Name: Intracranica allotrapianto ortotopico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
Description: Impara l'allotrapianto ortotopico intracranico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi per studiare la formazione tumorale secondaria. Questo metodo consente di analizzare i sintomi neurologici e la progressione del tumore in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti della Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), il Brain Tumor Foundation Infanzia e il National Institutes of Health (NS042205).

1. Micro-dissezione del tumore-cuscinetto cervelletto e dissociazione del tessuto tumorale <ol><li> Recupero del tessuto tumorale <ol><li> Topi malati cuscinetto medulloblastoma sono spesso runted e visualizzare idrocefalo e tipici sintomi neurologici, tra cui paralisi posteriore e l&#39;incapacità di riacquistare la postura in caso di ribaltamento. Per recuperare tessuto tumorale, eutanasia topi per inalazione di anidride carbonica. E &#39;troppo importante per noi non eseguire dislocazione cervicale, una procedura che genera una pressione al cranio posteriore e può compromettere l&#39;integrità del tessuto tumorale. </li><li> Decapitazione viene eseguita subito dopo la morte con un paio di forbici, la rimozione dei capelli e tessuto muscolare il più possibile per una buona visualizzazione del cranio. Pulire la superficie del cranio con Kimwipe imbevuto di etanolo al 95%. </li><li> Usare le forbici per tagliare bene un&#39;apertura lungo la linea mediana del cranio, e rimuovere il tessuto cranio con una pinzetta sottile, a questo punto l&#39;intero cervello compreso portatori di tumore cervelletto è esposto. </li><li> Mentre il cervello dei degli adulti sani visualizzare ben definite emisferi e del verme, il tumore del cervello dei topi portatori sono spesso allargata, amorfo con una superficie liscia e vasi sanguigni cospicua. Usando tecniche sterili, recuperare il tumore del cervelletto con delle pinzette e mettere in ghiaccio freddo tampone fosfato (PBS) senza Mg 2 + e Ca 2 +. </li></ol></li></ol> Nota: tutti gli strumenti sono disinfettati in etanolo al 95% e del vapore in autoclave prima dell&#39;uso. <ol start="2"><li> Dissociazione del tessuto tumorale <ol><li> Trasferire il tessuto tumorale da PBS al 50% Accutase (diluito in PBS) che è circa 4 volte il volume del tessuto tumorale, tritare il tessuto con le forbici multa per 3 minuti a temperatura ambiente, seguita da incubazione a 37 ° C per 4 minuti , dopo di che il tessuto subisce pipeting ripetitivi con un 1 mL Pipetman per altri 3 minuti. Questo metodo dovrebbe produrre un insieme di celle singole e piccoli aggregati cellulari. </li><li> Diluire la sospensione cellulare di 3 volte con PBS e centrifugare per 5 minuti a 1000xg per agglomerare le cellule. (Le procedure di cui sopra sono stati descritti in &quot;isolamento, l&#39;arricchimento e il mantenimento delle cellule staminali medulloblastoma&quot;, Giove in stampa) </li></ol></li></ol> Risospendere il pellet di cellule in appena preparato medio di cellule staminali neurali composto medio Neurobasal con la glutamina, penicillina-streptomicina, N2, B27, umano EGF (25 ng / ml) e di base FGF (25 ng / mL). Calcolare la densità delle cellule della soluzione e le opportune diluizioni ulteriormente con l&#39;aggiunta di cellule staminali neurali medio tale che si può carico di 4 ml di soluzione con un numero adeguato di cellule tumorali dissociata, ad esempio 5x10 5, in una sterile conici a punta siringa 10μL. Il numero esatto di cellule da inoculare deve essere determinato dal ricercatore in base alle specifiche esigenze sperimentali. Conservare la soluzione di cellule in una provetta da microcentrifuga mini 200μL (tubo PCR) su ghiaccio. 2. Procedure di anestetico per il Mice destinatario Per la procedura chirurgica, una zona disinfettata dedicata alla chirurgia roditori è necessario per la durata della procedura. Idealmente, impostare una lunga panca con aree separate ma adiacenti per la preparazione degli animali, campo operatorio e il recupero degli animali. Guanti chirurgici, non guanti esame, sono necessari per l&#39;intervento chirurgico. Tecnica asettica è mantenuta tenendo le mani guantate di sopra della vita e utilizzato solo per gestire gli oggetti sterili da una superficie asciutta sterile. <ol><li> Una miscela di ketamina (100 mg di ketamina per 1 kg di peso del mouse) e xilazina (10 mg xylazina per 1 kg di peso del mouse) è utilizzato per l&#39;anestesia. Amministrare il intraperitoneale anestetici. </li><li> Di solito, occorrono 3-5 minuti per il anestetici abbiano pieno effetto. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato da tep / coda pizzico. Mettere una piccola quantità di pomata oftalmica sugli occhi del mouse. Portare il mouse completamente anestetizzati per l&#39;area operativa, monitorando costantemente per assicurarsi che il mouse sta respirando normalmente. </li></ol> 3. Intracranica innesto delle cellule tumorali <ol><li> Radere la regione dorsale posteriore del capo del mouse, utilizzando un tagliatore di capelli, per rivelare il cranio posteriore sopra il mesencefalo e cervelletto. </li><li> Applicare la soluzione di Betadine sul cuoio capelluto esposto utilizzando un cotton-fioc, seguiti strofinando con un tampone di alcool. Ripetere questi due passaggi di sterilizzazione per due volte. </li><li> Fare un quarto di pollice incisione nel cuoio capelluto posteriore utilizzando un bisturi sterilizzato. Praticare un foro mm 0,5 bava 2 mm a destra e 2 mm posteriormente al lambda con un trapano sterile dentale. </li><li> Posizionare il mouse su un telaio stereotassico agganciando la sua incisivi sul possesso telaio. Con attenzione scendere e posizionare il bisello a punta siringa da 10 microlitri caricata con 4 ml di soluzione delle cellule tumorali nel foro bava. Una volta che la smussatura dei SyriESN è l&#39;ago sotto la superficie del cranio, si scende per un altro mm 3 e poi risalire per 0,5 mm. Iniettare lentamente la quantità desiderata di cellule tumorali, con una forza costante in un fotogramma 30 la seconda volta, nel cervelletto del destinatario. Lasciare l&#39;ago al suo posto dopo il completamento di iniezione per altri due minuti. Quindi rimuovere l&#39;ago e siringa. Clip della ferita utilizzando un autoclip. </li><li> Tenere il mouse su una coperta riscaldamento dopo l&#39;intervento per aiutare a mantenere la sua temperatura corporea. Modelli di mobilità e respiratorie verrà osservato continuamente. Una volta che il mouse recupera da anestesia, è posto di nuovo in una gabbia alloggiamento sterile. Monitorare giorno per l&#39;assunzione di cibo e acqua, comportamento, governare, e la colorazione rossa degli occhi. Controllare eventuali segni di infezione nel sito di incisione. Rimuovere il autoclips al giorno 7 dopo l&#39;intervento chirurgico. Mantenere i topi per una media di 2-6 mesi e di sacrificio quelle che espongono i sintomi tipici medulloblastoma per ulteriori studi. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Medulloblastomi secondario sviluppato in topi riceventi molto simile a quelle del tumore primario. Il cervello dei portatori di tumori secondari erano spesso allargata, amorfo con i vasi sanguigni ectopica evidente se visto nel suo complesso-monti. Analisi immunoistochimica del tessuto tumorale secondaria rivelato che le cellule tumorali sono altamente proliferative, esprimere forte SmoM2-YFP e marcatori dei precursori neuronali dei granuli cerebellari, come Math1 e Pax6. Quando i metodi con dissociato e colto riportato (&quot;L&#39;isolamento, l&#39;arricchimento e il mantenimento delle cellule staminali medulloblastoma&quot;, Giove in stampa), il secondario cellule tumorali medulloblastoma possono essere espanse rapidamente, esprimere molteplici marcatori di cellule staminali, sono clonogenica e possono ulteriormente avviare la formazione di tumori quando trapiantate in ulteriori destinatari immunocompromessi. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Tipica con tutto il supporto e viste in sezione di un tessuto medulloblastoma secondaria Un tipico esempio di tessuto medulloblastoma secondario sviluppato 26 giorni dopo l&#39;iniezione di 5x10 5 cellule del tumore primario. Colorazione ematossilina rivela la tipica morfologia cellulare del medulloblastoma, tra cui alti nucleare / citoplasma rapporto e il polimorfismo nucleare. Queste cellule tumorali secondarie sono altamente proliferative come indicato da Ki67 espressione e anche robusta esprimere membranose SmoM2-YFP. <img src="/files/ftp_upload/2153/2153fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Cellule di medulloblastoma secondarie possono essere coltivate ed espanse in vitro Utilizzando il protocollo descritto per le cellule primarie medulloblastoma del mouse (&quot;L&#39;isolamento, l&#39;arricchimento e il mantenimento delle cellule staminali medulloblastoma&quot;, Giove in stampa), queste cellule secondarie medulloblastoma possono essere coltivate ed espanse per passaggi multipli. L&#39;immagine mostra la stessa colonia tumore rappresentante colto in 4 giorni e 14 giorni. Le cellule tumorali in coltura sono bipolari, di forma allungata con citoplasma scarso e spesso si irradiano da un nucleo denso di aggregati cellulari. Essi non presentano contatto inibizione della crescita. Le piccole cellule rotonde sono globuli rossi.

<ol><li>Schuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granule+neuron+precursor+identity+is+a+critical+determinant+of+progenitor+cell+competence+to+form+Shh-induced+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma.</a> Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).</li>
<li>Yang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Kessler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+alters+the+fate+of+preneoplastic+cells+in+a+mouse+model+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma.</a> Genes Dev. 23, 157-170 (2009).</li>
<li>Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Atoh1+disrupts+Sonic+Hedgehog+signaling+in+the+developing+cerebellum+and+prevents+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma.</a> Science. 326, 1424-1427 (2009).</li>
<li>Salsano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+neurogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+NEUROG1+identifies+a+subgroup+of+medulloblastomas+not+expressing+ATOH1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1.</a> Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Diversi fattori critici di successo per garantire la cellula medulloblastoma allotrapianto che la formazione di tumori rendimenti secondarie sono le seguenti: in primo luogo, utilizzare solo Accutase 50% per il tessuto dissociazione e non oltre il digest del tessuto come trattamento enzimatico prolungata porta ad una significativa riduzione della vitalità delle cellule. Anche utilizzare solo il Pipetman taglia 1 ml più piccole punte può anche generare danni fisici alle cellule dissociate. E &#39;bene avere una miscela d...

<table><tbody><tr><td>Mezzo Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td>25ng/ml</td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B27(-RA)</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td>50% </td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2mM</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Trapano a flessibile Foredom, modello con supporto sospeso</td><td>Stoelting Co.</td><td>58650</td><td></td></tr><tr><td>Portaprobe grande</td><td>Stoelting Co.</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 &amp;mu;L, 26 ga., con punta smussata</td><td>Stoelting Co.</td><td>51105</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano da 0,75 mm</td><td>Stoelting Co.</td><td>51455-3</td><td></td></tr></tbody></table>

intracranica allotrapianto ortotopico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Il medulloblastoma è il tumore più comune pediatrici del sistema nervoso. Una grande quantità di studi sugli animali si è concentrata sui precursori neuronali dei granuli del cervelletto (CGNPs) come la cellula di origine per il medulloblastoma 1-4. Tuttavia, le diverse presentazioni cliniche dei sottotipi medulloblastoma nei pazienti umani (nodulare, desmoplastico, classica e grandi cellule / anaplastico), e il fatto che il medulloblastoma si trova in un sottogruppo di pazienti umani senza espressione ectopica di CGNP marcatore 5, suggeriscono che la origini cellulare e molecolare di medulloblastoma sono più complessi e lungi dall&#39;essere completamente decifrato. Pertanto, è essenziale per determinare se vi è un tumore medulloblastoma alternativa di cellule di origine sulla base di quale tipo cellulare specifico modalità terapeutica può essere sviluppato. A tal fine, ortotopico intracranica allotrapianto di organismi geneticamente segnato tipi di cellule tumorali seguita da successive analisi secondaria di sviluppo del tumore nei pazienti consentirà di determinare l&#39;origine cellulare delle cellule tumorali iniziare. Qui descriviamo il protocollo sperimentale per ortotopico intracranica allotrapianto di cellule derivate da medulloblastoma primario tessuto tumorale, e questa procedura può essere utilizzata anche per il trapianto di cellule provenienti da linee cellulari stabilizzate.

Questo protocollo descrive l&#39;isolamento e la dissociazione del tessuto medulloblastoma mouse e allotrapianto successive delle cellule tumorali in topi immunocompromessi destinatario al fine di avviare medulloblastoma secondario.

Intracranica allotrapianto ortotopico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi

Il medulloblastoma è il tumore del sistema nervoso più comune in età pediatrica. Un vasto numero di studi animali si è concentrato sui neuroni granulari cerebellari...

L'obiettivo generale di questa procedura è impiantare cellule tumorali di medulloblastoma allogeniche in un ospite immunocompromesso per indurre la formazione di un tumore secondario. Questo viene ottenuto innanzitutto dissociando il tessuto primario di medulloblastoma in singole cellule e piccoli aggregati cellulari. Il secondo passaggio della procedura consiste nel preparare topi immunocompromessi per l'iniezione intracranica.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire la microiniezione di cellule tumorali nel cervelletto dell'ospite. Gli ultimi passaggi della procedura prevedono il mantenimento e l'osservazione degli ospiti trapiantati con cellule tumorali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la formazione di medulloblastoma secondario negli ospiti, evidenziata dai sintomi neurologici osservati e dall'analisi istologica.Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia del cancro, come determinare l'origine cellulare di un tumore e i fattori importanti per l'insorgenza e la propagazione dei tumori. Microdissezionare e dissociare il tessuto tumorale da un medulloblastoma, come descritto nell'articolo video associato

intracranial-orthotopic-allografting-medulloblastoma-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Un metodo è descritto per propagare i tumori retinoblastoma umano nei topi. Le cellule tumorali sono direttamente iniettate negli occhi di topi privi di sistema immunitario. Tumori secondari sono state stabilite con successo utilizzando sia le cellule raccolte direttamente da tumori umani e tumorspheres colta.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere l'utilizzo di un modello di glioblastoma ortotopico per gli studi di chemio-radioterapia. Questo articolo passare attraverso l'elaborazione delle cellule, l'impianto, e la radioterapia del mouse utilizzando un modello intracranica.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

Questo video dimostra l'impianto di cellule tumorali nel cervello del topo eseguendo l'iniezione intracranica.

Modello ortotopico intracranico: una procedura per impiantare cellule tumorali nel cervello di topo

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

Alla ricerca di tumore terapeutiche cellule staminali mesenchimali (MSCs) mostrano la promessa come trattamento per glioblastoma dilagante. Trapianto ottimo coinvolge consegna delle MSC in cavità di resezione del tumore su ponteggi. Qui, preclinici tecniche per studiare il trattamento del MSC di glioblastoma sono forniti tra cui: resezione del tumore immagine-guida; impianto di scaffold MSC-seminato; e terapia postoperatoria di rilevamento.

Immagine-Guida di resezione del Glioblastoma e l'impianto intracranico di terapeutica delle cellule staminali-seminato ponteggi

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Qui, descriviamo un modello murino ortotopico preclinico per GBM, stabilito mediante iniezione intracranica di cellule derivate da tumori modello murino geneticamente modificati. Questo modello mostra le caratteristiche della malattia del GBM umano. Per gli studi traslazionali, il tumore cerebrale del topo viene monitorato mediante risonanza magnetica in vivo e istopatologia.

Modelli ortotopici traslazionali di glioblastoma multiforme

Lo sviluppo di modelli ortotopici di tumore cerebrale pediatrico richiede una precisione meticolosa, utilizzando un dispositivo stereotassico per impiantare con precisione le cellule tumorali. La metodologia qui presentata delinea le fasi coinvolte nella preparazione delle cellule tumorali cerebrali, nell'esecuzione di iniezioni intracraniche e nell'implementazione di un sistema di monitoraggio post-operatorio per valutare l'attecchimento del tumore cerebrale.

Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

L'obiettivo di questo protocollo è fornire ai ricercatori una tecnica altamente riproducibile per le impianti intracraniche.

Impianto intracranico stereotassico di linee cellulari xenoinnestate derivate dal paziente con glioblastoma nei topi

Impara l'allotrapianto ortotopico intracranico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi per studiare la formazione tumorale secondaria. Questo metodo consente di analizzare i sintomi neurologici e la progressione del tumore in vivo.

Intracranica allotrapianto ortotopico di cellule di medulloblastoma in topi immunocompromessi

Esplora altri video