Name: Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri la rimozione genetica mediata da adenovirus in fibroblasti embrionali di topo primari con allele floxed Rac1. Questo metodo permette l'escissione efficiente del gene per studiare la dinamica dell'actina.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Scott Rizaldy al Mount Sinai Hospital di Toronto per il dono del primario Rac1 flox / flox topo fibroblasti embrionali. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a New Jersey dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP 2009-93526) e Scienze Naturali e Ingegneria Research Council del Canada (NSERC, RG 327372-06). SH e MW sono supportati da CGSMA e CGS-M premi da CIHR e NSERC, rispettivamente. Steve Wills Hawley e Melanie contribuito in maniera uguale a questo articolo.

Celle di scongelamento <ol><li> Ottenere fibroblasti di topo embrioni congelati (MEF) (generato in precedenza da colture di singolo embrione primaria) da azoto liquido. </li><li> Scongelare le cellule immergendo flaconcino in acqua a 37 ° C, rimestando fino a quando i contenuti sono completamente scongelati. </li><li> Aggiungere 9 ml di DMEM che è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina ad una piastra di coltura cellulare 10 centimetri. </li><li> Aggiungere la sospensione cellulare scongelati goccia a goccia alla piastra, il rock delicatamente la piastra per disperdere le cellule e conservare in un CO 37 ° C, 5% 2 incubatore notte. Si noti che se le cellule sono sensibili a DMSO (dal processo di congelamento), i media iniziale può essere sostituita con mezzi freschi dopo che le cellule hanno aderito alla piastra (circa quattro ore dopo la placcatura). Si noti inoltre che la confluenza delle cellule dopo lo scongelamento dipende dal numero di cellule congelate, il tasso di recupero delle cellule dopo il congelamento, e il tasso di crescita delle cellule. </li></ol> Cellule Passaging <ol start="5"><li> Quando le cellule sono cresciuti essenzialmente al 100% di confluenza (cioè il giorno successivo), aspirare al largo della media e lavare le cellule con 5 ml di PBS sterile. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di tripsina contenente 10mM EDTA e conservare in incubatrice per circa 5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dalla piastra. </li><li> Quando le cellule sono staccati, aggiungere 9 ml di supporto alle cellule trypsinized, pipetta 2-3 volte per disperdere i grumi, aggiungere 1 ml di questa sospensione goccia a goccia su un piatto nuovo che contiene 9ml di media, e questo luogo nel 37 ° C durante la notte incubatore . La presenza di FBS nei media si inattivare la tripsina, in alternativa, le cellule possono essere lavati prima di diluire la tripsina. </li></ol> Conteggio e placcatura cellule su vetrini coprioggetto <ol start="8"><li> Rimuovere le cellule da incubatore, lavare e trypsinize come prima, ma questa volta aggiungere 5-6 ml mezzi di comunicazione di nuovo alle cellule trypsinized invece di 9 ml. </li><li> Cellule pipetta a fondo per garantire la completa dissociazione in una sospensione singola cella, e rimuovere 15μL da abbinare a 15μL di tripano blu in una provetta per microcentrifuga separata. </li><li> Mescolare questa cella / trypan sospensione blu pipettando su e giù parecchie volte, e aggiungere 15μL al emocitometro. </li><li> Al microscopio, le cellule morte apparirà blu. Contare il numero di cellule chiare / incolore (vivente) in una delle griglie 4x4 sul emocitometro. Ripetere questa contare su tre griglie altri 4X4 (indicati A, B, C e D) e utilizzare la seguente equazione per calcolare il numero di cellule per ml di sospensione: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq0.jpg" alt="Equazione 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 1"></li><li> Attraverso l'ottimizzazione del protocollo, abbiamo stabilito che placcatura 30.000 risultati cellule della densità cella appropriata per la visualizzazione a conclusione dell'esperimento. </li><li> Per calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per 30.000 celle, utilizzare la seguente equazione: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq1.jpg" alt="Equazione 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 2"></li><li> Ora, mettere un coperchio di vetro sterile scivolare in ciascun pozzetto di un piatto ben sei e aggiungere 2 ml di media per ogni bene, e quindi aggiungere goccia a goccia dalla sospensione cellulare il volume necessario per 30.000 cellule in ciascun pozzetto. Si noti che scivola copertura in vetro vengono utilizzati per questo esperimento come saremo visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza in un punto secondo momento, non tutte le applicazioni saranno necessariamente microscopia, e quindi coprire scivola potrebbe non essere necessario. </li></ol> Trasduzione del virus <ol start="15"><li> Dopo diverse ore o durante la notte (tempo utile per assicurare che le cellule aderiscono al scivola copertina), rimuovere i supporti e lavare le cellule con 1 ml di DMEM senza siero. </li><li> Aggiungere 1 ml di siero-media liberi in ciascun pozzetto per l'aggiunta del virus. Per questo esperimento, Cre adeno-virus è stato ottenuto commercialmente da Biolabs Vector. </li><li> Ottimizzazione del protocollo precedente ha dimostrato che una molteplicità di infezione (MOI) di 500 offre trasduzione del gene altamente efficiente in primari MEF con poco o nessun effetto sulla vitalità cellulare. MOI può essere calcolato come segue: <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq2.jpg" alt="Equazione 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 3"> <img src="/files/ftp_upload/2160/2160eq3.jpg" alt="Equazione 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Equazione 4"></li><li> Aggiungere il volume calcolato di virus direttamente a ogni bene che deve essere infetto, agitare delicatamente la piastra per disperdere le cellule virus e posto in incubatore a 37 ° C durante la notte. </li><li> La mattina successiva, rimuovere il virus contenente i media dalle cellule e lavare le cellule in 1 ml di PBS sterile e poi aggiungere 2 ml di mezzi regolari per ciascun pozzetto. </li><li> Nel caso delle cellule Rac1 esemplificato in questo esperimento, cambiamenti morfologici avvenuti nelle cellule in circa 72 ore di trasduzione del messaggio. </li></ol> Rappresentante Risultati Le cellule sono state visualizzated dalla colorazione con il colorante actina falloidina (per scopi di imaging solo) e ripreso con il TCS-SP5 Leica multiphoton microscopio confocale a scansione laser presso il Centro di analisi avanzata presso l'Università di Guelph. La figura 1 mostra la morfologia contratta e allungata del Rac1 flox / flox cellule che sono state esposte a virus adeno-Cre rispetto alle stesse cellule non esposte al virus. <img src="/files/ftp_upload/2160/2160fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Confronto tra Rac1 flox / flox cellule infettate con virus adeno-Cre (a sinistra) rispetto a cellule non infettate dalla stessa fonte (a destra).

<ol><li>Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Deletion+of+Rac1+GTPase+Reveals+Its+Critical+Role+in+Actin+Stress+Fiber+Formation+and+Focal+Adhesion+Complex+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly.</a> J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).</li>
<li>Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+deletion+in+mouse+neutrophils+has+selective+effects+on+neutrophil+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions.</a> J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).</li>
<li>Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+Cre+deletion+of+floxed+sequences+in+primary+mouse+cells+is+an+efficient+alternative+for+studies+of+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion.</a> Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).</li>
<li>Rijnkels, M., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Cre-mediated+recombination+in+mammary+epithelial+early+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).</li>
<li>Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1-null+mouse+embryonic+fibroblasts+are+motile+and+respond+to+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).</li>
<li>Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+recombination+by+adenovirus-driven+Cre+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus.</a> Genesis. 44, 51-56 (2006).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Consiglio canadese di prodotti per animali.

Il video che accompagna un esempio di come un virus ricombinante può essere usato per accise uno specifico gene in vitro utilizzando Cre ricombinasi. Lo sviluppo di questo protocollo tuttavia ha rivelato alcuni particolari punti vale la pena affrontare. <ul><li> Procedure di sicurezza devono sempre essere impiegato quando si lavora con gli adenovirus. Un camice da laboratorio e guanti devono essere indossati in ogni momento mentre si lavora con il virus. Media e articoli in plastica devono essere trattati con il 10% di candeggina per almeno 30 minuti, e articoli in plastica devono essere sterilizzati in autoclave successivamente. </li><li> Evitare ripetuti di congelamento-scongelamento dello stock del virus come questo può influenzare il titolo del virus e quindi ridurre l&#39;efficienza di trasduzione. Piccoli volumi di magazzino virus dovrebbe inizialmente essere aliquotati in tubi separati. </li><li> MOIS che vanno dal 5-50 sono state testate durante lo sviluppo del metodo e dei tassi di trasduzione efficiente sono stati osservati nella maggior parte dei casi, senza effetti negativi sulla vitalità cellulare. </li><li> Adeno-GFP è stata utilizzata anche durante lo sviluppo del metodo per lo screening rapido l&#39;efficienza di trasduzione. Questo controllo (o un vettore vuoto) deve essere effettuato durante l&#39;esperimento per garantire che l&#39;infezione virale da solo non porta a cambiamenti cellulari. Allo stesso modo, se floxed ablazione del gene di interesse nelle vostre cellule non comportare alcun cambiamento cellulare (ad esempio i cambiamenti nella morfologia e vitalità), quindi infettare lo stesso tipo di cella con adeno-GFP è un controllo importante da utilizzare per dimostrare che la trasduzione del virus è che si verificano. </li></ul> Al di là l&#39;esame della segnalazione cascate nella cultura, l&#39;adeno-Cre approccio è stato utilizzato in vivo per rimuovere condizionalmente geni di animali da esperimento 3,4, e di etichettare specifiche popolazioni di cellule all&#39;interno di un organismo 6. Il sistema di adenovirus può essere adattato anche per introdurre geni diversi da Cre ricombinasi nelle cellule ospiti. Due principali vantaggi dell&#39;utilizzo di questo vettore di consegna sono di trasduzione del suo alto rendimento e la consegna del gene, e la mancanza di integrazione con il DNA ospite. Tuttavia, la generazione di nuovi adenovirus ricombinante può essere laborioso. Il protocollo qui descritto sfrutta quindi la potenza del sistema adenovirale sfruttando l&#39;precedentemente sviluppato Cre adeno-virus, e giunto che con il nostro allele floxed di interesse, Rac1. Attraverso questo bussare condizionale fuori esperimento, abbiamo confermato che trasduzione con il virus adeno-Cre di MEF portando un allele floxed Rac1 effettivamente causa asportazione di Rac1 portare ai cambiamenti nella caratteristica morfologia cellulare di Rac1-deficienti cellule 2,5.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-Cre virus</td><td>Vector Biolabs</td><td>1045</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo DME ad alto contenuto di glucosio 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td></td></tr><tr><td>FBS origine canadese 500 mL</td><td>VWR international</td><td>CAA15-701</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione PEN-STREP 1X 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td></td></tr></tbody></table>

adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

La possibilità di rimuovere geneticamente componenti specifici delle varie cascate segnalazione cellulare è stato uno strumento integrato per l&#39;analisi moderna di trasduzione del segnale. Un particolare metodo per raggiungere questo obiettivo la cancellazione condizionale è attraverso l&#39;uso del Cre-loxP sistema. Questo metodo comporta che fiancheggiano il gene di interesse con i siti loxP, che sono sequenze di riconoscimento specifico per la proteina ricombinasi Cre. Esposizione del cosiddetto floxed (affiancato da sito loxP) DNA a questo risultato in un enzima Cre-mediata evento di ricombinazione nei siti loxP, e conseguente asportazione del gene intervenire 3. Esistono diversi metodi per amministrare Cre ricombinasi al sito di interesse. In questo video, che illustrano l&#39;utilizzo di un adenovirus contenente il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti embrionali del mouse primario (MEF) ottenute da embrioni contenenti un floxed Rac1 allele 1. La nostra logica per la selezione Rac1 MEF per i nostri esperimenti è chiaro che i cambiamenti morfologici possono essere visti su cancellazione di Rac1, a causa di alterazioni del citoscheletro di actina 2,5. 72 ore dopo la trasduzione virale ed espressione Cre, le cellule sono state colorate con il colorante falloidina actina e ripreso utilizzando la microscopia confocale a scansione laser. È stato osservato che MEF che erano stati esposti al virus adeno-Cre apparsa contratta e allungata nella morfologia rispetto alle cellule non infette, in coerenza con le relazioni precedenti 2,5. Il metodo di consegna adenovirus Cre ricombinasi è vantaggioso come il Cre adeno-virus è facilmente disponibile, e l&#39;eliminazione del gene via Cre in quasi il 100% delle cellule può essere realizzato con ottimizzati infezione adenovirale.

In questo video possiamo utilizzare un adenovirus che trasportano il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti di topo primario embrionale porta un allele floxed Rac1.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

La capacità di rimuovere geneticamente componenti specifici di varie cascate di segnalazione cellulare è stata uno strumento essenziale nella moderna trasduzione del segnale...

L'analisi genetica moderna si basa in larga misura su tecniche che consentono la rimozione mirata di geni specifici da cellule, organi o interi organismi. Questi esperimenti di knockout aiutano a rivelare la funzione del gene nel suo contesto cellulare. I fenotipi molecolari, morfologici e fisiologici del knockout forniscono tutti indizi sul ruolo dei prodotti genici codificati dalla sequenza eliminata.In organismi modello come i topi, un metodo comune per ottenere un'interruzione genica condizionale consiste nel delimitare il gene o l'esone di interesse con siti loxP, che fungono da sequenze riconoscibili dall'enzima Cre ricombinasi. L'escissione irreversibile dell'allele cosiddetto floxed è quindi catalizzata da Cre, eliminando così la sequenza dal genoma. Esistono diversi metodi per introdurre la Cre ricombinasi nel sistema, inclusi quelli eseguiti in vivo e quelli che agiscono direttamente su cellule già stabilite.Per questa particolare applicazione, utilizzeremo un adenovirus per veicolare Cree in cellule di fibroblasti isolate e coltivate da un topo transgenico portatore di un allele flock. Questo metodo consente un'efficienza di trasferimento del transgene quasi del 100%. Quando il virus viene somministrato alle cellule, viene internalizzato all'interno di una vescicola endocitica e trasportato all'involucro nucleare, dove il suo DNA, incluso il transgene di interesse, può penetrare nel nucleo attraverso il complesso poroso.Il macchinario cellulare può quindi trascrivere il gene iniettato e permettere ai suoi prodotti proteici di agire sulla cellula. In questo caso, l'enzima Cre Recombinase codificato dal virus rimuove l'allele floxed dal genoma della cellula ospite. Proveniamo dal Jones Lab presso l'Università di Guelph a Guelph, Ontario, Canada.Nel nostro laboratorio, siamo interessati al concetto di trasduzione del segnale e a ciò che accade quando si rimuovono componenti specifici di diverse cascate di trasduzione del segnale. Oggi analizzeremo una cascata legata all'organizzazione dell'actina. La trasduzione del segnale avviene grazie a una serie di componenti biochimici che trasmettono informazioni ed elicitano cambiamenti fenotipici, come il riorganizzarsi dell'actina.La nostra proteina di interesse è RAC uno, una piccola gtpasi che svolge un ruolo importante nella regolazione della dinamica dell'actina, inclusa l'adesione cellulare, la migrazione e la morfologia. In questo studio, utilizzeremo il sistema CRE LAX P per eliminare questo gene e confermarne il ruolo nella cellula. In precedenza, cellule fibroblastiche provenienti da topi embrionali con un allele di rack flogato, uno, erano state isolate 12 giorni dopo la fecondazione.Queste cellule sono state quindi poste in azoto liquido per la conservazione a lungo termine, e inizieremo scongelando una singola provetta di queste cellule rappresentante un singolo embrione. Quando si eseguono esperimenti di coltura cellulare, è fondamentale mantenere un ambiente sterile. Ciò richiede la pulizia delle superfici esposte di un'appaio biologico certificato, nonché la nebulizzazione con etanolo al 70% di tutte le bottiglie di reagenti e dell'attrezzatura di laboratorio che entrano nell'appaio.Dopo aver preparato l'incubatore a flusso laminare, scongelare le cellule immergendo la provetta in un becher contenente acqua a 37 gradi Celsius fino a quando il contenuto non diventa liquido. Successivamente, sterilizzare la provetta con etanolo al 70% e quindi aggiungere la sospensione cellulare, goccia a goccia, in una piastra da 10 centimetri contenente nove millilitri di DMEM, un mezzo con alto contenuto di glucosio integrato con siero fetale bovino al 10% e penicillina all'1%.Streptomycin agitare delicatamente la piastra per disperdere le cellule e posizionarla nell'incubatrice a 37 gradi con 5%CO2, ricordandosi di etichettare la piastra con le informazioni appropriate. Le cellule raggiungono tipicamente una confluenza del 100% entro 24 ore. A questo punto, possiamo passare le cellule su una nuova piastra.Per fare ciò, iniziare aspirando il vecchio terreno. Aggiungere cinque millilitri di PBS sterile per risciacquare le cellule, quindi rimuoverlo anch'esso. Aggiungere ora un millilitro di tripsina contenente EDTA 10 millimolare.Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi per circa cinque minuti, in modo che le cellule si stacchino dal substrato. Tornare nell'ambiente a flusso laminare e aggiungere nuovamente nove millilitri di mezzo alla piastra trattata con tripsina, diluendo così le cellule di uno a dieci; pipettare il liquido su e giù diverse volte per rompere gli aggregati cellulari, quindi prelevare un millilitro della sospensione e aggiungerlo goccia a goccia a nove millilitri di mezzo fresco in una nuova piastra da 10 centimetri. Agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule e posizionarla nuovamente nell'incubatrice a 37 gradi.Quando le cellule hanno raggiunto la confluenza, il passaggio successivo consiste nel seminarle su coprivetri in modo che possano essere osservate mediante microscopia. Preparare le cellule utilizzando la stessa tecnica impiegata per il confezionamento, fino all'aggiunta dei trips all'interno delle cellule e al posizionamento nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Mentre le cellule si staccano dalla piastra, preparare una piastra a sei pozzetti con coprivetri, utilizzando un coprivetro autoclavato per ogni pozzetto.Una volta che le cellule si sono staccate dalla piastra, aggiungere nuovamente dai cinque ai sei mil di mezzo alle cellule trypsinizzate. Nella fase successiva dell'esperimento verranno effettuati conteggi cellulari in modo da seminare un numero appropriato di cellule per un'efficiente infezione virale. Per contare le cellule, combinare 15 microlitri di campione con una pari quantità di tripan blu, pipettare su e giù per mescolare ed aggiungere 15 microlitri di questa soluzione all'emocitometro.Le cellule morte appariranno blu. Con questa preparazione, contare solo le cellule vive o incolori sulla griglia quattro per quattro per calcolare il numero di cellule per microlitro. Iniziare contando le cellule in quattro griglie separate, da A a D, e calcolando la media. Successivamente moltiplicare questo valore per due per tenere conto della diluizione nel trian blu.Poiché la griglia contiene un decimo di microlitro, moltiplicare per 10 per esprimere il valore come numero di cellule per microlitro. Successivamente, determinare il volume richiesto dividendo il numero desiderato di cellule per la concentrazione cellulare calcolata in precedenza. Aggiungere il volume calcolato della sospensione cellulare, goccia a goccia, in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.Lasciare queste cellule nell'incubatrice a 37 gradi durante la notte. Il giorno seguente, il virus verrà aggiunto alle cellule. Il virus della den creek ottenuto da Vector B labs è stato aliquotato e conservato a meno 80 gradi Celsius.Recuperare questo virus e riportarlo nell'ambiente sterile del flow hood. Rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatore e portarla nel hood. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con un millilitro di DMEM privo di siero.Ora aggiungere un mil di mezzo privo di siero in ogni pozzetto per l'aggiunta del virus. Per l'applicazione virale, utilizziamo una molteplicità di infezione o MOI di 500. L'ottimizzazione del protocollo è stata precedentemente condotta utilizzando diverse MOI e abbiamo riscontrato che un valore di MOI di 500 garantisce tassi di infezione altamente efficienti con scarsi o nulli effetti sulla vitalità cellulare.Per calcolare il MOI, utilizzare l'equazione seguente. Iniziare calcolando il numero di virus necessari, moltiplicando il MOI target, in questo caso 500, per il numero di cellule per pozzetto, ovvero 30.000; per determinare il volume della soluzione virale da utilizzare, moltiplicare il numero di virus per 1000 e dividere il risultato per la concentrazione iniziale del virus. In questo caso, verranno aggiunti 1,5 microlitri di soluzione virale in ciascun pozzetto da infettare.Agitare delicatamente la piastra per disperdere il virus e posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi durante la notte. La mattina seguente, rimuovere il mezzo virale dalle cellule, lavare con PBS e aggiungere due millilitri di mezzo normale alle cellule. In questo esperimento, abbiamo osservato che i cambiamenti fenotipici si sono verificati nelle cellule in circa 72 ore.Le cellule colorate utilizzando il colorante Acton sono state analizzate mediante il microscopio confocale a scansione laser a cinque fotoni Leica T-C-S-S-P presso il centro di analisi avanzate dell'Università di Guelph. Questo ha rivelato cambiamenti nella morfologia tra cellule infette e non infette. Quelle prive di RAC uno appaiono allungate e sottili rispetto alle cellule larghe e appiattite che non erano infette.Abbiamo dimostrato che il sistema ADOC crease è un metodo robusto per il trasferimento genico efficiente in cellule, estendendosi oltre lo studio della trasduzione del segnale. Tuttavia, è possibile utilizzare questo metodo anche per eliminare geni in animali sperimentali o forse per etichettare popolazioni cellulari specifiche in un organismo. Il sistema dell'adenovirus può inoltre essere impiegato per introdurre nel principio geni diversi da Cree.I vantaggi dell'utilizzo di questo metodo di somministrazione includono l'elevata affettività, l'efficienza e l'assenza di integrazione con il DNA della cellula ospite. Tuttavia, la generazione di adenovirus comuni può richiedere molto lavoro. Il protocollo descritto qui sfrutta quindi la potenza del sistema adenovirale utilizzando il virus ocre precedentemente sviluppato con il nostro RAC flocato uno mes attraverso questo knockout condizionale, abbiamo dimostrato che.Pertanto, la morfologia dipende in effetti in parte dalla piccola GTPasi RAC1. In conclusione, noi del Jones Lab desideriamo semplicemente ringraziarvi per aver guardato il nostro video e vi auguriamo buona fortuna in tutte le vostre future ricerche.

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