Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l'induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

L'ipofisite autoimmune è caratterizzata da un ingrossamento della ghiandola pituitaria e da una carenza di uno o più ormoni ipofisari. Gli autoantigeni causali rimangono sconosciuti. Qui, viene dimostrato un protocollo per la preparazione di proteine della ghiandola pituitaria di topo da utilizzare nello studio di questa malattia.

In primo luogo, le ghiandole pituitarie vengono isolate da topi soppressi. Gli ipofisi vengono quindi omogeneizzati per rompere meccanicamente le cellule e rilasciare proteine citosoliche. L'omogeneità viene chiarificata mediante centrifugazione a bassa velocità e valutata per quantità mediante test colorimetrico, BCA e qualità mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide.

Infine, l'omogenato di proteina acquosa viene miscelato con un adiuvante oleoso. Questa miscela viene quindi iniettata nei topi per creare un modello murino simile all'ipofisite autoimmune. Come mostrato nel video di accompagnamento, sono state descritte quattro tecniche per indurre l'ipofisite negli animali da esperimento.

La tecnica presentata in questo articolo, ovvero l'iniezione di proteine ipofisarie mix di adiuvante influenzale, è la più antica e risale agli anni '60. Altri approcci sono stati l'iniezione di glicoproteine solubili dal virus della rosolia nel 1992, l'iniezione stereotassica di un adenovirus direttamente nella ghiandola pituitaria nel 2002 e il trapianto della ghiandola pituitaria da un ceppo di ratto sotto la capsula renale di un altro ceppo di ratto nel 2010. Il vantaggio principale dell'approccio adiuvante di Florence è che oggi è meno invasivo, più consistente e soprattutto più accurato nell'indurre una malattia che assomiglia molto alla controparte umana.

Sebbene sia stata segnalata dagli anni '60, la tecnica dell'adiuvante straniero ha funzionato male per l'induzione dell'ipofisite. Quando ho iniziato il mio lavoro di dottorato, potevo ottenere solo un'istanza e una gravità modeste di ipofisite utilizzando il protocollo adiuvante straniero pubblicato. Le cose migliorano in modo significativo quando ho l'idea di aumentare di dieci volte la quantità di proteine pitu che contengono nell'emozione EM.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla patogenesi dell'ipofisite autoimmune, può anche essere utilizzato per studiare altre malattie autoimmuni per le quali gli antigeni automatici devono ancora essere identificati. Generalmente, le persone che si avvicinano per la prima volta a questo metodo avranno difficoltà soprattutto con l'ultimo passaggio, la preparazione del margine, perché richiede manualità, tempo e dedizione. La dimostrazione visiva è quindi fondamentale per capire come deve essere preparata un'emulsione adeguata.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono oltre il campo dell'autoimmunità. Sapere come preparare l'antigene per l'immunizzazione può essere utilizzato anche per la produzione di anticorpi monoclonali o per testare nuovi vaccini. A dimostrare questa tecnica saranno S Zoo eroico Ura e Mayland al gato dal mio laboratorio.

L'ipofisi del topo è una ghiandola di forma cilindrica che si trova alla base del cranio in una depressione dell'osso sfenoidale chiamata terica. La ghiandola è delimitata lateralmente dai nervi trigemino e anteriormente dal chiasma del nervo ottico. È composto da un lobo anteriore più grande e da lobi più piccoli, intermedi e posteriori.

Per isolare la ghiandola pituitaria, usa le forbici per decapitare il topo soppresso, quindi fai tagli paralleli dalla parte posteriore alla parte anteriore del cranio. Solleva il cervello e capovolgilo all'indietro per esporre la ghiandola pituitaria, che appare come un cilindro nel contesto di un triangolo isoscele. Avendo la ghiandola pituitaria come base, i nervi trigemino come lati e il chiasma ottico come vertice.

Circondare la ghiandola con le punte delle pinze chiuse per rompere la meninga circostante. Quindi, utilizzando una pinza fine, afferrare l'ipofisi dalla cella di Turca e metterla in un tubo di plastica su ghiaccio secco. Per una preparazione, raccogli 300 ghiandole pituitarie di topo.

Questa raccolta richiede circa nove ore di lavoro. Una volta completata la raccolta, conservare le ghiandole pituitarie a meno 80 gradi Celsius fino a quando non saranno necessarie. Metti un tubo Falcon da 15 millilitri in un bagno di ghiaccio.

Aggiungere alla provetta 250 microlitri di tampone di omogeneizzazione. Per ogni 100 ipofisi raccolti appena prima dell'omogeneizzazione, aggiungere le ghiandole pituitarie del topo al tampone. Successivamente, posizionare la punta dell'omogeneizzatore poly tron, un generatore di cinque millimetri di diametro, sul fondo del tubo Falcon contenente l'ipofisi del topo e omogeneizzare il tampone alla massima velocità per 30 secondi.

Muovendo delicatamente il tubo su e giù mantenendolo sul ghiaccio. Quindi far riposare l'omogeneizzato sul ghiaccio per un minuto. Ripetere le fasi di omogeneizzazione e raffreddamento altre due volte.

Questa delicata omogeneizzazione dovrebbe rompere le cellule e rilasciare le proteine senza rompere i nuclei della centrifuga. L'omogenato a bassa velocità, circa 1000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per sedimentare, i nuclei, il tessuto ininterrotto e i materiali insolubili come il tessuto connettivo e i complessi proteici denaturati. Facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Trasferisci l'SNA, ora chiamato stato post-nucleare o PNS, in un nuovo deposito di tubi Falcon. I PNS su ghiaccio ritraggono il pellet utilizzando lo stesso volume di tampone di omogeneizzazione di prima, omogeneizzano e centrifugano come prima. Dopo aver raggruppato i due campioni PNS, eloqua la soluzione in numerose provette per microcentrifuga.

Conservare le provette per microcentrifuga a meno 80 gradi Celsius fino a quando non saranno necessarie. Questo preparato proteico è stabile a meno 80 gradi Celsius, ma perde gradualmente la sua potenza. Pertanto, si consiglia di utilizzarlo entro sei mesi dalla preparazione.

Conservare una piccola aliquota di PNS per determinare la resa e la concentrazione proteica mediante il saggio dell'acido biy. Quindi determinare la qualità della proteina mediante elettroforesi su gel da 300 ghiandole pituitarie di topo, che hanno un peso totale medio di circa 570 milligrammi. Aspettatevi una resa di 60 milligrammi di proteine ipofisarie o un milligrammo di proteine per ogni 10 milligrammi di tessuto.

La concentrazione proteica è in genere di circa 40 milligrammi per millilitro. L'esempio fornito qui è per l'immunizzazione di 10 topi. Pianifica di iniettare ogni topo con 100 microlitri di emulsione contenente un milligrammo di proteina ipofisaria, consentendo due topi in più per perdite di materiale durante la preparazione qui, vengono preparati 12 milligrammi di emulsione proteica.

Inizia scongelando rapidamente le aliquote proteiche congelate riscaldandole tra le mani. Regolare la concentrazione proteica a 20 milligrammi per millilitro con PBS. Successivamente, aspirare 600 microlitri dell'estratto proteico ipofisario corrispondente a 12 milligrammi in una siringa di Gas Tite Hamilton da 2,5 millilitri di risospensione, adiuvante FRONS completo o CFA contenente cinque milligrammi per millilitro di micobatterio tubercolosi ucciso dal calore agitandolo manualmente.

Quindi aspirare 600 microlitri di CFA in un'altra siringa Hamilton da 2,5 millilitri. Collegare e fissare un ago microemulsionante calibro 22 alla siringa riempita di CFA. Spingere lentamente lo stantuffo in modo che l'ago sia riempito di CFA.

Quindi collegare e fissare l'altra estremità dell'ago all'altra siringa riempita con estratto di proteina ipofisaria. Evitare di intrappolare bolle d'aria all'interno delle siringhe. Far avanzare lentamente lo stantuffo della siringa CFA per spingere il componente dell'olio nell'estratto acquoso dell'ipofisi in modo che ne venga miscelata solo una piccola quantità.

Quindi spingere indietro lo stantuffo della siringa per estratto ipofisario nella siringa CFA. Ripetere questa azione per aumentare gradualmente la quantità di materiale miscelato fino a quando l'intero contenuto non è miscelato. Questo materiale biancastro e uniformemente distribuito rappresenta l'emulsione di acqua e olio.

Una volta formata l'emulsione, ripetere l'intero ciclo avanti e indietro almeno 500 volte dopo il ciclo finale, le siringhe conterranno un'emulsione di acqua e olio uno a uno in cui la concentrazione di proteine ipofisarie è ora di 10 milligrammi per millilitro. L'emulsione è pronta per l'uso per testare la qualità dell'emulsione con una goccia di essa in un becher d'acqua. Se l'emulsione è preparata correttamente, la goccia rimarrà compatta e aderente in superficie.

Se l'emulsione è di scarsa qualità, si diffonderà e si dividerà in gocce più piccole. L'emulsione viene iniettata lo stesso giorno della sua preparazione in topi SJL per indurre un'ipofisite autoimmune sperimentale. Questo protocollo è dettagliato nel jo allegato di verticale.

Una volta raccolta la ghiandola di pitu e padroneggiate le tecniche, si può eseguire l'istruzione proteica in un'ora, ricordandosi di lavorare sul digiuno e sul ghiaccio. Durante questa fase, durante la preparazione dell'immersione, che richiede circa un'ora. Ricordarsi di lavorare lentamente e pazientemente nella fase iniziale di miscelazione Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per esplorare i meccanismi attraverso i quali i linfociti autoreattivi riconoscono e si infiltrano nell'organo bersaglio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di tutto come preparare un estratto proteico dalla ghiandola pituitaria del topo e come mescolarlo con quelli aju di Crohn per preparare un'emulsione pronta per essere utilizzata come immunogeno. Non dimenticare che lavorare con siringhe e quelle complete per l'influenza, che contengono tubercolosi microbatterica inattivata e secca, può essere pericoloso se ti pungi accidentalmente.

Quindi usa sempre i bagliori G e smaltisci correttamente gli aghi durante l'esecuzione di questa procedura.