di trasformazione, come l'atto oligo come vettore se stessi. </li><li> Energicamente per miscelare i componenti in maniera omogenea. </li><li> Incubare reazioni di trasformazione a 30 ° C per 30 minuti in uno shaker. </li><li> Shock termico a 42 ° C per 15 minuti. </li><li> Spin down celle a 5000 giri, corrispondenti a 2236 g, per 4 min. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 100 ml di acqua sterile. </li><li> Prelevare un 'aliquota di questa sospensione cellulare e diluirlo con acqua sterile per 100.000 volte e cellule piastra su un piatto YPD con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Piastra di tutte le cellule risospese da ogni reazione trasformazione su una piastra di Petri di terreno completo sintetico solido senza triptofano (SC-Trp) con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 4-5 giorni (Figura 2). </li></ol> D. Analisi della correzione genica del RNA contenenti Oligo <ol><li> Contare il numero di colonie cresciute sul terreno selettivo (Figura 2) e sul medio YPD per calcolare la frequenza di correzione del gene per la RNA contenenti oligo, il DNA solo oligo e per il no-oligo di controllo. Confrontare il numero ottenuto. Tasso di regressione spontanea del trp5 alleli con i due-base cancellazione e la mutazione nonsense è inferiore a 09/10 nel ceppo di lievito utilizzato, quindi ci aspettiamo nessuna formazione di colonie sul terreno selettivo in assenza di oligonucleotidi vengono aggiunti alle cellule. </li><li> Streak eseguire diversi scelto a caso trasformante colonie su terreno YPD ricevere gli isolati singola colonia. Aspettare due giorni per la crescita colonia, poi prendere diverse (almeno 5) singole colonie e fare patch su YPD e sul terreno selettivo. </li><li> Progettare un paio di primer per amplificare la regione (250-1,000 bp) destinatari del RNA contenenti oligo da colonia PCR (Figura 1B). La procedura per la colonia PCR è la seguente (modificato da Storici e Resnick, 2006 2). <ol><li> Risospendere le cellule (circa 1 mm3) tratto dalla singole patch in 50 ml di acqua e aggiungere 1 unità di liticasi. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da incubazione in un blocco di calore a 100 ° C per 5 minuti per rompere le cellule e il DNA genomico rilascio in soluzione. </li><li> Condizioni di PCR: La reazione di PCR comprende 10 microlitri della soluzione del risospensione delle cellule, 50 pmoli ciascuno dei primers forward e reverse, 1 ml di 10 mM dNTPs, 1 unità di Taq polimerasi, 5 ml di tampone 10x e viene regolata con acqua sterile ad una volume finale di 50 microlitri. Il programma di PCR è di 3 minuti a 95 ° C, 30 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 1 min a 72 ° C, un tempo l'estensione finale di 7 minuti a 72 ° C, poi i campioni sono tenute a 4 ° C. Un tempo l'estensione di 1 min / kb si assume per questa reazione. </li><li> A seguito di PCR, campioni vengono analizzati su un gel 1% o 2% (a seconda della dimensione prevista del prodotto PCR) agarosio per l'osservazione del prodotto della PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Se l'informazione genetica trasferito dal RNA contenenti oligo genera un nuovo sito di restrizione della regione bersaglio lievito genomica (Figura 1B), è possibile verificare il corretto trasferimento di informazioni da digerire il prodotto di PCR con l'enzima di restrizione appropriato. Se nessun sito di restrizione è generato dal RNA contenenti oligo, passare al punto 6. Digest prodotti PCR utilizzando uno specifico enzima di restrizione. La reazione di digestione comprende 6 ml di prodotto PCR, tampone, BSA (potrebbe non essere necessario per alcuni enzimi, vedere le istruzioni per l'enzima utilizzato), 0,5 l di enzima di restrizione, e l'acqua sterile a 15 microlitri. I campioni sono incubati per 1 ora a temperatura specifica per l'enzima utilizzato. </li><li> Eseguire un campione non digerito assieme ai campioni digeriti sulla stessa riga di un gel di agarosio al 2% perosservare la modificazione genetica trasferiti dal tratto RNA del RNA contenenti oligo (Figura 3). </li><li> Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR e prepararli per il sequenziamento del DNA. Sottoporre i campioni per il sequenziamento con il primer stesso utilizzato per amplificare il prodotto. </li><li> Analizzare i risultati sequenziamento del DNA utilizzando un software che permette l'allineamento di sequenze multiple con una sequenza di riferimento scelto (Figura 4). </li></ol> E. Trattamento alcalini del RNA contenenti oligo (Figura 5) <ol><li> Per ogni reazione, aggiungere 1 nmole (4 l di 250 pmoli / soluzione madre microlitri) di RNA contenenti oligo, o DNA-oligo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 4 ml di 1 M NaOH per idrolisi, o in alternativa aggiungere 4 microlitri H 2 O come controllo negativo, e incubare a 65 ° C a bagnomaria per 1 ora Poi passare dal bagno d'acqua in ghiaccio. </li><li> Neutralizzare con 2 ml di HCl 1,2 M, 4 ml di 1 ml M Tris-HCl, e 4 di H 2 O, o, in alternativa 6 ml di H 2 O e 4 ml di 1 M Tris-HCl per il controllo negativo. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rappresentazione schematica del gene difettoso trp5 e dell'allele TRP5 corretto dalla RNA contenenti oligo. A) Il trp5 gene mutante contiene un 2-base di cancellazione (triangoli neri) e 1-base di mutazioni nonsense (asterisco). Il singolo filamento di RNA contenenti oligo con 2-base di inserimento (anello blu) e 1-RNA sostituzione di base (rettangolo rosso), generando un Van91 ho sito enzima di restrizione (indicato da staffa) si trasforma in cellule di lievito per correggere i difetti genetici del gene trp5. B) Dopo il TRP5 gene è riparato dal RNA contenenti oligo (basi corrette sono indicate come rettangoli blu), il sito Van91 mi viene generato nel gene TRP5. Un frammento di 278 bp tra cui un solo sito di restrizione Van91 io in TRP5 PCR gene è amplificato da una coppia di primer (P1 e P2). Il 177 bp e 101 bp frammenti generati dopo la digestione del P1 e P2 prodotto di PCR da Van91 io sono mostrati. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultato della trasformazione con l'RNA contiene oligo. A) Le cellule di lievito trasformate senza oligo non fanno colonia sul SC-Trp media, vedi le tavole ab. B) Piastre cg colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del RNA contenenti oligo. C) Piastre hl colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del corrispondente DNA solo oligo di controllo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rilevazione di trasferimento delle informazioni genetiche dal RNA al DNA che contiene oligo lievito cromosomiche tramite digestione restrizione del prodotto della PCR amplificando la regione di destinazione genomica. Elettroforesi su gel 2% agarosio di campioni PCR amplificati da P1 e P2 e digerito con Van91 io enzima di restrizione. Corsie 1, 8 e 15, scala del DNA con dimensioni di 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicata sulla sinistra, corsia 2, prodotto di PCR del locus trp5 amplificato dal DNA genomico del ceppo mutante trp5, corsia 3, PCR prodotto amplificato dal DNA genomico derivato da una colonia Trp + destinatari del DNA solo oligo; corsia 4-7, prodotti della PCR amplificati dal DNA genomico derivato da Trp + colonie destinatari del RNA contenenti oligo; corsia 9 a 14, Van91 ho la digestione di restrizione dei prodotti di PCR di corsie 2 a 7. La presenza del prodotto di PCR non tagliato bande nelle corsie 10-14 può essere spiegata dalla digestione parziale Van91 I al locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando che il sito di taglio per Van91 I (CCANNNN NTGG) può avere più sequenze, il sito ha generato in TRP5 non può essere l'obiettivo ottimale per l'enzima. Infatti, dopo il sequenziamento del DNA di tutti i prodotti sopra PCR si rileva alcun cambiamento supplementari rispetto a quelle svolte dal oligos (vedi figura 4). I 278 bp banda PCR amplificato da primer P1 e P2 e le bande digestione prodotto Van91 io di 177 bp e 101 bp sono indicati dalle frecce sulla destra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Pollice" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4Thumb"></a> Figura 4. Sequenziamento del DNA, i risultati mostrano correzione genica mediante RNA contenenti oligo. A) elettroferogramma DNA della regione genomica bersaglio l'RNA contenenti oligo. Il G nella sequenza del DNA (scatola blu) deriva dal rG sul RNA contenenti oligo. Anche in scatola è l'inserimento delle basi CG. Risultati di sequenziamento da tutti gli altri prodotti di PCR sono anche CLEar come questo, con segnali fluorescenti ben al di sopra lo sfondo. B) Le sequenze della regione TRP5 del + trasformanti Trp destinatari del DNA solo oligo (T1) e l'RNA contenenti oligo (T2-T5) corrispondenza nella sequenza consenso sulla parte superiore e sono confrontati con quello della trp5 cellule mutanti prima di targeting dal oligos (DNA genomico, colorata in rosso). La riparazione RNA contenenti oligo sul fondo ha due-base di inserimento del DNA e una base (G) sostituzione di RNA marcato in rosso. Le regioni in scatola blu con tonalità gialle mostrano che l'RNA contenenti oligo così come il DNA sola oligo proprio corretto la mutazione cancellazione e la mutazione nonsense in tutti i campioni testati. Le linee tratteggiate segnano la posizione del RNA contenenti sequenze oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Trattamento alcalino impedisce di correzione genica mediante RNA contenenti oligo. La frequenza di trasformazione dal RNA contenenti oligo (R) viene mostrato nella barra rossa e che dal DNA oligo-only (D) viene mostrato nella barra blu. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media per 3 trasformazioni indipendenti per ogni oligo. Il DNA di solo oligo visualizza frequenza simile trasformazione senza e con trattamento di NaOH. Diversamente, la frequenza trasformazione dal RNA contenenti oligo scende a 0 dopo il trattamento con NaOH. Pertanto, la preparazione con l'RNA contiene oligo non è contaminato con DNA oligo-solo, quindi, la frequenza di trasformazione osservata è specifico per l'RNA contiene oligo.

<ol><li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li>
<li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li>
<li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li>
<li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+H%3A+the+enzymes+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li>
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La produzione video per questo articolo è stato sponsorizzato da Thermo Fisher Scientific, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questa pubblicazione.

Il fatto che l&#39;RNA in grado di trasferire informazioni genetiche direttamente al DNA genomico è stato scoperto nelle cellule sfruttando l&#39;uso di RNA sintetici contenenti oligonucleotidi (oligo Dharmacon sintetizzato) 1. E &#39;stata la prova di principio che le cellule possono utilizzare contenenti molecole di RNA o RNA solo sequenze come modelli per la sintesi del DNA. L&#39;uso di RNA contenenti oligonucleotidi non solo ha portato alla dimostrazione che le informazioni genetiche possono essere trasferiti direttamente da RNA a DNA genomico, senza la necessità di una trascrizione inversa di copie di DNA intermedio, ma anche per la prova che l&#39;RNA può essere utilizzato come modello nella omologhi la riparazione di un danno al DNA 1,3. L&#39;oligo può essere fatto di RNA-only o contengono solo un singolo ribonucleotide incorporato in una sequenza di DNA, come nell&#39;esempio che abbiamo presentato qui. L&#39;RNA contenenti oligo ha un ribonucleotide incorporato progettato per correggere la mutazione nonsense nella genomica trp5 allele difettoso. Il trasferimento di informazioni genetiche dal ribonucleotide al DNA genomico è rivelato da un cambiamento nel fenotipo (cellule che crescono sulle medie manca triptofano) delle cellule bersaglio. La frequenza del gene correzione ottenuta con l&#39;RNA contenenti oligo è misurata e confrontata con quella di un DNA controllo con solo oligo. Con il dosaggio di correzione genica in contesti differenti delle cellule, dove si mutano i geni del lievito diversi, siamo in grado di rilevare quale fattore / s influenzano specificatamente mira dalla RNA contenenti oligonucleotidi. Quindi, possiamo svelare i meccanismi come le cellule regolano la stabilità del DNA / RNA ibridi. Con la semplice progettazione di diverse varianti del RNA contenenti oligonucleotidi possiamo determinare la probabilità per un tratto particolare di RNA a servire come modello di modificazione del DNA e siamo in grado di determinare la stabilità di specifiche sequenze di RNA in DNA incorporato. Inoltre, siamo in grado di identificare quali sono i preferiti in substrati in vivo per i fattori che interagiscono con l&#39;RNA / ibridi DNA. Mentre diversi studi in vitro, utilizzando principalmente breve RNA contenenti oligonucleotidi, sono stati condotti per caratterizzare la funzione di fattori in grado di riconoscere l&#39;RNA in un ibrido con il DNA, come ad esempio gli enzimi RNasi H 4, le funzioni in vivo di RNasi H e come l&#39;identità di altre proteine ​​che potrebbero influenzare DNA / RNA ibrido stabilità rimangono per lo più sconosciuti. La possibilità di utilizzare l&#39;RNA contenenti oligonucleotidi di lunghezza significativa (50 a 80-mers) e di ottima qualità (come il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi) ha aperto la strada ad esaminare una vasta gamma di processi molecolari direttamente in vivo nel cellule di interesse. Come mostrato in questa trasformazione video, utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi richiede essenzialmente a pochi passi ulteriori rispetto alla trasformazione utilizzando molecole di DNA, per impedirne la degradazione per RNasi. Così, la trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi non si limita al sistema di lievito, ma può essere applicato a qualsiasi organismo o tipo cellulare in cui la trasformazione dal DNA oligo è competente. In conclusione, il targeting di cellule RNA contenenti oligonucleotidi offre la possibilità di generare ibridi RNA / DNA e ribonucleotidi incorporati nel DNA in vivo nelle cellule. La stabilità, la funzione e le conseguenze di queste generati in vivo di RNA / ibridi DNA può essere analizzato e caratterizzato, potenzialmente alla scoperta dei meccanismi di riparazione del DNA sconosciuto e rivelare nuove strategie per il gene targeting.

A. La trasformazione dei reagenti e dei media (modificato da Storici e Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Lievito peptone destrosio): Per 1 L, 10 g di estratto di lievito, 20 g di soia peptone, 20 g di destrosio. Aggiungere 15 g di agar per fare YPD terreni solidi. Autoclave prima dell&#39;uso. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Soluzione 1: 0,1 M di acetato di litio. Preparare immediatamente prima della trasformazione. Soluzione 1 è una soluzione di lavoro, così è preparata direttamente dalla polvere. Nessuna soluzione stock è fatto. Mantenere a temperatura ambiente. LIAC aumenta la permeabilità delle cellule di lievito muro al DNA. </li><li> Soluzione 2: 0,1 M di acetato di litio e il 50% del polietilene glicole 4000. Anche la soluzione 2 è una soluzione di lavoro ed è fatta direttamente dalla polvere. Nessuna soluzione stock è preparata. Mantenere a temperatura ambiente. PEG depositi oligo su cellule di lievito. </li><li> RNA contenenti oligonucleotidi (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, dissalato, deprotetto e non depurati. Risospendere a 250 pmoli / mL. Conservare a -80 ° C. </li><li> DNA solo oligo, 50-80-mers, dissalato e non depurati. Risospendere a 50 pmoli / mL. Conservare a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic multimediale completa mancanza di triptofano) terreni solidi. </li><li> 0,5 centimetri di diametro perle di vetro, sterilizzati in autoclave. </li><li> RNAsi-off: la soluzione di decontaminazione RNAsi. </li><li> DNase / RNase-free, provette sterili. </li><li> DNase / RNase-free, provette sterili conica. </li><li> DNase / RNase-free, sterile puntali aerosol con ZAP: 100-200 ml, 1-100 ml. </li></ol> B. colonia PCR materiali. <ol><li> Primer del DNA, dissalato e non depurati. Sciogliere in acqua sterile a 50 pmoli / mL. Conservare a -20 ° C. </li><li> Taq DNA polimerasi, buffer, dNTP. </li><li> Provette per PCR. </li></ol> C. PCR purificazione. <ol><li> PCR kit di purificazione. </li></ol> D. gel elettroforesi. <ol><li> Agarosio. </li><li> 1 x tampone TBE corsa (45 mM mM Tris-borato e 1 tetraacetate etilendiammina) diluito da TBE 10x. </li><li> Prestained marcatore di peso molecolare. </li><li> DNA loading dye. </li></ol> E. Limitazione digestione. <ol><li> Enzimi di restrizione, buffer 10x, BSA. </li></ol> F. Trattamento alcali per l&#39;RNA contiene oligo. <ol><li> 1 M di NaOH. </li><li> 1,2 M di soluzione di HCl. </li><li> 1 M di Tris-HCl, pH 7,4 soluzione. </li></ol>

generazione di dna / rna ibrido nel dna genomico da trasformazione utilizzando rna contenenti oligonucleotidi

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Polimeri sintetici breve acido nucleico, oligonucleotidi (oligo), sono gli strumenti più funzionali e diffusa della biologia molecolare. Oligo possono essere prodotti a contenere DNA o RNA desiderato sequenza e possono essere preparati per includere una vasta gamma di base e modifiche zucchero. Inoltre, oligo possono essere progettati per simulare specifiche alterazioni degli acidi nucleici e, quindi, possono servire come strumenti importanti per studiare gli effetti dei danni al DNA e meccanismi di riparazione. Abbiamo scoperto che Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi con una lunghezza compresa tra 50 e 80 nucleotidi può essere particolarmente adatto per studiare, in vivo, le funzioni e le conseguenze di RNA cromosomiche / ibridi DNA e di ribonucleotidi incorporati nel DNA. RNA / DNA ibridi può facilmente formare durante la replicazione del DNA, la riparazione e la trascrizione, tuttavia, molto poco si sa circa la stabilità del DNA / RNA ibridi nelle cellule e in che misura questi ibridi possono compromettere l&#39;integrità genetica delle cellule. Oligo-RNA contenenti, quindi, rappresentare un vettore ideale per introdurre ribonucleotidi nel DNA cromosomico e generare ibridi RNA / DNA di lunghezza scelta e la composizione di base. Qui vi presentiamo il protocollo per l&#39;incorporazione di ribonucleotidi nel genoma del lievito eucariote sistema modello / Saccharomyces cerevisiae /. Eppure, il nostro laboratorio ha utilizzato Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi per generare RNA / DNA ibridi a livello cromosomico in sistemi cellulari diversi, dai batteri alle cellule umane.

Questo lavoro mostra come a formare un DNA / RNA ibrido a livello cromosomico e rivelare il trasferimento di informazioni genetiche da RNA a DNA genomico in cellule di lievito.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

I polimeri sintetici a catena corta di acidi nucleici, gli oligonucleotidi (oligo), sono gli strumenti più funzionali e diffusi della biologia molecolare. Gli oligo possono essere...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare ibridi R-N-A-D-N-A a livello cromosomico in cellule di lievito vive trasformando le cellule di lievito con oligonucleotidi contenenti R-N-A. Questo risultato si ottiene introducendo un oligonucleotide a singolo filamento contenente R-N-A in cellule di lievito in divisione. L'oligonucleotide si appaierà quindi alla regione complementare di un gene marcatore mutato localizzato su un cromosoma del lievito, formando un ibrido R-N-A-D-N-A; come secondo passaggio, le cellule trasformate con l'oligonucleotide contenente R-N-A vengono seminate su un mezzo selettivo.Questo permette la crescita di cellule in cui la porzione di RNA dell'oligonucleotide funge da stampo per la correzione del gene marcatore mutato. Successivamente, le colonie di lievito cresciute su terreni selettivi vengono conteggiate al fine di determinare la frequenza di correzione genica mediata dall'oligonucleotide contenente RNA; i risultati ottenuti mostrano il trasferimento di informazione genetica dal tratto di RNA dell'oligonucleotide al gene marcatore mutato nel genoma del lievito. Ciò è evidente dall'analisi di digestione con enzimi di restrizione, dall'analisi della sequenza e dal saggio di instabilità alcalina.Ciao, sono il fondatore di HIN, del laboratorio della dottoressa Francesca della scuola di biologia del Georgia Institute of Technology. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare ibridi R-N-A-D-N-A a livello cromosomico in cellule di lievito vive. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come la presenza di RNA incorporato nel DNA genomico venga tollerata dalle cellule e per determinare quali fattori influenzano la stabilità degli ibridi R-N-A-D-N-A in vivo.Iniziamo. Prima di iniziare questa procedura, pulire tutti i materiali che verranno utilizzati per l'esperimento, inclusi i tubi per oligonucleotidi, le pipette, i portaprovette per vortex, l'area sperimentale e i guanti indossati dall'investigatore, con una soluzione di decontaminazione per RNAsi. Per rimuovere eventuali contaminazioni da RNAsi, utilizzare acqua priva di RNAsi, reagenti chimici, tubi e punte per pipetta privi di RNAsi durante tutta la procedura.Ottenere un oligonucleotide contenente RNA per trasferire informazioni genetiche al DNA genomico di cellule di lievito. Il ceppo di lievito utilizzato contiene un gene trip five mutante con una delezione di due basi e una mutazione nonsense. Tale ceppo di lievito è un mutante atrofico per il triptofano e non forma colonie su mezzi privi di triptofano.L'oligonucleotide contenente RNA è un 65 MER con un'inserzione di due basi di DNA progettata per correggere la mutazione da delezione. Inoltre, l'oligonucleotide presenta un ribonucleotide per correggere la mutazione nonsense dell'allele trip five. Una volta ottenuto, preparare l'oligonucleotide contenente RNA in una soluzione madre di 250 micromolare come descritto nel protocollo scritto. 16 ore prima della trasformazione con l'oligonucleotide contenente RNA, effettuare l'inoculo.Aggiungere 5 millilitri di mezzo liquido ricco di lievito, peptone, destrosio o mezzo YPD contenente le cellule di lievito mutanti trip five e coltivare le cellule a 30 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna, trasferire 1,5 millilitri della coltura notturna in 50 millilitri di mezzo liquido YPD. Incubare le cellule in un agitatore a 30 gradi Celsius a 225 rotazioni al minuto per quattro ore immediatamente prima della trasformazione criogenica.Gli oligo contenenti RNA e i corrispondenti oligo solo DNA vanno tenuti sul ghiaccio. I corrispondenti oligo solo DNA vengono utilizzati come controllo positivo. Diluire gli oligo a 50 micromolari con acqua priva di RNA in provette prive di RNA.Preparare 70 microlitri di ogni oligo per avere campione sufficiente per tre trasformazioni di un mol, con un leggero eccesso; denaturare gli oligo contenenti RNA e quelli di solo DNA sul blocco riscaldante a 100 gradi Celsius per due minuti per eliminare le strutture secondarie degli oligo immediatamente dopo la denaturazione. Posizionare le provette sul ghiaccio, mantenendole lì fino alla trasformazione. Preparare immediatamente prima della trasformazione la soluzione uno e la soluzione due in provette libere da RNAsi. Trasferire la coltura cellulare in una provetta da 50 millilitri libera da RNAsi e centrifugare a 3000 giri al minuto, corrispondenti a 1.562 volte la forza di gravità, per due minuti.Rimuovere il sopranatante e lavare le cellule con 50 millilitri di acqua priva di RNA. Centrifugare nuovamente le cellule a 3000 giri al minuto per due minuti. Ripetere questo processo cinque volte per eliminare il mezzo di coltura e qualsiasi RNA che potrebbe essere presente dopo l'ultima centrifugazione.Rimuovere il sopranatante e risospendere le cellule in cinque millilitri di soluzione uno. Centrifugare il campione a 3000 giri al minuto per due minuti, scartare il sopranatante e aggiungere 250 microlitri di soluzione uno alle cellule. Questa quantità di cellule è sufficiente per sette-otto trasformazioni.Aliquotare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna di sette provette microcentrifuga prive di RNAsi. Successivamente, aggiungere 20 dei 50 micromolar di oligo contenente RNA in tre provette, 20 microlitri dei 50 micromolar di oligo solo di DNA in tre provette e 20 microlitri di acqua sterile senza oligo per il controllo negativo in una provetta.Quindi aggiungere 300 microlitri della soluzione due per ciascuna delle sette reazioni di trasformazione. Vortexare vigorosamente i campioni per mescolare i componenti. Incubare le reazioni di trasformazione a 30 gradi Celsius per 30 minuti in un agitatore, seguendo l'incubazione.Incubare i campioni a shock termico a 42 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, centrifugare le cellule a 5.000 giri al minuto, corrispondenti a 2.236 ×g, per quattro minuti. Rimuovere l'agente SUP e risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua sterile per ciascuna delle tre provette.Prelevare un'aliquote di questa sospensione cellulare e diluire ogni alique con acqua sterile di 100.000 volte. Aggiungere circa 15 perle di vetro sterili per piastra e distribuire 100 microlitri delle cellule diluite 100.000 volte su tre piastre di terreno YPD. Distribuire 100 microlitri delle cellule risospese di ciascuna reazione di trasformazione su una piastra di Petri contenente terreno solido sintetico completo privo di triptofano e agitare uniformemente le piastre.Quindi rimuovere le perle. Incubare le cellule su piastre YPD a 30 gradi Celsius per due giorni e incubare le cellule seminate su mezzo solido sintetico completo senza triptofano a 30 gradi Celsius per quattro-cinque giorni. Contare e confrontare il numero di colonie cresciute sul mezzo selettivo e sul mezzo YPD per calcolare la frequenza di correzione genica per l'oligonucleotide contenente RNA, per l'oligonucleotide solo di DNA e per il controllo senza oligonucleotide.Non ci si aspetta alcuna formazione di colonie sul mezzo selettivo quando non vengono aggiunti oligonucleotidi alle cellule; tracciare alcune colonie trasformate scelte casualmente su mezzo YPD per ottenere isolati di colonie singole. Incubare le cellule per due giorni a 30 gradi Celsius per favorire la crescita delle colonie. Al termine dell'incubazione, selezionare diverse colonie singole ed effettuare innesti su YPD e sul mezzo selettivo.Un mezzo solido sintetico completo senza triptofano mostra crescita cellulare dopo un giorno di incubazione nelle cellule trasformate con gli oligonucleotidi, ma non nella ceppa controllo senza oligonucleotidi, coltivata sul mezzo solido sintetico completo selettivo privo di triptofano. Successivamente, progettare una coppia di primer per amplificare la regione bersaglio dell'oligonucleotide a RNA mediante PCR da colonia, iniziando così la PCR da colonia. Ri-sospendere le cellule prelevate dalle singole colonie in 50 microlitri di acqua contenente un'unità di liasi; incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da incubazione in un blocco termico a 100 gradi Celsius per cinque minuti, al fine di rompere le cellule e rilasciare il DNA genomico in soluzione.Preparare le reazioni PCR in provette PCR, aggiungendo 10 microlitri della sospensione cellulare a ciascuna provetta e procedere con la reazione di amplificazione come descritto nel protocollo scritto. Eseguire i campioni ottenuti su un gel all'1% di agarosio per osservare il prodotto PCR. Poiché l'informazione genetica trasferita dall'oligonucleotide contenente RNA in questo esperimento genera un nuovo sito di restrizione VAN 91 1 nella regione genomica bersaglio del lievito, è possibile verificare il corretto trasferimento dell'informazione digerendo il prodotto PCR con l'enzima di restrizione van 91 1.Impostare la reazione di digestione aggiungendo sei microlitri di prodotto PCR, buffer BSA, 0,5 microlitri dell'enzima di restrizione e acqua sterile fino a un volume finale di 15 microlitri. Incubare i campioni per un'ora a 37 gradi Celsius. Eseguire un campione non digerito insieme ai campioni digeriti sulla stessa riga di un gel di agarosio al 2% per osservare la modifica genetica trasferita dal tratto di RNA dell'oligonucleotide contenente RNA.Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR e prepararli per il sequenziamento del DNA. Inviare i campioni per il sequenziamento con gli stessi primer usati per amplificare il prodotto. Infine, analizzare i risultati del sequenziamento del DNA mediante un software che consente l'allineamento di più sequenze con una sequenza di riferimento scelta, per eseguire il trattamento alcalino dell'oligo contenente RNA per ogni reazione, con un mol dell'oligo contenente RNA o dell'oligo solo DNA in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi aggiungere quattro microlitri di idrossido di sodio uno molare per l'idrolisi oppure quattro microlitri di acqua per il controllo negativo. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius in un bagno termico per un'ora dopo l'incubazione. Trasferire la reazione sul ghiaccio.Neutralizzare la reazione di idrolisi con due microlitri di acido cloridrico 1,2 molare, quattro microlitri di tris cloridrico 1 molare e quattro microlitri di acqua per il controllo negativo. Aggiungere sei microlitri di acqua e quattro microlitri di tris cloridrico 1 molare. Mantenere i campioni sul ghiaccio fino alla trasformazione, che può essere eseguita.Come appena descritto, le cellule di lievito trasformate senza oligo non formano alcuna colonia nel mezzo solido sintetico completo privo di triptofano fan. Al contrario, le cellule cresciute nel mezzo solido sintetico completo privo di triptofano dopo essere state trasformate con un oligo contenente RNA mostrano ora delle colonie.Anche le colonie di lievito crescono su mezzo solido sintetico completo privo di triptofano dopo che le cellule sono state trasformate con un nanomole dell'oligo di controllo corrispondente; il trasferimento di informazione genetica dall'oligo contenente RNA al DNA cromosomico del lievito è evidente mediante digestione con l'enzima di restrizione VAN 91 1 del prodotto PCR che amplifica la regione genomica bersaglio, come mostrato. Il prodotto PCR del locus trip. Five amplificato dal DNA genomico della ceppia mutante trip. Five può essere osservato.È inoltre mostrato il prodotto della PCR amplificato da DNA genomico derivato da una colonia triplo positiva bersagliata dall'oligo contenente solo DNA. I prodotti della PCR amplificati da DNA genomico derivato da colonie triplo positive bersagliate dall'oligo contenente RNA sono stati anch'essi separati su gel. I risultati della digestione con l'enzima di restrizione van 91 1 degli stessi prodotti della PCR rivelano una banda amplificata di 278 paia di basi e le bande dei prodotti di digestione ottenuti con van 91 1 di 177 e 101 paia di basi.Il sequenziamento del DNA rivela la correzione genica mediata dall'oligo contenente RNA. Viene mostrato un elettroferogramma del DNA della regione genomica bersagliata dall'oligo contenente RNA. La g nella sequenza del DNA deriva dall'RG presente sull'oligo contenente RNA.È inoltre indicata la sequenza di inserimento delle basi CG della regione trip cinque dei trasformanti trip più, indirizzata dall'oligo contenente solo DNA e dall'oligo contenente RNA, che corrispondono alla sequenza consenso e vengono confrontati con quelli del trip. Cinque cellule mutanti prima dell'indirizzamento mediante gli oligo. L'oligo contenente RNA per la riparazione, in basso, presenta un'inserzione di due basi di DNA e una sostituzione di una base di RNA.La regione delimitata in blu con ombreggiatura gialla mostra che l'oligo contenente RNA e l'oligo contenente solo DNA hanno corretto con precisione la mutazione da delezione e la mutazione nonsense in tutti i campioni testati; le linee tratteggiate indicano la posizione della sequenza dell'oligo contenente RNA. Il trattamento alcalino impedisce la correzione genica da parte dell'oligo contenente RNA; è mostrata la frequenza di trasformazione ottenuta con l'oligo contenente RNA e con l'oligo contenente solo DNA. I barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre trasformazioni indipendenti per ciascun oligo.L'oligo solo di DNA mostra una frequenza di trasformazione simile in assenza e in presenza di trattamento con idrossido di sodio. Al contrario, la frequenza di trasformazione mediata dall'oligo contenente RNA scende a zero dopo il trattamento con idrossido di sodio. Pertanto, la preparazione contenente l'oligo con RNA non è contaminata dall'oligo solo di DNA.Pertanto, la frequenza di trasformazione osservata è specifica per l'oligonucleotide contenente RNA. Vi abbiamo appena mostrato come formare un ibrido R-N-A-D-N-A a livello cromosomico e il trasferimento di informazioni genetiche dall'RNA al DNA genomico nelle cellule di lievito. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare oligonucleotidi contenenti RNA di ottima qualità e di lavorare in condizioni prive di RNA.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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