Name: Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per linduzione di ipofisite autoimmune sperimentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara a preparare proteine ipofisarie murine per studiare l'ipofisite autoimmune. Questo protocollo include omogenizzazione, centrifugazione e valutazione qualitativa mediante elettroforesi su gel.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DK080351 al PC.

Protocollo sperimentale Il primo passo in questo protocollo sperimentale è quello di raccogliere un gran numero di topo ghiandola pituitaria. Il secondo passo è quello di omogeneizzare le ghiandole a preparare un estratto di proteine. Il terzo passo è quello di emulsionare queste proteine ​​con una miscela di idrocarburi. Fase 1: Raccolta e conservazione di mouse ghiandola pituitaria La ghiandola pituitaria del mouse si trova alla base del cranio in una depressione dello sfenoide detta sella turcica, circondato lateralmente dai nervi trigemino e anteriormente dal chiasma ottico. La ghiandola è composta da un lobo anteriore più ampia e più piccoli lobi posteriori e intermedi, e pesa in media 1,9 mg. Ghiandola pituitaria sono raccolti dai topi di ceppi misti, i sessi e di età, destinato ad essere l&#39;eutanasia dalla struttura di cura degli animali. Per isolare la ghiandola pituitaria, il mouse è eutanasia, la pelle sopra il cranio sezionato, e l&#39;osso del cranio taglio aperto con le forbici. Il cervello viene sollevato per esporre la ghiandola pituitaria, che viene poi isolato dalla dura mater circostante, scavato dello sfenoide e conservati in un tubo di plastica in ghiaccio secco. In generale usiamo 300 ghiandola pituitaria del mouse per una preparazione di proteine, un numero che può essere raccolta da una sola persona in 9 ore. Una volta che la collezione è completata, il tubo contenente la ghiandola pituitaria è conservato a -80 ° C fino al momento per il passo successivo. Fase 2. Estrazione di proteine ​​del mouse pituitaria <ol><li> Aggiungere la soluzione tampone di omogeneizzazione ad un tubo da 15 ml Falcon (catalogo n. 352059) conservati in un bagno di ghiaccio, con 250 microlitri di tampone per ogni 100 ghiandola pituitaria raccolti. Utilizzare un tampone di forza ionica simile a quello che è fisiologicamente presente all&#39;interno del citoplasma della cellula (0,2 M) e del pH fisiologico (7,4). Noi usiamo tampone fosfato (0,161 M, pH 7,4), integrato con un cocktail di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich, catalogo n. P8340-1 ml). </li><li> Aggiungere la ghiandola pituitaria al buffer poco prima omogeneizzazione, quindi posizionare il generatore (5-mm di diametro) del omogeneizzatore Polytron sul fondo della provetta Falcon. Omogeneizzare a giri massimo per 30 secondi, spostare delicatamente il tubo Falcon su e giù mantenendolo nel bagno di ghiaccio. Poi, il resto l&#39;omogenato in ghiaccio per 1 min. Ripetere l&#39;omogeneizzazione e raffreddamento passi due volte. Questa omogeneizzazione dolce deve rompere le cellule e il rilascio delle proteine ​​citosoliche senza interrompere i nuclei. </li><li> Per rimuovere i nuclei, tessuto ininterrotto e materiali insolubili (come il tessuto connettivo e complessi di proteine ​​denaturate), centrifugare la omogenato a bassa velocità (1000 g) per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante (ora si chiama post-nucleare supernatante, PNS) in una nuova provetta Falcon, avendo cura di lasciare indisturbato il pellet, e memorizzare il PNS sul ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet nel volume originale di buffer di omogeneizzazione (250 ml di buffer per ogni 100 ghiandola pituitaria raccolti), omogeneizzare come sopra, centrifuga come sopra, e poi unire il PNS secondo con il primo. </li><li> Aliquota i due campioni raccolti in provette da microcentrifuga PNS e conservare a -80 ° C fino al momento per il passo successivo. Questa preparazione di proteine ​​possono essere conservati a -80 ° C ma perde gradualmente la sua potenza, per cui si consiglia di utilizzarlo entro 6 mesi dalla preparazione. Utilizzare una piccola aliquota per determinare la resa di proteine ​​e la concentrazione dal saggio BCA (Pierce catalogo no. 23.225), e la qualità delle proteine ​​mediante elettroforesi su gel. In generale, si ottengono circa 60 mg di proteina da 300 pituitaries mouse in 1,5 mL di buffer di omogeneizzazione, ad una concentrazione di circa 40 mg / mL. </li></ol> Fase 3. Preparazione della emulsione per l&#39;immunizzazione <ol><li> Scongelare rapidamente le aliquote proteina congelato necessari per l&#39;esperimento e regolare la concentrazione di proteine ​​a 20 mg / mL. Questo estratto proteico sarà emulsionato 1:1 con adiuvante completo di Freund (CFA, Sigma F-5881) contenente 5 mg / mL di calore ucciso Mycobacterium tuberculosis (Becton Dickinson, 231.141). Ogni topo riceverà 1 mg di estratto pituitario in 100 ml di emulsione. </li><li> L&#39;esempio dato ecco per 10 immunizzando topi, dove ogni mouse saranno iniettati con 100 l di emulsione contenente 1 mg di proteine ​​pituitaria. Consentono a due topi in più per la perdita di materiale durante la preparazione, in modo da utilizzare al massimo 12 mg di proteine ​​pituitaria. Aspire 600 microlitri della mg / ml 20 estratto proteico pituitario descritto sopra utilizzando una siringa da 2,5 ml di Hamilton a tenuta di gas. Risospendere il CFA agitando, e aspira 600 ml di CFA in un&#39;altra siringa da 2,5 ml Hamilton. Attaccare e garantire un 22-gauge micro-emulsione ago alla siringa piena di CFA. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa CFA in modo che l&#39;ago è pieno di CFA, quindi collegare e fissare l&#39;altra estremità dell&#39;ago della siringa riempita con l&#39;estratto di ipofisi. </li><li> Lentamente avanzare lo stantuffo della siringa CFA per spingere la componente del petrolio estratto acquoso nella pituitaria, in modo tale che solo una piccola quantità è misto. Poi spingere indietro lo stantuffo della siringa estratto pituitario nella siringa CFA. Ripetete questa azione aumentando gradualmente la quantità di materiale misto. Continuare fino a quando l&#39;intero contenuto delle due siringhe sono mescolati. Otterrete una soluzione biancastra e uniformemente distribuito che rappresenta l&#39;acqua in emulsione di olio. </li><li> Una volta che l&#39;emulsione è formata, ripetere la parte posteriore e indietro movimento almeno 500 volte a garantire l&#39;emulsione è accuratamente miscelati. Dopo il ciclo finale di miscelazione, il rapporto 1:1 acqua in emulsione olio è pronto all&#39;uso e contiene una concentrazione pituitaria proteina di 10 mg / ml. L&#39;emulsione verrà iniettato lo stesso giorno per via sottocutanea in topi anestetizzati SJL, come dettagliato nell&#39;articolo JOVE compagno. </li></ol>

<ol><li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li>
<li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li>
<li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li>
<li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto%27s+disease+in+a+woman%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nonostante il fatto che il primo paziente con ipofisite autoimmune è stato segnalato nel 1962 4, l&#39;ipofisi autoantigeni patogeni devono essere ancora identificate 5. I modelli animali possono essere molto utili per identificare questi autoantigeni, favorendo la scoperta di biomarcatori che sono traducibili alla cura del paziente. Questo articolo ha dimostrato una procedura semplice per la preparazione di proteine ​​pituitaria in una forma che è sufficiente per indurre ipofisite autoimmuni negli...

<table><tbody><tr><td>Tubi Falcon da 15 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer per l'omogeneizzazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata al fosfato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inibitore delle proteasi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore Polytron</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggio BCA</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Adiuvante completo di Freund&amp;rsquo;s (CFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-5881</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BD Biosciences</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Siringa ermetica da 2,5 mL di Hamilton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago microemulsionante da 22 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di immunogeno mouse ipofisari per l&#39;induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Ipofisite autoimmune è una infiammazione cronica della ghiandola pituitaria causata o accompagnati da autoimmunità 1. E &#39;stata tradizionalmente considerata una malattia rara ma segnalazione è aumentato notevolmente negli ultimi anni. Ipofisite, infatti, non si sviluppa raramente come un &quot;effetto collaterale&quot; nei pazienti con tumore trattati con anticorpi che bloccano i recettori inibitori espressi sui linfociti T, come CTLA-4 2 e PD-1 recettori. Ipofisite autoimmune può essere indotta sperimentalmente iniettando nei topi con le proteine ​​pituitaria mescolato con un adiuvante 3. In questo articolo video che dimostrano come estrarre proteine ​​dal topo ghiandola pituitaria e su come prepararli in una forma adatta per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL.

Ipofisite autoimmune può essere riprodotta nei topi iniettando un estratto di proteine ​​del mouse pituitaria.

Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l&#39;induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

L'ipofisite autoimmune è un'infiammazione cronica della ghiandola pituaria causata o accompagnata da autoimmunità1. È stata tradizionalmente considerata una ...

L'ipofisite autoimmune è caratterizzata da un ingrandimento della ghiandola pituitaria e da una carenza di uno o più ormoni ipofisari. Gli autoantigeni responsabili rimangono sconosciuti. In questo studio viene illustrato un protocollo per la preparazione di proteine della ghiandola pituitaria di topo da utilizzare nello studio di questa malattia.Per prima cosa, le ghiandole pituitarie vengono isolate da topi sacrificati. Le pituitarie vengono quindi omogeneizzate per rompere meccanicamente le cellule e rilasciare le proteine citosoliche. L'omogenato viene chiarificato mediante centrifugazione a bassa velocità e quantificato mediante saggio colorimetrico BCA, mentre la qualità viene valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide.Infine, l'omogenato proteico acquoso viene mescolato con un adiuvante oleoso. Questa miscela viene quindi iniettata nei topi per creare un modello murino che assomiglia all'ipofisite autoimmune. Come mostrato nel video allegato, sono state descritte quattro tecniche per indurre l'ipofisite in animali sperimentali.La tecnica presentata in questo articolo, che consiste nell'iniezione di una miscela di proteine ipofisarie con l'adjuvante influenzale, è la più antica, risalente agli anni '60. Altri approcci includono l'iniezione di glicoproteine solubili del virus della rosolia nel 1992, l'iniezione stereotassica di un adenovirus direttamente nella ghiandola pituitaria nel 2002 e il trapianto della ghiandola pituitaria da una linea di ratti sotto la capsula renale di un'altra linea di ratti nel 2010. Il principale vantaggio dell'approccio con l'adjuvante di Florence è che attualmente è meno invasivo, più consistente e soprattutto più preciso nell'indurre una malattia che assomiglia strettamente alla controparte umana.Sebbene riportata fin dagli anni '60, la tecnica con adiuvante estraneo ha dato scarsi risultati nell'induzione di ipofisite. Quando ho iniziato il mio dottorato, riuscivo a ottenere solo un'incidenza e una gravità modeste di ipofisite utilizzando il protocollo con adiuvante estraneo pubblicato. Le cose sono migliorate in modo significativo quando ho avuto l'idea di aumentare di dieci volte la quantità di proteine pituitarie contenute nell'emulsione EM.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi dell'ipofisite autoimmune, può anche essere utilizzato per studiare altre malattie autoimmuni per le quali gli autoantigeni devono ancora essere identificati. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà principalmente nell'ultimo passaggio, la preparazione dell'emulsione, poiché richiede abilità manuali, tempo e dedizione. Una dimostrazione visiva è quindi fondamentale per comprendere come deve essere preparata correttamente un'emulsione.Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre il campo dell'autoimmunità. Sapere come preparare l'antigene in vitro per l'immunizzazione può essere utile anche nella produzione di anticorpi monoclonali o per testare nuovi vaccini. A dimostrare questa tecnica saranno S. Zoo Heroic Ura e Mayland al Gato del mio laboratorio.La ghiandola pituitaria del mouse è una ghiandola di forma cilindrica situata alla base del cranio, in una depressione dell'osso sfenoidale chiamata fossa pituitaria. La ghiandola è delimitata lateralmente dai nervi trigemini e anteriormente dal chiasma ottico. È composta da un lobo anteriore più grande e da lobi intermedi e posteriori più piccoli.Per isolare la ghiandola pituitaria, utilizzare le forbici per decapitare il topo eutanasizzato, quindi effettuare dei tagli paralleli dalla parte posteriore a quella anteriore del cranio. Sollevare il cervello e ribaltarlo all'indietro per esporre la ghiandola pituitaria, che appare come un cilindro situato all'interno di un triangolo isoscele avente la ghiandola pituitaria come base, i nervi trigemini come lati e il chiasma ottico come vertice.Circondare la ghiandola con le punte delle pinzette chiuse per rompere le meningi circostanti. Quindi, utilizzando pinzette fini, afferrare l'ipofisi dalla cella di Turca e posizionarla in un tubo di plastica su ghiaccio secco. Per una preparazione, raccogliere 300 ghiandole ipofisarie di topo.Questa raccolta richiede circa nove ore-uomo. Una volta completata la raccolta, conservare le ghiandole pituitarie a meno 80 gradi Celsius fino al momento del loro utilizzo. Posizionare un tubo Falcon da 15 millilitri in un bagno di ghiaccio.Aggiungere al tubo 250 microlitri di buffer di omogeneizzazione. Per ogni 100 ipofisi raccolte subito prima dell'omogeneizzazione, aggiungere le ghiandole pituitarie di topo nel buffer. Successivamente, posizionare la punta dell'omogenizzatore Polytron, con un generatore dal diametro di cinque millimetri, sul fondo del tubo Falcon contenente le pituitarie di topo e il buffer, e omogeneizzare alla massima velocità per 30 secondi.Muovere delicatamente il tubo su e giù mantenendolo sul ghiaccio. Successivamente, lasciare l'omogenato in ghiaccio per un minuto. Ripetere i passaggi di omogeneizzazione e raffreddamento altre due volte.Questa omogeneizzazione delicata dovrebbe rompere le cellule e rilasciare le proteine senza frammentare i nuclei. Centrifugare l'omogenato a bassa velocità, circa 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, per far sedimentare i nuclei, il tessuto non rotto e i materiali insolubili come il tessuto connettivo e i complessi proteici denaturati. Fare attenzione a non disturbare il pellet.Trasferire il SNA, ora chiamato post nuclear sate o PNS, in un nuovo tubo Falcon. Mantenere il PNS sul ghiaccio, recuperare il pellet utilizzando lo stesso volume di buffer di omogeneizzazione usato in precedenza, omogeneizzare e centrifugare come in precedenza. Dopo aver unito i due campioni di PNS, aliquotare la soluzione in numerosi tubi da microcentrifuga.Conservare le provette da microcentrifuga a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Questa preparazione proteica è stabile a meno 80 gradi Celsius, ma perde gradualmente la sua potenza. Pertanto, si raccomanda di utilizzarla entro sei mesi dalla preparazione.Conservare un'aliquote piccola del PNS per determinare il rendimento e la concentrazione proteica mediante saggio dell'acido bicinconico. Quindi determinare la qualità delle proteine mediante elettroforesi su gel da 300 ghiandole pituitarie di topo, il cui peso totale medio è di circa 570 milligrammi. Ci si aspetta un rendimento di 60 milligrammi di proteine pituitarie, ovvero un milligrammo di proteina ogni 10 milligrammi di tessuto.La concentrazione proteica è tipicamente di circa 40 milligrammi per millilitro. L'esempio fornito qui riguarda l'immunizzazione di 10 topi. Si prevede di iniettare a ciascun topo 100 microlitri di emulsione contenente un milligrammo di proteina pituitaria; considerando due topi aggiuntivi per le perdite di materiale durante la preparazione, vengono preparati 12 milligrammi di emulsione proteica.Iniziare scongelando rapidamente gli aliquote proteiche congelate riscaldandole tra le mani. Regolare la concentrazione proteica a 20 milligrammi per millilitro con PBS. Successivamente, aspirare 600 microlitri di estratto proteico ipofisario corrispondenti a 12 milligrammi in una siringa Hamilton da 2,5 millilitri e risospendere completamente l'adjuvante FRONS o CFA contenente cinque milligrammi per millilitro di Mycobacterium tuberculosis ucciso per calore, agitandolo manualmente.Poi aspirare 600 microlitri di CFA in un'altra siringa Hamilton da 2,5 millilitri. Applicare e fissare un ago microemulsionante da 22 gauge sulla siringa riempita con CFA. Spingere lentamente lo stantuffo in modo che l'ago si riempia di CFA.Quindi collegare e fissare l'altra estremità dell'ago alla seconda siringa contenente l'estratto proteico ipofisario. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno delle siringhe. Spingere lentamente lo stantuffo della siringa contenente CFA per immettere la componente oleosa nell'estratto ipofisario acquoso, in modo che ne venga miscelata solo una piccola quantità.Quindi reinserire lo stantuffo della siringa contenente l'estratto ipofisario nella siringa contenente l'adjuvante completo di Freund (CFA). Ripetere questa operazione aumentando gradualmente la quantità di materiale miscelato fino a quando tutto il contenuto non sarà completamente omogeneizzato. Questo materiale di colore biancastro e uniformemente distribuito rappresenta l'emulsione acqua-olio.Una volta formata l'emulsione, ripetere l'intero ciclo avanti e indietro almeno 500 volte. Al termine dell'ultimo ciclo, le siringhe conterranno un'emulsione acqua-olio in rapporto uno a uno, in cui la concentrazione della proteina pituitaria è ora di 10 milligrammi per millilitro. L'emulsione è pronta per l'uso; per verificare la qualità dell'emulsione, aggiungere una goccia in un becher contenente acqua. Se l'emulsione è stata preparata correttamente, la goccia rimarrà compatta e ben definita sulla superficie.Se l'emulsione è di scarsa qualità, si diffonderà e si dividerà in gocce più piccole. L'emulsione viene iniettata nello stesso giorno della sua preparazione nei topi SJL per indurre ipofisite autoimmune sperimentale. Questo protocollo è descritto in dettaglio nel jo verticale allegato.Dopo aver raccolto la ghiandola pituitaria e aver acquisito padronanza delle tecniche, è possibile eseguire l'istruzione proteica in un'ora, ricordando di lavorare rapidamente e al freddo. Durante questa fase, durante la preparazione dell'immersione, che richiede circa un'ora. Ricordare di lavorare con lentezza e pazienza nella fase iniziale di mescolamento, dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare i meccanismi attraverso cui i linfociti autorreattivi riconoscono e infiltrano l'organo bersaglio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un estratto proteico dalla ghiandola pituitaria del topo e di come mescolarlo con gli adiuvanti di Freund per preparare un'emulsione pronta per essere utilizzata come immunogeno. Non dimenticare che lavorare con siringhe e adiuvanti completi di Freund, che contengono micobatteri della tubercolosi inattivati e liofilizzati, può essere pericoloso se accidentalmente ti pungi.Pertanto, utilizzare sempre aghi sterili e smaltire correttamente gli aghi durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra come per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL e come valutare la sua gravità per via istopatologica.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Questo video dimostra un'efficiente tecnica di omogeneizzazione per generare un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in un modello murino. L'emulsione contiene un autoantigene - la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) - in fase acquosa, circondata da una fase oleosa continua comprendente un batterio patogeno inattivato. L'emulsione garantisce un rilascio prolungato di antigeni per una risposta immunitaria prolungata.

Preparazione di un'emulsione antigene-adiuvante per indurre l'encefalomielite autoimmune

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Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

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Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.

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Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

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