Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia
28 agosto 2010
Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto Ex vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.
In biologia dello sviluppo, esistono diversi animali utilizzati per gli esperimenti. La tecnica agricola hawaiana di rotazione degli embrioni è stata sviluppata negli anni '50 e perfezionata prima dell'introduzione delle moderne tecniche di manipolazione genetica in agricoltura. Il metodo permette di indirizzare direttamente geni inattivati o di trasfettare geni in specifiche aree di interesse, poiché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio; pertanto, la coltura completa dell'embrione rappresenta uno strumento estremamente utile.
Quando vogliamo studiare il processo dinamico di sviluppo degli embrioni di maorian dopo lo sviluppo post-impianto, la crescita degli embrioni di maorian dipende criticamente dal presentatore funzionale, il che limita il periodo di coltura. In generale, possiamo coltivare gli embrioni nel periodo compreso tra il giorno embrionale 8,5 e 14,5 nel ratto, e tra E 6,5 ed E 12,5 nel topo.
In laboratorio, coltiviamo embrioni di ratto e di topo utilizzando un sistema di coltura rotante. Questo sistema di coltura è il più diffuso e adatto per la coltura di embrioni di ratto e di topo durante la fase iniziale della gestazione, ovvero dopo il giorno E 11,5 nei ratti e il giorno 9,5 nei topi.
In questo video, desideriamo presentare il nostro protocollo standard per la coltura in condizioni di digiuno utilizzando embrioni RU E12.5. In queste condizioni, l'embrione può essere coltivato per due giorni, un periodo sufficiente per esaminare le diverse manipolazioni efficaci nell'agricoltura orizzontale. Esistono due passaggi critici per il successo.
Prima di tutto, la procedura di dissezione deve essere precisa per non danneggiare l'embrione, in particolare i vasi rod. In secondo luogo, la procedura deve essere il più rapida possibile. Questo vale soprattutto per gli embrioni più anziani.
Ad esempio, nel caso di embrioni di topo a 10,5 giorni post-coito, questi devono essere trasferiti entro 30 minuti. Abbiamo applicato la tecnica di coltura di embrioni interi per analizzare sei embrioni mutanti. Ad esempio, analizziamo il modello di migrazione delle cellule neurocristiche nel mutante marcando un piccolo numero di cellule con un colorante o trapiantando cellule embrionali in embrioni di tipo selvatico con sfondo mutato.
Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo di trasferimento genico in embrioni di topo e di pesce rosso coltivati mediante elettroporazione, che utilizza una scossa elettrica. Possiamo introdurre semplicemente costrutti di geni esogeni, forme dominanti negative e siRNA nelle aree del cervello in via di sviluppo. Pertanto, possiamo analizzare facilmente le funzioni geniche mediante esperimenti di perdita di funzione e di acquisizione di funzione.
Studiamo inoltre il comportamento di cellule marcate con GFP o RFP utilizzando colture organotipiche o colture di slice, successive all'agricoltura. Pertanto, è possibile eseguire una varietà di esperimenti combinando la coltura Lio con altre tecniche.
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Panoramica
Questo protocollo video illustra la tecnica di coltura dell'embrione intero per embrioni di ratto dopo E12.5, utilizzando un sistema di coltura in bottiglia di tipo rotante. Questo metodo consente la coltura ex vivo durante le fasi critiche della metà della gestazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
- Tecniche di coltura ex vivo
Sfondo
- La tecnica di coltura dell'embrione intero è stata sviluppata fin dagli anni '50.
- Permette la manipolazione degli embrioni per studi genetici.
- Gli embrioni possono essere coltivati durante specifici periodi di sviluppo.
- La crescita dipende dalla presenza funzionale dell'embrione.
Scopo dello studio
- Studiare i processi dinamici di sviluppo degli embrioni dopo l’impianto.
- Fornire una procedura standardizzata per la coltura di embrioni interi.
- Facilitare la ricerca in biologia dello sviluppo.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di coltura di embrioni interi
- Sistema di coltura in bottiglia di tipo rotante
- Condizioni ex vivo per embrioni di ratto
- Periodi di coltura dal giorno embrionale 8,5 al 14,5
Risultati principali
- Coltura riuscita di embrioni di ratto dopo E12,5.
- Dimostrazione di procedure standard per la manipolazione degli embrioni.
- Conoscenze sui periodi critici di crescita degli embrioni.
- Stabilimento di un metodo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- La tecnica di coltura dell'embrione intero è uno strumento prezioso nella biologia dello sviluppo.
- Consente lo studio dello sviluppo embrionale in condizioni controllate.
- Metodi standardizzati migliorano la riproducibilità nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sistema di coltura dell'embrione intero di tipo rotante consente la manipolazione diretta e l'osservazione di embrioni di roditore durante le fasi critiche della metà della gestazione, supportando la riduzione dei rischi meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Questa piattaforma ex vivo permette interventi genetici e cellulari precisi, facilitando la validazione funzionale dei bersagli e l'analisi dei percorsi prima degli studi in vivo. La sua riproducibilità e adattabilità lo rendono una risorsa preziosa per la ricerca traslazionale e la selezione del portafoglio nella modellizzazione dello sviluppo e delle malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Target
- Permette una manipolazione genetica o cellulare diretta per la validazione funzionale di bersagli in embrioni di mammifero.
- Consente la riduzione del rischio meccanicistico permettendo studi di perdita e guadagno di funzione in un sistema controllato ex vivo.
- Facilita la chiarificazione dei percorsi molecolari e la verifica di ipotesi in punti critici dell'inflessione dello sviluppo.
- Fornisce una piattaforma per valutare l'impatto di interventi candidati sullo sviluppo embrionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi embrionali validati e manipolabili per analisi fenotipiche successive o saggi meccanicistici.
- Consente una valutazione riproducibile e quantitativa degli esiti dello sviluppo dopo perturbazioni genetiche o chimiche.
- Permette la standardizzazione e la scalabilità dei saggi per studi comparativi tra diversi genotipi o interventi.
- Consente una valutazione affidabile della funzione di composti o geni in un contesto fisiologicamente rilevante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a stadi dello sviluppo pertinenti alla patologia per modellare disturbi congeniti o la funzione genica.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, permettendo studi meccanicistici su embrioni integri.
- Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio, chiarendo precocemente nel processo le criticità legate allo sviluppo.
- Facilita la scoperta e la validazione di biomarcatori in un sistema controllabile e manipolabile.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema WEC di tipo rotante collega la fase iniziale della scoperta alla ricerca preclinica, consentendo manipolazioni guidate da ipotesi e analisi quantitative dello sviluppo embrionale. Posizionato tra saggi in vitro e modelli in vivo, offre una piattaforma unica per studi meccanicistici e la riduzione del rischio associato ai bersagli.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante interventi genetici o cellulari diretti.
- Screening: Fornisce sistemi embrionali pronti per saggi e riproducibili per letture fenotipiche quantitative.
- Analisi: Permette la misurazione di esiti nello sviluppo, nella migrazione o a livello molecolare per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega le prime scoperte meccanicistiche alla modellizzazione preclinica delle malattie e alla validazione di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e adattabile per un uso ripetuto in diversi programmi di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle target.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro ex vivo standardizzati, riproducibili e scalabili per studi di sviluppo.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale chiarificando precocemente i rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset nella fase di scoperta, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in embriologia, microdissezione e tecniche di manipolazione ex vivo.
- Necessita di strumentazione specializzata per colture in bottiglia con agitazione rotatoria e di infrastrutture microscopiche adeguate.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e confrontabilità dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse ceppi di roditori o stadi di sviluppo.
- Il periodo di coltura è limitato dalla dipendenza dell'embrione dalla funzione placentaria, il che restringe la finestra di analisi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
