Name: Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Impara la tecnica di coltura di embrioni interi di ratto dopo E12.5 utilizzando un sistema di coltura rotante. Questo metodo consente di studiare i processi di sviluppo embrionale in condizioni controllate ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Sig. Hajime Ichijo per la video-registrazione e consigli utili per l&#39;editing del video. Ringraziamo anche Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki per gentile assistente per il video-registrazione. Questo lavoro è supportato da KAKENHI su B per giovani scienziati e di priorità Aree-Molecular Brain Science da MEXT del Giappone. Riconosciamo l&#39;appoggio di Global COE Program &quot;Centro di ricerca di base e traslazionale per la scienza del cervello globale&quot; da MEXT del Giappone e il Nucleo di Ricerca per la Scienza e la Tecnologia evolutiva (CREST) ​​da Science e Technology Corporation giapponese di scienza giapponese e Technology Agency (JST) .

1. Impostazione del sistema WEC <ol><li> Misto una membrana di 0,22 micron filtro per il tubo di silicone di ingresso all'interno del sistema WEC a). </li><li> Aprire la valvola di una bombola di gas contenente O 2 (95%) e CO 2 (5%). Flusso della miscela di gas nel tamburo attraverso la bottiglia contenente acqua bolle autoclave. </li><li> Regolare il volume del flusso di miscela di gas a 50 cc. </li><li> Inserire il tubo in silicone da lasciare in una bottiglia d'acqua e controllare il flusso di miscela di gas. </li><li> Ruotare il tamburo alla velocità di 20 giri / min. </li></ol> 2. Preparazione del terreno di coltura <ol><li> Rat-disgelo immediatamente centrifugati (IC) di siero a 37,0 ° C b). Aggiungi D-glucosio (2 mg / ml) nel siero scongelati in un autoclave becher da 100 ml. Terreno di coltura devono essere preparati a livello di cultura principale (ad esempio, con un cappuccio). </li><li> Aggiungi antibiotico-antimicotico (100X) liquidi al siero con 1: 400 di diluizione. </li><li> Vaporizzare isoflurano rimanenti (a causa di anestesia dei ratti durante la raccolta del sangue) dal siero per 20 minuti a temperatura ambiente (RT), c). </li><li> Sterilizzare il terreno di coltura utilizzando un filtro a membrana 0,45 micron. </li><li> Versare 3,0 ml del mezzo in ogni bottiglia cultura e sigillare la parte superiore di ogni bottiglia con un tappo in silicone, coperto con un foglio di alluminio (vedi rif. 14) d). </li><li> Preparare tre o quattro piastre di Petri contenenti disposizione e saline di Tyrode). </li></ol> 3. Anestesia del ratto e l'isolamento dell 'utero <ol><li> Anestetizzare un tempo in gravidanza ratto profondamente con anestetici inalatori o parenterale. </li><li> Pulire la zona addominale del ratto anestetizzato incinta con il 70% di etanolo. </li><li> Raccogliete la pelle con una pinza e esteriorizzare la parete addominale per tagliare la pelle con grandi forbici f). </li><li> Raccogliete la parete addominale con un paio di pinze e fare incisioni di grandi dimensioni a forma di U longitudinale sulla parete addominale con le forbici di grandi dimensioni fino al livello toracico g). </li><li> Poggiare l'intestino sul lato sinistro con un paio di pinze ed esporre un capo dell'utero collegato l'ovaio. </li><li> Pick up alla fine del utero con un paio di pinze e tagliare la posizione tra l'utero e le ovaie con le forbici grandi. </li><li> Togliere l'utero dal ratto in gravidanza, tagliando il grasso intorno dell'utero fino alla fine altri dell'utero. </li><li> Trasferimento nell'utero di una piastra di Petri contenente soluzione salina Tyrode è. </li><li> Euthanize il ratto dalla somministrazione eccessiva di anestetico o dislocazione cervicale dopo aver rimosso l'utero. </li></ol> 4. Rimozione di embrioni dall'utero <ol><li> Sciacquare brevemente l'utero in soluzione salina Tyrode e trasferimento al secondo piatto di Petri con un paio di belle pinze h). </li><li> Sotto un microscopio binoculare, prendere la parete uterina, con un paio di pinze sottili e tagliare la parete uterina al lato opposto al mesometrium di collegamento con i vasi sanguigni con le forbici oftalmica dritto. </li><li> Inserire la punta di forbici oftalmica direttamente nello spazio tra la parete uterina e decidua. Tagliare la parete uterina longitudinalmente lungo il lato antimesometrial. </li><li> Clump la decidua a lato mesometrial e conceptuses separato dall'utero utilizzano due coppie di pinze bene i). </li><li> Trasferimento conceptuses al piatto terza Petri con una pipetta di vetro sterilizzati con un diametro adeguato. </li></ol> 5. Dissezione di embrioni di ratto <ol><li> Inserire una punta del microforceps nella decidua e fare una incisione trasversale sul decidua intorno al concepito con due coppie di pinze. </li><li> Inserire le punte della pinza nella decidua a lato placentare e fare due incisioni longitudinali sulle decidua verso l'alto. </li><li> Rimuovere la decidua a lato placentare di ripping che con due coppie di pinze. Rimuovere il restante decidua con due coppie di pinze. </li><li> Pick up membrana Reichert, fare un taglio orizzontale su di esso, e separare la membrana dalla concepimento al anti-placentare lato. </li><li> Fai un piccolo foro sul sacco vitellino vicino alla testa di un embrione con le due coppie di pinze, e tagliare il sacco vitellino con un paio di forbici curve oftalmico. E 'importante per non danneggiare i vasi sanguigni principali. </li><li> Sollevare il amnios presso il sito intorno alla testa di un embrione con le due coppie di una pinza sottile e delicatamente estrarre l'embrione del sacco vitellino strappando l'h amnios). Il corpo dell'embrione deve essere tirato fuori il sacco vitellino per aumentare l'apporto di ossigeno per l'embrione nella fase midgestation. </li></ol> 6. Embrione intera cultura <ol><li> Verificare danni sulla placenta, sacco vitellino, e la condizione di battere il cuore e la circolazione sanguigna. </li><li> Essere consapevoli di non estende il cordone ombelicale, il trasferimentol'embrione di una bottiglia di cultura con una pipetta di vetro sterilizzati. Riporto di soluzione salina Tyrode di bottiglie di cultura dovrebbe essere il meno possibile. </li><li> Rimuovere un non-foro spina silicio dalla tamburo dei rotatori. Collegare la bombola di cultura con una spina con un buco al tamburo dei rotatori del sistema WEC perpendicolarmente. Fare attenzione a non mettere vigore il tamburo in direzioni non adatti poiché il tamburo dei rotatori è un apparecchio molto fine. Le bottiglie contenenti l'embrione sezionato vengono trasferiti alla cultura uno per uno, l'apertura della porta d'ingresso del incubatore dovrebbe essere ridotto al minimo per evitare la temperatura dell'incubatore è diminuita j). </li><li> Dopo 10 ore di cultura, di aumentare il volume del flusso di miscela di gas fino a 75 cc e fino a 100 cc dopo 24 ore (Tabella 1). </li><li> Il terreno di coltura deve essere cambiato circa 24 ore con il trasferimento dell'embrione in coltura in una bottiglia nuova cultura di media preparati al momento. Aumentare il volume del flusso massimo di 125 cc dopo 34 hr e un massimo di 150 cc, dopo 48 ore (Tabella 1) </li><li> Di tanto in tanto controllare lo stato degli embrioni coltivati ​​contando tasso di battito cardiaco (cioè, 120-150/min è ottimale) e osservando la circolazione sanguigna. Se necessario contare il numero di somiti per giudicare la crescita di embrioni in soluzione salina di Tyrode. Nello sviluppo normale, uno somite si aggiunge in due ore. </li><li> Quando WEC è finito, stop fornitura di miscela di gas e staccare il tubo di ingresso e la membrana del filtro al fine di evitare il riflusso nel tubo di aspirazione dalla bottiglia bubbling. </li></ol> 7. Note <ol class="lalpha"><li> La temperatura all'interno del sistema WEC è costantemente mantenuto a 37,0-37,5 ° C. </li><li> 100% ratto IC siero viene solitamente usata nei nostri WEC di embrioni di ratto e nel topo, e conservati a -20 ° C prima dell'uso. </li><li> Acquistiamo ratto IC siero, che sono raccolti da ratti che sono anestetizzati con isoflurano. </li><li> Bottiglie usa e getta sono disponibili anche presso Ikemoto Rika. Bottiglie e tappi in silicone devono essere sterilizzati in autoclave. </li><li> Dissezione di embrioni deve essere eseguita a temperatura ambiente per il mantenimento degli embrioni a bassa o alta temperatura durante la dissezione influenzare lo sviluppo successivo in WEC. </li><li> Strumenti per la dissezione vengono sterilizzati con calore secco. </li><li> La pelle e la parete addominale dovrebbero essere tagliati separatamente per evitare contaminazioni di peli in un piatto il più possibile. Cambiamo un paio di forbici di grandi dimensioni e pinze con un nuovo paio di loro quando abbiamo tagliato la pelle e isolare l'utero, rispettivamente. </li><li> Utilizzando pinze le cui punte vanno bene è molto importante per sezionare tessuti certamente. Noi manualmente affilare le punte delle pinze con una pietra e l'olio della macchina. </li><li> Noi utilizziamo un lato della pinza come un coltello per evitare una pressione eccessiva agli embrioni. </li><li> Quando la temperatura all'interno del sistema WEC diminuisce con l'apertura della porta ripetutamente, continuiamo ad accendere la luce per mantenere la temperatura all'interno del sistema. </li></ol> 8. Rappresentante risultati La figura 1 mostra le procedure di dissezione dell'embrione ratto e gli embrioni di ratto in coltura. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Coltura degli embrioni intero dell'embrione E12.5 ratto. (A) concepito sezionato dall'utero del ratto in gravidanza. (B) Rimozione della decidua a lato placenta. (C) Rimozione di membrana di Reichert. (D) L'apertura del sacco vitellino. (E) La coltura degli embrioni di ratto in bottiglia per 6 ore dopo l'inizio del WEC. (F) L'embrione di ratto in coltura per 42 ore. d, decidua, R; membrana di Reichert, p, placenta, ys, sacco vitellino, e, embrione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 ore </td><td> 12 ore </td><td> 24 ore </td><td> 36 ore </td><td> 48 ore </td></tr><tr><td> E12.5 ratto embrione </td><td> 95% 50 cc </td><td> 95% 75 cc (10 hr) </td><td> 95% da 100 cc </td><td> 95% di 125 cc (34 ore) </td><td> 95% 150 cc </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Condizioni ottimali di ossigeno.

<ol><li>New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNew%2C+DAT+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).</li>
<li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).</li>
<li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postimplantation+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Essential+Developmental+Biology+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , IRL Press. Oxford. 55-66 (1993).</li>
<li>Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujinaga%2C+M+%22Developmental+Biology+Protocols%22">Developmental Biology Protocols</a>. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).</li>
<li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Genet.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li>
<li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li>
<li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li>
<li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li>
<li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li>
<li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6%3A%3AEGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li>
<li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens%2C+but+does+not+arrest%2C+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li>
<li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li>
<li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Fabp7%2C+a+downstream+gene+of+Pax6%2C+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li>
<li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono due passaggi critici nel WEC roditori per il successo. In primo luogo, la procedura di dissezione dovrebbe essere accurato per non danneggiare gli embrioni, soprattutto vasi sanguigni. In secondo luogo, la procedura dovrebbe essere il più rapidamente possibile, perché l&#39;ossigeno e nutrienti non sono più forniti attraverso la placenta dopo l&#39;isolamento dall&#39;utero. Questo è fondamentale per i vecchi embrioni. Nel caso del WEC ratto dopo E12.5, dovremmo trasferire embrioni sezionati in bottiglie di cult...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td colspan="5"> Impostazione WEC </td></tr><tr><td> WEC sistema (10-0310) </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-0310 </td><td> Un altro piccolo modello è inoltre disponibile. </td></tr><tr><td> Tappo in silicone senza foro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> Miscela di gas cilindro </td><td> Strumento </td><td> Nikko Sanso </td><td> - </td><td> Contenente 95% di ossigeno e di anidride carbonica del 5%. Ordine personalizzato. </td></tr><tr><td> Regolatore del gas </td><td> Strumento </td><td> Ono Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micron filtro Millex GS </td><td> Strumento </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Anestesia e isolamento dell&#39;utero </td></tr><tr><td> Forbici di grandi dimensioni </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> Piatto disposizione Petri (90 mm x 15 mm) </td><td> Strumento </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> Profonda di tipo piatto è la migliore per la dissezione. </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Reagente </td><td> Abbott </td><td> B506 </td><td> Per l&#39;anestesia </td></tr><tr><td> Di sodio pentobarbital </td><td> Reagente </td><td> Schering-Plough Animal Health </td><td> - </td><td> Per l&#39;anestesia </td></tr><tr><td> Tyrode della salina </td><td> Reagente </td><td> - </td><td> - </td><td> Secondo il protocollo di rif. 2. Salva a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Cronometrato in gravidanza ratto Sprague-Dawley </td><td> Animale </td><td> Fiumi Charles Laboratori Giappone </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Preparazione del terreno di coltura </td></tr><tr><td> Cultura bottiglia di vetro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> Smaltimento cultura bottiglia </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> Tappo in silicone con foro </td><td> Strumento </td><td> Ikemoto Rika </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Foglio di alluminio </td><td> Strumento </td><td> Ogni azienda </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> Per le bottiglie di cultura </td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-14A </td><td> Per i tappi di silicone </td></tr><tr><td> 0,45 micron filtro Millex HA </td><td> Strumento </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubo conico </td><td> Strumento </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Bicchiere da 100 ml </td><td> Strumento </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> Rat IC siero </td><td> Reagente </td><td> Fiumi Charles Laboratori Giappone </td><td> - </td><td> Si riferiscono a: Sig. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosio </td><td> Reagente </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotico-antimyotic liquido </td><td> Reagente </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissezione di embrioni </td></tr><tr><td> Forbici oftalmica dritto </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> Per il taglio della parete uterina </td></tr><tr><td> Forbici curve oftalmica </td><td> Strumento </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> Per il taglio del sacco vitellino </td></tr><tr><td> Pinza # 5 </td&gt; <td> Strumento </td><td> Vigore </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza # 5F </td><td> Strumento </td><td> Regine </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetta di vetro </td><td> Strumento </td><td> - </td><td> - </td><td> Fatti a mano utilizzando pipetta Pasteur. </td></tr><tr><td> Sacchetto in autoclave </td><td> Strumento </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> Per pipette in vetro </td></tr><tr><td> Microscopio binoculare </td><td> Strumento </td><td> Leica </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> Luce </td><td> Strumento </td><td> Leica </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> Olio di pietra </td><td> Strumento </td><td> Uchida Yoko </td><td> 833-2000 </td><td> Per l&#39;affilatura di forcipe </td></tr><tr><td> Olio per macchine </td><td> Strumento </td><td> Uchida Yoko </td><td> 835-0000 </td><td> Per l&#39;affilatura di forcipe </td></tr></tbody></table>

il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il rotator tipo di sistema cultura bottiglia

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Intera coltura degli embrioni (WEC), la tecnica è stata sviluppata nel 1950 da New e dei suoi colleghi, e applicato per la biologia dello sviluppo 1. Anche se lo sviluppo e la crescita di embrioni di mammifero sono criticamente dipendente dal funzionamento della placenta, WEC tecnica ci permette di topo cultura e di embrioni di ratto condizione di ex-vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation durante il giorno embrionale (E) 6,5 E12.5 nel mouse o E8.5-E14.5 nel ratto 2, 3, 4. In WEC, possiamo direttamente target desiderato aree di embrioni con fini di vetro capillari, perché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio. Pertanto, WEC roditore è una tecnica molto utile quando si vogliono studiare i processi di sviluppo dinamico di postimplanted embrioni di mammifero. Fino ad oggi, diversi tipi di sistemi sono stati sviluppati WEC 1. Tra questi, il rotore di tipo sistema di coltura bottiglia è più popolare e adatto a lungo termine cultura di embrioni a midgestation, cioè dopo la E9.5 e E11.5 nel topo e ratto, rispettivamente 1. In questo protocollo video, dimostriamo il nostro procedure standard del WEC ratto dopo E12.5 utilizzando un modello raffinato del sistema originale dei rotatori, che è stato progettato per nuovi e di Cockroft 5, 6, e introdurre le varie applicazioni della tecnica WEC per gli studi di sviluppo dei mammiferi biologia.

Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto<em&gt; Ex vivo</emCondizione&gt; durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

La tecnica di coltura dell'embrione intero (WEC) è stata sviluppata negli anni '50 da New e dai suoi colleghi ed è stata applicata alla biologia dello sviluppo 1. Sebbene lo sviluppo ...

In biologia dello sviluppo, esistono diversi animali utilizzati per gli esperimenti. La tecnica agricola hawaiana di rotazione degli embrioni è stata sviluppata negli anni '50 e perfezionata prima dell'introduzione delle moderne tecniche di manipolazione genetica in agricoltura. Il metodo permette di indirizzare direttamente geni inattivati o di trasfettare geni in specifiche aree di interesse, poiché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio; pertanto, la coltura completa dell'embrione rappresenta uno strumento estremamente utile.Quando vogliamo studiare il processo dinamico di sviluppo degli embrioni di maorian dopo lo sviluppo post-impianto, la crescita degli embrioni di maorian dipende criticamente dal presentatore funzionale, il che limita il periodo di coltura. In generale, possiamo coltivare gli embrioni nel periodo compreso tra il giorno embrionale 8,5 e 14,5 nel ratto, e tra E 6,5 ed E 12,5 nel topo.In laboratorio, coltiviamo embrioni di ratto e di topo utilizzando un sistema di coltura rotante. Questo sistema di coltura è il più diffuso e adatto per la coltura di embrioni di ratto e di topo durante la fase iniziale della gestazione, ovvero dopo il giorno E 11,5 nei ratti e il giorno 9,5 nei topi.In questo video, desideriamo presentare il nostro protocollo standard per la coltura in condizioni di digiuno utilizzando embrioni RU E12.5. In queste condizioni, l'embrione può essere coltivato per due giorni, un periodo sufficiente per esaminare le diverse manipolazioni efficaci nell'agricoltura orizzontale. Esistono due passaggi critici per il successo.Prima di tutto, la procedura di dissezione deve essere precisa per non danneggiare l'embrione, in particolare i vasi rod. In secondo luogo, la procedura deve essere il più rapida possibile. Questo vale soprattutto per gli embrioni più anziani.Ad esempio, nel caso di embrioni di topo a 10,5 giorni post-coito, questi devono essere trasferiti entro 30 minuti. Abbiamo applicato la tecnica di coltura di embrioni interi per analizzare sei embrioni mutanti. Ad esempio, analizziamo il modello di migrazione delle cellule neurocristiche nel mutante marcando un piccolo numero di cellule con un colorante o trapiantando cellule embrionali in embrioni di tipo selvatico con sfondo mutato.Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo di trasferimento genico in embrioni di topo e di pesce rosso coltivati mediante elettroporazione, che utilizza una scossa elettrica. Possiamo introdurre semplicemente costrutti di geni esogeni, forme dominanti negative e siRNA nelle aree del cervello in via di sviluppo. Pertanto, possiamo analizzare facilmente le funzioni geniche mediante esperimenti di perdita di funzione e di acquisizione di funzione.Studiamo inoltre il comportamento di cellule marcate con GFP o RFP utilizzando colture organotipiche o colture di slice, successive all'agricoltura. Pertanto, è possibile eseguire una varietà di esperimenti combinando la coltura Lio con altre tecniche.

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra la preparazione di colture primarie di neuroni da midgastrula fase embrioni di Drosophila. Vedute di colture vive visualizzare le celle 1 ora dopo la placcatura e neuroni differenziati dopo 2 giorni di crescita in un medium a base di bicarbonato definite. I neuroni sono elettricamente eccitabili e formare connessioni sinaptiche.

Preparazione delle Culture neuronale da Midgastrula fase embrioni di Drosophila

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

In questo articolo presentiamo una metodologia semplice per permettere a lungo...

Un Ex-ovo Sistema di embrioni di pollo Cultura Adatto per applicazioni di imaging e Microchirurgia

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Noi descriviamo una metodologia rapida per isolare e cultura neuroni dell'ippocampo e corticale da embrioni di roditori. Questo protocollo permette di effettuare esperimenti in cui sono richieste colture neuronali quasi puri.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali neuronali di ratto: un protocollo veloce

Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell'ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

La coltura di embrioni interi di mammiferi (WEC) è ampiamente utilizzata in teratologia e biologia dello sviluppo. Il siero di ratto immediatamente centrifugato è comunemente fornito come terreno sia per la WEC di topo che di ratto. In questo video, dimostriamo il nostro protocollo standard per la preparazione di siero di ratto di alta qualità adatto alla WEC dei mammiferi.

Preparazione di Rat Siero Adatto per mammiferi tutta la cultura Embrione

Dimostriamo un metodo per innestare cellule coltivate in siti definiti di embrioni di topo precoci per determinare il loro potenziale in vivo. Introduciamo anche un metodo di elettroporazione ottimizzato che utilizza capillari di vetro di diametro noto, consentendo la consegna precisa di DNA esogeno in alcune cellule degli embrioni.

Metodi di trasferimento Proprio localizzata di cellule o DNA in precoce post-impianto di embrioni di topo

Una piattaforma potenziata per la coltura di embrioni interi consente uno sviluppo continuo e robusto in ex utero di embrioni di topo post-impianto per un massimo di sei giorni, dalle fasi di pre-costruzione fino all'organogenesi avanzata. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura standard per la coltura embrionale di successo utilizzando piastre statiche e sistemi di bottiglie rotanti.

Ex Utero Coltura di embrioni di topo dalla pregastrulazione all'organogenesi avanzata

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire un modello di impianto embrionale in vitro semplice ed efficiente per valutare le molecole rilevanti che influenzano il processo di impianto dell'embrione.

Istituzione di un modello di impianto embrionale in vitro

Impara la tecnica di coltura di embrioni interi di ratto dopo E12.5 utilizzando un sistema di coltura rotante. Questo metodo consente di studiare i processi di sviluppo embrionale in condizioni controllate ex vivo.

Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia

Esplora altri video