Name: Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-30T17:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Impara a preparare i tendini della coda di ratto per studi biomeccanici e meccanobiologici. Questo metodo ottimizzato garantisce la vitalità tissutale, la sterilità e l'integrità strutturale durante l'estrazione e il caricamento nella camera del bioreattore.

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Questo articolo è stato supportato da NSERC di Grant # 299280, IRSST come una borsa di studio di padre G. e FRSQ come premio di laurea di ricerca studente di M. Cyr. Ringraziamo Yoan Lemieux-Laneville per eseguire le manipolazioni registrate su video.

Prima di qualsiasi manipolazione, è necessario identificare il gruppo di tendini da utilizzare a seconda della sperimentazione si sta conducendo e l'apparato a vostra disposizione. Per i nostri scopi, i tendini ventrale sono stati scelti perché sono più piccoli e quindi più facili da manipolare quando si misura la sezione trasversale e montaggio li nella camera bioreattore. Si prega di notare che tutti gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave o sterilizzato con il 70% di etanolo. Inoltre, un flacone spray contenente etanolo al 70% è collocato accanto a ogni postazione di lavoro per sterilizzare i guanti sperimentatori prima di ogni operazione. Parte 1: Estrazione Dopo la resezione, la coda è attentamente manipolato dalla sua estremità per evitare di danneggiare i tessuti. Inoltre, per conservare la vitalità cellulare, tutte le manipolazioni sono eseguite a freddo una soluzione salina. 1A) Materiali: <ul><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> Ghiaccio tritato </li><li> Superficie protettore </li><li> Tagliere </li><li> Piastre di manipolazione individuale </li><li> 2 500 piatti ml </li><li> 2 piatti di vetro 2L </li><li> Nastro adesivo </li><li> 1 pinzette </li><li> 1 Pinza </li><li> 1 Pinzette stare </li><li> 1 paio di forbici chirurgiche </li><li> 1 bisturi </li><li> 1 paio di forbici chirurgiche <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Manipolazione individuale con l'identificazione di orientamento ("P" per "prossimale") </li></ul> 1B) stazione di lavoro: <ol><li> Stendere il protettore superficie e mettere il tagliere in cima. </li><li> Riempire ogni due piatti di vetro più grande per metà con ghiaccio tritato e metterle sulla carta. </li><li> Bastone un pezzo di nastro in un angolo della piastra di manipolazione e di identificare con una lettera per indicare la fine prossimale. </li><li> Riempire i due piatti di vetro a metà e tutte le scanalature delle piastre manipolazione a freddo con soluzione salina. Metterli nei piatti di vetro di grandi dimensioni contenente ghiaccio. </li><li> Organizzare tutti gli strumenti sterili il protettore superficie. </li><li> Trasferire la coda in uno dei piatti di vetro contenente una soluzione salina. </li></ol> 1C) Manipolazioni: <ol><li> Osservare l'anatomia alla fine prossimale della coda di distinguere il lato ventrale dal lato dorsale. Il lato ventrale ha un maggior numero di tendini e dei vasi sanguigni che possono essere verificate premendo delicatamente la coda per la produzione di piccole gocce di sangue. </li><li> Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare la pelle lungo il lato dorsale della coda, se si desidera estrarre i tendini ventrale (o lungo il lato ventrale se avete bisogno i tendini dorsali). </li><li> Aprire l'incisione alla fine prossimale e togliere la pelle con pinze o con le dita e manipolando con attenzione le estremità della coda. </li><li> Lavare via il sangue e capelli nella soluzione salina e trasferire il campione nel recipiente di vetro contenente restante soluzione fresca. Cambiare i guanti. Una sezione trasversale visto al microscopio ottico mostra i gruppi tendine sei. Un tendine di ogni gruppo è collegato alla fine di ogni vertebra caudale, per cui abbiamo tagliato il disco intervertebrale per esporre i tendini nuovo lungo il taglio. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Sezione trasversale della coda di ratto visto al microscopio ottico. </li><li> Tagliare l'estremità distale attraverso le vertebre 2-3 cartilagine più breve con forbici chirurgiche. Mettere la coda sul tagliere per tagliare i tessuti molli con un bisturi e poi subito a sostituirlo nella soluzione. </li><li> Utilizzando le pinzette, estrarre uno tendine dalla coda distale. </li><li> Con una presa delicata ad entrambe le estremità, posto il tendine nella piastra di manipolazione individuale. Ripetere gli ultimi due passaggi fino a quando non più tendini possono essere presi in giro e tagliare fuori una vertebra più breve ogni volta che nuovi tessuti devono essere esposti. </li></ol> Parte 2: Sezione di misura 7 Quando il tessuto viene sottoposto caratterizzazione meccanica o la stimolazione, le sue proprietà meccaniche sono descritte normalizzando la forza all'interno del tendine allo stress. Per questo motivo valutiamo sezione trasversale. 2A) Materiali: <ul><li> Micrometro ottico </li><li> Stereomicroscopio </li><li> Macchina fotografica digitale </li><li> Il riconoscimento dei bordi e gli algoritmi di ricostruzione profilo 5,6 </li><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> 1 20-200μL Micro volume di pipette </li><li> 1 chiave esagonale per la regolazione micrometrica ottica </li><li> 2 Pinzette / "Alt =" files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg Figura 3 "/&gt; Figura 3. Micrometro ottico </li></ul> 2B) stazione di lavoro: <ol><li> Aprire il software (macchina fotografica digitale e gli algoritmi). </li><li> Posizionare il micrometro ottico in modo che vi sia spazio sufficiente per caricare il tendine nell'apparato. </li><li> Organizzare gli strumenti e piatto di vetro contenente i tendini estratto a portata di mano. </li></ol> 2C) Manipolazioni: <ol><li> Riempire il vano di misura a freddo con soluzione salina fino a quando entrambi i sistemi di ancoraggio sono sommersi. </li><li> Trasferire il tendine nel vano tenendo le estremità con le pinzette. </li><li> Mediante aspirazione tramite il micro-volume pipetta, tirare una estremità in un momento nel tubo di silicone. Aspirare alla fine si estende oltre il collari per albero. </li><li> Serrare i collari per albero per comprimere i tubi e installare l'apparato con lo stereomicroscopio. </li><li> Con ingrandimento 105X, allungare i tendini, osservando il tessuto fino a quando le pieghe non sono più percepibili. Tratto da ulteriori 0,40%. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Proiezione del tendine con ingrandimento 105X prima e dopo lo stretching. </li><li> Regolare la posizione e mettere a fuoco per mantenere una chiara immagine del tendine su una rotazione di 180 °. </li><li> Scattare una foto ad ogni rotazione di 10 ° senza modificare la tensione, messa a fuoco o la posizione. Utilizzare solo l'albero rotante per effettuare la rotazione. Grazie alla sua forma conica, questi passaggi possono essere ripetuti in diversi punti lungo il tendine. </li><li> Attivare il riconoscimento bordo e algoritmi di ricostruzione profilo al fine di analizzare i dati che avete registrato. </li><li> Libero il tendine allentando le collari per albero e soffiando aria nei tubi di silicone con la pipetta micro volume. </li><li> Reinserire il tendine sulla piastra di manipolazione, ancora una volta la manipolazione da parte le estremità. </li><li> Verificare la forma del profilo ricostruzione ottenuti e il valore della sezione trasversale. </li></ol> Parte 3: risciacquo Per eliminare la contaminazione che possono essersi verificati durante le manipolazioni precedenti, i tessuti vengono risciacquati sotto biosicurezza cabinet. 3A) Materiali: <ul><li> Freddo una soluzione salina (D-PBS) </li><li> Multiple-scanalatura manipolazione piastra </li><li> Piastre di manipolazione individuale </li><li> Nastro adesivo </li><li> 2 Pinzette </li><li> 1 Pinzette stare </li></ul> 3B) stazione di lavoro: <ol><li> Accendere il ventilatore nell'armadio biosicurezza 15 minuti in anticipo e pulire le superfici interne con il 70% di etanolo. </li><li> Portare tutti gli strumenti all'interno dell'armadio biosicurezza. </li><li> Stick pezzi di nastro su un angolo di ogni singola piastra per identificare la fine prossimale. </li><li> Riempire tutte le scanalature con soluzione salina sterile. </li></ol> 3C) Manipolazioni: <ol><li> Introdurre la piastra manipolazione contenente il tendine estratti nel cabinet. </li><li> Utilizzando le pinzette, rimuovere il tendine dalla sua piastra con una presa delicata su ciascuna estremità. </li><li> Immergere e mescolare dolcemente il tendine nella soluzione salina di ogni comparto della scanalatura multipla piastra manipolazione, a partire dalla più vicina e procedendo verso il solco più lontano. </li><li> Infine, immergere il tendine in una piastra di manipolazione individuale. </li></ol> Parte 4: Caricamento in bioreattore camera Per evitare ulteriore contaminazione, le manipolazioni sono anche condotte nel quadro di biosicurezza. 4A) Materiali: <ul><li> Bioreattore camera 4 </li><li> Ancoraggi sterile </li><li> 1 piatto di Petri sterili </li><li> Cellule in coltura media freddo (DMEM) </li><li> Cianoacrilato </li><li> 2 Pinzette </li><li> Pinzette stare </li><li> 0.5-10μl Micro-volume pipetta </li><li> 1 righello <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Bioreattore camera </li></ul> 4B) stazione di lavoro: <ol><li> Poiché il passo precedente è stato realizzato anche in materia di biosicurezza gabinetto, la rimozione di strumenti inutili vi darà più spazio di lavoro. </li><li> Portare tutti gli altri strumenti all'interno del cabinet. </li></ol> 4C) Manipolazioni: <ol><li> Inserire un ancoraggio sulla piastra di manipolazione con il suo rocchetto centrato sopra l'estremità del tendine e la ferita del tessuto e attorno al rocchetto. </li><li> Rotolare sopra l'ancora e tenere l'estremità libera, garantendo nel contempo che il tessuto rimane agganciato al di ancoraggio. Fermarsi dopo ¾ di giro. </li><li> L'effettuazione della stessapassi con l'altra estremità. </li><li> Rotolo sia ancore oltre allo stesso fino a quando non è di 6 cm tra loro centri 1. </li><li> Allentare il tendine di immergerlo nella soluzione e consentire le sezioni ancorata ad asciugare per breve tempo di migliorare le sue proprietà meccaniche 2-3. </li><li> Versare cianoacrilato nella piastra di Petri e disegnare 2.5μL nella pipetta del volume micro. </li><li> Applicare una goccia di cianoacrilato sulla ferita, i tessuti senza saltare nessun collante nella soluzione salina. Ripetere fino a 2 gocce sono state applicate a ogni ancora. </li><li> Con il tendine ancora completamente immerso, attendere 5 minuti per la colla si asciughi completamente. </li><li> Durante questo tempo, riempire il vano camera con soluzione salina. </li><li> Reidratare tutto il tessuto con una soluzione salina per evitare danni. </li><li> Manipolando solo le ancore, trasferire il tendine nella camera di bioreattori e chiuderlo per evitare perdite e contaminazioni durante il trasferimento. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Il risultato del protocollo dimostra che quando eseguito correttamente, il nostro isolamento dei tessuti rigorosa procedura di preparazione e permettono di mantenere la sterilità dei tessuti, la vitalità e l'integrità. In primo luogo, utilizzando il metodo di estrazione semplice e ripetitivo, siamo in grado di estrarre i tendini coda senza danneggiare la rete di collagene, come si può osservare da un analisi microscopica di sezioni H &amp; E contaminato realizzata dopo l'estrazione. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Rete di collagene del tendine dopo l'estrazione (5 micron sezione longitudinale colorate con H &amp; E). Abbiamo poi i tendini in coltura per un massimo di dieci giorni e test di sterilità condotta. Ogni giorno, placcato soluzione cultura utilizzati su agar e incubato per 24 ore. Poiché non è stata osservata la crescita batterica, abbiamo concluso che le nostre manipolazioni non provochino contaminazione. Con l'algoritmo di ricostruzione profilo e micrometro ottico, siamo in grado di stimare la sezione trasversale all'interno di un margine di errore del 2% 7. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Ricostruzione Profilo di un RTT. Infine, abbiamo valutato la vitalità usando il Live / Dead Fattibilità / citotossicità Kit per le cellule di mammifero dopo la fase di risciacquo e, dopo dodici giorni di cultura. Dal momento che la grande maggioranza dei verdi fluorescenti cellule vive sono state evidenti, possiamo confermare che le nostre procedure di isolamento sono riuscito a preservare il tessuto vivo. Lo stesso test è stato eseguito due ore dopo collegare il tendine nella camera bioreattore. Abbiamo verificato che la disidratazione e la colla a l'ancora non si era diffuso nel tessuto tra le due ancore. <img src="/files/ftp_upload/2176/2176fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Vitalità del tessuto al di ancoraggio (verde = cellule vive, rosso = le cellule morte)

<ol><li>Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+various+mammalian+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zool.+Lond%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of various mammalian tendons.</a> J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).</li>
<li>Dupuis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22D%C3%A9shydratation+de+matrices+collag%C3%A9niques+reconstruites+in+vitro%3A+effets+sur+les+propri%C3%A9t%C3%A9s+m%C3%A9caniques+et+histologiques+%5B%5D%22">Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]</a>. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).</li>
<li>Haut, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+influence+of+strain+rate+on+the+tensile+failure+of+rat+tail+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).</li>
<li>Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
<li>Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &amp, Rancourt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+profiles+and+volume+reconstructions+of+soft+tissues+using+laser+beam+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements.</a> J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).</li>
<li>Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+determining+cross-sectional+shape+and+area+of+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues.</a> J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).</li>
<li>Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &amp, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mediante l'applicazione di tali procedure sperimentali, siamo in grado di condurre una vasta gamma di studi in vitro su questo tipo di tessuti. Come per esempio, uno studio sulla degenerazione dei tessuti è stata effettuata con l'applicazione di sotto-stimolazione per RTT per un periodo di dieci giorni. Ogni giorno, abbiamo valutato le proprietà meccaniche del tessuto in stress test non distruttivi relax. Alla fine, siamo stati in grado di osservare variazioni RTT stress e quindi di analizzare la progressione d...

<table><tbody><tr><td>D-PBS </td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>311-410-CL</td><td>Soluzione salina</td></tr><tr><td>Glucosio </td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>609-037-EL</td><td>Soluzione salina&lt;br/&gt;1g/L</td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico </td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Soluzione salina&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td>Soluzione di coltura</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>600-105-CG</td><td>Soluzione di coltura&lt;br/&gt;3,7g/L</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagente</td><td>Wisent Inc.</td><td>090150</td><td>Soluzione di coltura&lt;br/&gt;10%</td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Soluzione di coltura&lt;br/&gt;1%</td></tr><tr><td>Micrometro ottico</td><td>Strumento</td><td>Prodotto su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di manipolazione</td><td>Strumento</td><td>Prodotto su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera del bioreattore</td><td>Strumento</td><td>Prodotto su misura</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e mechanobiological

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Tendini coda di topo (RTT) è un modello comune biologici utilizzati in studi sperimentali in vitro nel campo della fisiologia dei tendini e tendinopatie. Lavorare con questi tessuti è impegnativo perché sono molto fragili, e fino ad ora non c&#39;era protocollo rigorosamente dettagliato per il loro isolamento. Di fronte a queste sfide, abbiamo sviluppato metodi e strumenti per facilitare la manipolazione di RTT e tessuto di controllo vitalità, sterilità e l&#39;integrità. In questo articolo vengono descritte le procedure sperimentali utilizzati per la preparazione RTT per gli studi di biomeccanica e mechanobiological. Il nostro lavoro è diviso in quattro fasi principali: estrazione, sezione di misura zona, il risciacquo e il caricamento nella camera bioreattore. Ad ogni passo, tutti, i materiali procedure e le manipolazioni sono presentati in dettaglio in modo che possano essere facilmente riprodotti. Inoltre, gli strumenti specifici sviluppati sono presentati: un piatto di manipolazione utilizzata per separare RTT, un micrometro ottico per posizionare il tessuto durante la sezione di misurazione dell&#39;area e un sistema di ancoraggio per fissare la RTT su un bioreattore. Infine, descriviamo i risultati ottenuti dopo le prove multiple per validare i nostri metodi. Valutazioni la vitalità, la sterilità e l&#39;integrità dimostrare che le nostre procedure siano sufficientemente rigorosi per le manipolazioni dei tessuti fragili come i tendini coda di topo.

In questo articolo vengono descritte le procedure sperimentali utilizzate per preparare i tendini coda di topo per studi di biomeccanica e mechanobiological. Diverse caratteristiche dei passi principali nella preparazione sono dimostrati, a cominciare da estrazione, sezione di misura zona, il risciacquo e il caricamento nella camera bioreattore.

Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

I tendini della coda di ratto (RTT) sono un modello biologico comune utilizzato in studi sperimentali in vitro nei campi della fisiologia tendinea e della tendinopatia. Lavorando...

Il video che state per vedere contiene le procedure sperimentali utilizzate per isolare e preparare il tendine della coda del ratto per studi biomeccanici e biologici meccanici. Lo scopo di questo articolo è dimostrare i metodi e gli strumenti che sono stati sviluppati e ottimizzati al fine di mantenere la vitalità, la sterilità e l'integrità del tessuto durante la procedura di preparazione. Discuteremo diverse caratteristiche relative ai passaggi principali della preparazione, a partire dall'estrazione, seguita dalla misurazione dell'area della sezione trasversale, dal risciacquo e infine dal caricamento nella camera del bioreattore.Iniziamo. L'estrazione è il primo passaggio della preparazione, necessario per conservare la vitalità cellulare. Tutte le manipolazioni vengono eseguite in soluzione salina fredda.Dopo l'eutanasia dei ratti, la coda viene resecata, sciacquata con etanolo al 70% e trasferita in una piastra contenente cellule e soluzione, mantenendo il tutto sul ghiaccio. Per facilitare l'estrazione del tendine, è necessario rimuovere la pelle. Si tenga presente che si lavora con tendini ventrali.Poiché sono più piccole e più facili da manipolare con la nostra attrezzatura, viene praticata un'incisione lungo tutto il lato dorsale della coda. L'orientamento corretto della coda viene quindi verificato osservando l'anatomia all'estremità prossimale. Come possiamo vedere, il lato ventrale mostra un numero maggiore di tendini e la presenza di un vaso sanguigno può essere verificata dalle gocce di sangue ottenute.Stringendo delicatamente la coda, si esegue l'incisione, partendo dall'estremità prossimale e utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Si presta attenzione a manipolare la coda solo alle sue estremità.Una volta completata l'incisione, la pelle viene rimossa a partire anche dall'estremit&agrave; prossimale, utilizzando le dita o una pinzetta. Ancora una volta, si presta attenzione a manipolare la coda tenendola per le estremit&agrave;. Successivamente, la coda viene risciacquata nella soluzione per rimuovere peli e sangue.Il campione viene quindi trasferito in una piastra contenente soluzione fresca e mantenuto sul ghiaccio. A questo punto, l'operatore cambia i guanti per esporre il tendine. L'estremit&agrave; distale della coda viene resecata di due o tre vertebre pi&ugrave; corta.Le vertebre sono i fasci visibili tra i fasci tendinei e possono essere percepite anche facendo scorrere le dita lungo tutta la coda. Vista al microscopio ottico di una sezione trasversale realizzata lungo la vertebra. L'estremit&agrave; Skoal mostra che esistono sei gruppi tendinei diversi, poich&eacute; il tendine di ciascuno di essi &egrave; attaccato alla vertebra, e indica che stiamo utilizzando solo i tessuti ventrali.Vengono estratti quattro tendini per ogni taglio, due dai gruppi inferiori e due dai gruppi laterali. Per eseguire la resezione, è possibile utilizzare forbici chirurgiche per recidere il disco intervertebrale e un bisturi su un tagliere per i tessuti molli. A questo punto, la faccia ventrale viene riconosciuta dalla presenza di una spugna tendinea più grande.Una volta verificata l'orientazione, il tendine viene delicatamente estratto dall'estremit&agrave; distale utilizzando una pinzetta; quando non &egrave; pi&ugrave; possibile isolare altri tessuti, la coda viene resecata a livello della spalla vertebrale, come mostrato in precedenza. Dopo l'estrazione, il tessuto viene immediatamente immerso nella soluzione e, tenendo entrambe le estremit&agrave;, il tendine viene trasferito in una piastra di manipolazione contenente anche la sospensione cellulare, sulla quale un nastro viene utilizzato per identificare l'estremit&agrave; prossimale. Un'analisi microscopica di sezioni longitudinali colorate con ematossilina ed eosina mostra che, utilizzando questo semplice e ripetitivo metodo, il sigillo del tessuto estratto presenta una rete di collagene ben definita e densamente impacchettata.Dopo la manipolazione, quando i tessuti subiscono una stimolazione meccanica, descriviamo le loro proprietà meccaniche normalizzando la forza interna in termini di tensione. Pertanto, dobbiamo valutare la loro area della sezione trasversale. Per fare ciò, il profilo del campione viene ricostruito utilizzando una microscopia stereoscopica dotata di una telecamera digitale.Con questo metodo, l'integrità del tessuto viene preservata poiché il carico o lo stress della neve vengono applicati direttamente su di esso. La fotocamera digitale scatta immagini della proiezione del campione su un angolo visivo di 180°. All'interno di un sistema di riferimento, un algoritmo di visione assistita localizza i margini superiore e inferiore del campione.Successivamente, un algoritmo con software MATLAB viene utilizzato per eseguire la ricostruzione del profilo. È stato progettato un micrometro ottico per mantenere il tessuto nella zona focale. Infatti, al di fuori di questa regione, la proiezione è sfocata e un nuovo fuoco sposterebbe il sistema di riferimento locale.Il micrometro include un comparto di misurazione per prevenire la disidratazione del tessuto. Due sistemi di posizionamento con piattaforma rotante, che permettono la rotazione del campione, e due dispositivi di ancoraggio realizzati con tubi di silicone compressi contro i colori dell'asse. Innanzitutto, il comparto di misurazione viene riempito con soluzione cellulare fredda fino a quando l'ingresso dei tubi di silicone non è sommerso.Quindi, l'astronauta viene trasferito nel compartimento di misurazione utilizzando pinzette e tenendolo soltanto per le estremità. Utilizzando una pipetta a volume microscopico, le estremità del tendine vengono introdotte per sezione nei tubi di silicone. Successivamente si esegue l'aspirazione fino a quando l'estremità si estende oltre i colori dello stelo.Una volta completati entrambi i lati, i colori dell'asse vengono serrati utilizzando una chiave per il collo al fine di comprimere il tubo. Ora che il tendine è fissato, l'apparato viene installato sotto il micr cup stereo. Il tendine può essere osservato direttamente dallo schermo del computer con un ingrandimento di 105.Per garantire coerenza, il tendine viene allungato fino a quando le pieghe non sono più percettibili, seguito da un'ulteriore deformazione dello 0,4%. Poiché il campione viene ripreso da zero a 170 gradi, è necessario un posizionamento iniziale e un'attenzione particolare alla messa a fuoco per ottenere un'immagine nitida lungo tutta la circonferenza. In effetti, vengono scattate 18 immagini aumentando la rotazione del campione di 10 gradi tra ogni vista.Con questo metodo, è possibile stimare l'area della sezione trasversale del tendine della coda di un ratto senza danneggiare il tessuto. Alla fine, si ottiene una ricostruzione del profilo con un margine di errore compreso tra lo 0,5% e il 2%. Dopo la misurazione, i tessuti vengono risciacquati per prevenire contaminazioni che potrebbero essersi verificate durante le manipolazioni precedenti.Una piastra sterile per manipolazioni contenente soluzione di fissaggio fresca viene posta all'interno del cabinet, una utilizzata per la procedura di risciacquo mentre l'altra riceverà il tendine da risciacquare. L'operatore lava il proprio guanto con etanolo al 70% prima di introdurre il tendine estratto all'interno del cabinet di sicurezza. Tenendo soltanto le estremità, il tendine viene trasferito con attenzione da un pozzetto all'altro.Infine, viene trasferito in una piastra di manipolazione individuale contenente anche soluzione cellulare sterile. Per la validazione del protocollo, abbiamo eseguito test di vitalità e sterilità. Innanzitutto, la vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il kit di citotossicità e vitalità cellule vive/morte per cellule di mammifero.Dopo una coltura di 12 giorni, è stata osservata una larga maggioranza di cellule vive fluorescenti verdi, confermando che le procedure di isolamento sono efficaci nel preservare il tessuto vivo. Successivamente sono state effettuate analisi per verificare la contaminazione della coltura utilizzata. Il mezzo è stato seminato su agar e incubato per 10 giorni, poiché non è stata osservata alcuna crescita batterica.Abbiamo verificato che le nostre manipolazioni siano sterili. Il sistema di fissaggio sfrutta il vantaggio della disidratazione del tessuto e dell'uso di colla per campioni di piccole dimensioni, come la coda del ratto o i tendini, nei quali la colla penetra il tessuto. Questo assicura la fissazione in tutte le sottounità, mentre la disidratazione ne migliora le proprietà meccaniche per evitare ulteriori contaminazioni.Tutta la procedura di caricamento viene eseguita all'interno di un armadio a sicurezza biologica in cui tutti gli strumenti e i componenti della camera sono sterili. Per l'operazione di caricamento, la camera del biorreattore viene fissata su un dispositivo di posizionamento. Due bracci mobili sono predisposti per ricevere gli ancoraggi dei tendini.Un coperchio chiude la camera per prevenire contaminazioni. Innanzitutto, gli ancoraggi vengono depositati alle estremità della piastra di manipolazione. I loro rocchetti sono centrati rispetto all'asse longitudinale della scanalatura e sopra il tendine.Il tendine viene quindi avvolto attorno a un ancoraggio. L'ancoraggio viene ruotato di circa tre quarti di giro mentre il corpo del tessuto rimane in soluzione. Tenendo l'estremità libera, assicuriamo l'attacco del tessuto all'ancoraggio.Quindi si ripete la stessa procedura per l'altra estremità. Una volta fissati entrambi i lati, gli ancoraggi vengono arrotolati o srotolati in modo uniforme fino a ottenere sei centimetri. Tra le due estremità, si depositano due gocce di 2,5 microlitri di ocreate sulla parte lesa dei tendini.Per l'inserimento dell'adesivo si procede con attenzione. Per evitare di aggiungere colla alla soluzione cellulare, è necessario un tempo minimo di cinque minuti affinché la colla si asciughi completamente. Per validare il nostro protocollo, abbiamo effettuato test per verificare l'influenza della colla e della disidratazione del punto di ancoraggio sulla vitalità del tessuto.Dopo due ore, abbiamo osservato che la condizione estrema non si era diffusa al di fuori del tessuto. Di fatto, esiste un limite cromatico ben definito che delimita le cellule morte fluorescenti rosse presenti nel punto di ancoraggio e la maggioranza delle cellule vitali verdi del corpo del tessuto. Nel frattempo, la camera del bioreattore viene riempita con mezzo di coltura fresco.Una volta che la ferita di una parte del tendine è asciutta, viene reidratata con la soluzione cellulare. Successivamente, il tessuto ancorato viene trasferito nella camera utilizzando una pinzetta. Il coperchio viene chiuso per evitare ulteriori contaminazioni.Il dispositivo di posizionamento verrà rimosso una volta installata la camera nel biorreattore. Abbiamo appena illustrato come preparare un tendine di coda di ratto per studi biomeccanici e biologici meccanici. Applicando tali procedure, possiamo condurre una vasta gamma di studi in vitro su questi tessuti.Ad esempio, uno studio sulla degenerazione del tessuto è stato condotto applicando una stimolazione insufficiente per un periodo di 10 giorni. Ogni giorno, abbiamo valutato il tessuto, le proprietà meccaniche e il test di rilassamento della tensione non distruttivo. Alla fine, siamo stati in grado di osservare la variazione della tensione.Abbiamo fornito evidenze che le nostre rigorose procedure di isolamento e preparazione permettono di mantenere la vitalità del tessuto, l'integrità e l'attività. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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