Name: Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri come indurre ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL mediante iniezione di immunogeno ipofisario e valutarne la gravità con analisi istopatologica. Questo modello animale replica fedelmente le caratteristiche della malattia umana.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DK080351 a PC, e da una generosa donazione della famiglia Terry e Kristine Gore.

Protocollo sperimentale Una volta che il immunogeno pituitaria è pronto (vedi articolo correlato), è iniettata per via sottocutanea in topi SJL (I Laboratori Jackson, fotografia di 000.686). Una seconda iniezione identico si ripete 7 giorni dopo. I topi sono poi utilizzati per raccogliere in vivo e post mortem risultati. Fase 1. L&#39;iniezione sottocutanea di immunogeno pituitaria in topi SJL I topi sono prima anestetizzati iniettando 0,5 ml di 20 mg / ml di 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin, TCI America, T-1420) per via intraperitoneale. I topi sono poi iniettata per via sottocutanea con 100 microlitri della emulsione pituitaria che, come indicato nella compagno JOVE articolo 2181, contiene 1 mg di estratto di ipofisi e 0,25 mg di adiuvante completo di Freund. L&#39;emulsione viene iniettato nella regione dorsale sinistra zampa posteriore ((50 mL) e la regione inguinale destra (50 mL). L&#39;emulsione pituitaria viene iniettato di nuovo il giorno 7 nei siti opposto (50 ml nella regione dorsale destra zampa posteriore e 50 microlitri nella regione inguinale sinistra). topi sono monitorati giornalmente per i primi 3 giorni e poi ogni settimana fino al giorno del sacrificio, che in genere 28 giorni dopo la prima immunizzazione. Fase 2. Raccolta dei risultati in vivo: test del sangue Il tessuto più comunemente usato per valutare i risultati sperimentali, mentre i topi sono ancora in vita è il sangue. Il sangue è di routine redatto 14 giorni dopo la prima immunizzazione per misurare i livelli sierici di anticorpi anti-ipofisi o altri indicatori come citochine e chemochine. Il sangue viene raccolto da topi vivi come segue. I topi sono tenute saldamente per la collottola del collo e la parte posteriore del mascellare si trova. Una volta che la parte posteriore della mandibola si trova, 4 lancette mm utilizzato per forare il fascio vascolare sottomandibolare. Dopo il sangue viene raccolto, la pressione sul posto sulla zona con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol per evitare un ematoma. Sangue raccolto viene centrifugato a 2.000 g per 20 minuti, e conservati a -80 ° C fino al momento. Fase 3. Raccolta di post-mortem risultati: ipofisari istopatologia I topi sono generalmente sacrificati 28 giorni dopo la prima immunizzazione. La funzione cardinale necessarie per stabilire la diagnosi di EAH è l&#39;infiltrazione della ghiandola pituitaria da ematopoietiche cellule mononucleate. I topi sono eutanasia mettendoli in una camera di plastica sigillata che viene perfuso con CO 2. I topi sono tenuti in camera per un totale di 8 minuti. Dopo l&#39;eutanasia, la ghiandola pituitaria è raccolto come descritto nell&#39;articolo compagno. Una ghiandola pituitaria malato appare gonfio e più saldamente aderente al mater circostante dura. Pinze taglienti sono utilizzati per allentare le meningi che circondano la ghiandola pituitaria. Una volta che l&#39;ipofisi si muove liberamente sul sfenoide, un capo della ghiandola pituitaria è afferrato con una pinza e la ghiandola pituitaria è alzato attentamente. La ghiandola viene poi posto in una provetta contenente 5 fissativo Beckstead è. La ghiandola pituitaria è fisso durante la notte, avvolto in carta per lenti, e posto in una cassetta. Le ghiandole vengono poi elaborati utilizzando il seguente protocollo: <table border="1"><tbody><tr><td> Numero stazione </td><td> Reagente </td><td> Tempo in minuti </td><td> Temperatura (Celsius) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 70% di alcol </td><td> 5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 70% di alcol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95% di alcol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 95% di alcol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100% di alcol </td><td> 15 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 100% di alcol </td><td> 7,5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 100% di alcol </td><td> 7,5 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> xilene </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> xilene </td><td> 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> xilene </td><td&gt; 20 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> paraffina </td><td> 30 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> paraffina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 13 </td><td> paraffina </td><td> 5 </td><td> 58 </td></tr></tbody></table> Dopo l&#39;elaborazione, ipofisi sono inclusi in paraffina e di almeno 5 sezioni non consecutivi (5-micron di spessore) sono tagliati da ogni ghiandola. Dopo sezionamento, le ghiandole sono colorate con ematossilina ed eosina, e analizzati per quantificare l&#39;infiltrazione mononucleare. La sezione con l&#39;infiltrazione più grave è stato selezionato per il punteggio. La gravità è segnato sulla base di una valutazione soggettiva del grado di sostituzione anteriore dell&#39;ipofisi o distruzione da parte delle cellule immunitarie: grado 0, nessuna malattia, di grado 1, 2% -20% coinvolgimento, grado 2, 20% -30%, grado 3, 30% -50%, di grado 4, il 50% -90%; grado 5, superiore al 90%. Tutte le sezioni sono segnati da due individui accecati alla fonte delle sezioni.

<ol><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice%3A+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. , (2008).</li>
<li>Twarog, F. J., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+thyroid+autoantibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The production of thyroid autoantibodies in mice.</a> J Immunol. 101, 242-2450 (1968).</li>
<li>Patrick, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+response+to+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune response to acetylcholine receptor.</a> Science. 180, 871-872 (1973).</li>
<li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hypophysitis%3A+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen%28s%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li>
<li>Beckstead, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+preservation+of+fixation-sensitive+antigens+in+paraffin-embedded+tissues%3A+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum.</a> J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergic+adenophypophysitis%3A+new+experimental+disease+of+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland.</a> Science. 158, 1190-1191 (1967).</li>
<li>Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+organ-specific+autoimmune+disease%2C+lymphocytic+hypophysitis%2C+in+hamsters+by+recombinant+rubella+virus+glycoprotein+and+prevention+of+disease+by+neonatal+thymectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy.</a> Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).</li>
<li>Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+the+ovine+pituitary+gland+is+associated+with+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis.</a> J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).</li>
<li>Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenohypophysitis+in+rat+pituitary+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Adenohypophysitis in rat pituitary allografts.</a> Int J Exp Pathol. , (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Quattro tecniche sono stati segnalati per indurre ipofisite negli animali da esperimento. La tecnica descritta in questo articolo, che è l&#39;iniezione di proteine ​​pituitaria miscelati con adiuvante di Freund s, è il più antico, risalente al 1967 6, ed è stata migliorata più di recente 1. Altre tecniche sono l&#39;iniezione di glicoproteine ​​solubili virus della rosolia nel 1992 7, l&#39;iniezione stereotassica di un adenovirus direttamente nella ghiandola pituitaria nel 2002 8,...

<table><tbody><tr><td>Topi SJL (The Jackson Laboratories)</td><td></td><td>stock 000686</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;etanolo (Avertin)</td><td>TCI America</td><td>T-1420</td><td></td></tr><tr><td>Fissativo di Beckstead&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi sjl

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Ipofisite autoimmune può essere riprodotto sperimentalmente mediante l&#39;iniezione di proteine ​​pituitaria mescolato con un adiuvante in topi suscettibili 1. Modelli murini ci permettono di studiare come le malattie si svolgono, spesso fornendo una buona replica degli stessi processi che si verificano negli esseri umani. Per alcune malattie autoimmuni, come il diabete di tipo 1A, ci sono modelli (il topo NOD) che sviluppano spontaneamente una malattia simile alla controparte umana. Per molte altre malattie autoimmuni, invece, il modello deve essere indotta sperimentalmente. Un approccio comune su questo punto è quello di iniettare il mouse con un antigene dominante deriva dal organo oggetto di studio. Per esempio, i ricercatori interessati alla tiroidite autoimmune iniettare topi con tireoglobulina 2, e coloro che sono interessati miastenia gravis loro iniettare con il recettore dell&#39;acetilcolina 3. Se l&#39;autoantigene per una particolare malattia autoimmune non è noto, gli investigatori iniettare un estratto grezzo di proteine ​​dal organo bersaglio della reazione autoimmune. Per ipofisite autoimmune, l&#39;autoantigene patogeni (s) devono ancora essere identificati 4, e quindi una preparazione in proteine ​​gregge pituitaria è utilizzato. In questo articolo video che dimostrano come indurre ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL.

Questo video mostra come per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL e come valutare la sua gravità per via istopatologica.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

L'ipofisite autoimmune può essere riprodotta sperimentalmente mediante l'iniezione di proteine ipofisarie miscelate con un adiuvante in topi suscettibili1. I topi...

L'ipofisite autoimmune è caratterizzata da un ingrandimento della ghiandola pituitaria e da una carenza di uno o più ormoni ipofisari. Gli autoantigeni responsabili rimangono sconosciuti. Un video allegato illustra un protocollo per la preparazione di un immunogeno pituitario murino, che verrà utilizzato qui per creare un modello murino simile all'ipofisite linfocitaria autoimmune umana.Alla ceppa di topo suscettibile viene iniettato l'immunogeno ipofisario. Successivamente, l'iniezione viene ripetuta sette giorni dopo; dopo 14 giorni, viene prelevato il sangue per studi sui biomarcatori. Al giorno 28, le ghiandole ipofisarie vengono prelevate da topi sacrificati, sezionate e colorate per determinare l'entità dell'infiltrazione di leucociti.L'ipofisite autoimmune è una malattia sempre più riconosciuta che può risultare difficile da distinguere da altre masse non secernenti ormoni che insorgono nella sella turcica. Sebbene la malattia sia stata descritta per la prima volta circa 50 anni fa, gli autoantigeni riconosciuti dal sistema immunitario del paziente nell'ipofisite autoimmune sono rimasti elusive. Nel 2008, abbiamo pubblicato lo sviluppo di un modello murino che riproduce in modo molto accurato la malattia umana che era stato progettato per imitare.Questo modello murino può essere utilizzato per identificare gli autoantigeni ipofisari coinvolti e per approfondire la patogenesi e le evoluzioni naturali dell'ipofisite. Il modello si basa sull'iniezione di proteine ipofisarie di topo in una ceppo suscettibile come il ceppo SJL. Queste proteine devono essere mescolate con un adiuvante potente al fine di creare un ambiente infiammatorio locale che alla fine induca la comparsa di linfociti autoreattivi ipofisari.Prima nei linfonodi che drenano il sito di iniezione e successivamente nell'ipofisi. Il modello richiede l'iniezione di quantità relativamente elevate di proteine ipofisarie, per un totale di due milligrammi per topo. Ciò suggerisce che l'autoantigene o gli autoantigeni nascosti siano presenti in quantità minime all'interno della ghiandola della fertilità. L'iniezione di un adiuvante opportunamente preparato è fondamentale per l'induzione della malattia, poiché determina un rilascio lento e continuo di proteine ipofisarie nei siti di iniezione, favorendo infine la generazione e l'attivazione di linfociti specifici per l'ipofisi.Nel video allegato, viene presentato un metodo per la preparazione dell'immunogeno ipofisario. Le ghiandole pituitarie isolate da topi sacrificati vengono omogeneizzate e chiarificate mediante centrifugazione a bassa velocità. La miscela proteica viene valutata quantitativamente mediante saggio colorimetrico BCA e qualitativamente mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide.L'omogenato proteico acquoso viene quindi mescolato con un adiuvante oleoso contenente bacilli di Mycobacterium tuberculosis inattivati per produrre l'emulsione pituitaria. Dopo aver preparato l'emulsione come mostrato nel video correlato, rimuovere l'ago microemulsionante dalla siringa da un millilitro e applicare un ago da 25 gauge. Sono necessari 100 microlitri di emulsione pituitaria per ogni topo da iniettare.Dopo aver anestetizzato un topo con Everton, accertarsi che non vi sia alcuna risposta alla pressione sulle dita dei piedi, quindi iniettare 50 microlitri dell'emulsione per via sottocutanea nella regione posteriore dorsale della zampa sinistra. Assicurarsi che la punta dell'ago sia completamente sotto la pelle e che nessuna emulsione fuoriesca dal sito di iniezione. Successivamente, iniettare 50 microlitri nella regione inguinale destra.Anche in questo caso, assicurarsi che nulla fuoriesca. Notare che l'emulsione è di colore biancastro e può essere difficile da distinguere sullo sfondo bianco del pelo del topo SGL L dopo l'iniezione. Restituire il topo nella sua gabbia e monitorarne il recupero.Monitorare i topi iniettati quotidianamente per i primi tre giorni successivi all'iniezione per assicurarsi che non si verifichino situazioni di grave sofferenza. L'adjuvante è pro-infiammatorio poiché contiene Mycobacterium tuberculosis inattivato. Sette giorni dopo, ripetere l'iniezione sui lati anatomici opposti.Iniettare 50 microlitri nella regione della zampa dorsale posteriore destra e 50 microlitri nella regione inguinale sinistra. Monitorare il topo come in precedenza, poiché i risultati sperimentali verranno valutati dopo che si sarà verificata una risposta immunitaria. Il sangue è il tessuto più comunemente utilizzato per valutare gli esiti sperimentali mentre i topi sono ancora vivi.Il sangue viene prelevato di routine 14 giorni dopo la prima immunizzazione per misurare i livelli sierici di anticorpi contro l'ipofisi o altri marcatori come citochine e chemochine. Per raccogliere il sangue da un topo vivo, tenere saldamente l'animale per la nuca e individuare la parte posteriore della mandibola. Una volta identificata con precisione questa sede, pungere il fascio vascolare sottomandibolare con una lancetta da quattro millimetri.Il sangue inizierà a fuoriuscire dalla zona perforata. Raccogliere sei gocce di sangue in una provetta per microcentrifuga. Pulire la zona perforata con un tovagliolo di carta bagnato per arrestare l'emorragia.Posizionare i tubi del sangue in una centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 2000 G per 20 minuti. Questa centrifugazione separa le cellule del sangue, che si ritroveranno nel pellet, dal siero snat. Trasferire il siero in un nuovo tubo da microcentrifuga.Conservare il siero a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Ci vogliono circa un mese perché i topi immunizzati sviluppino un'ipofisite autoimmune completa. Pertanto, i topi vengono generalmente sacrificati 28 giorni dopo la prima immunizzazione.Dopo aver tagliato il cranio, sollevare il cervello e capovolgerlo all'indietro per esporre la ghiandola pituitaria. Una ghiandola pituitaria malata appare gonfia e aderente in modo più marcato alle meningi circostanti. Muovere la punta di una pinzetta fine attorno alla ghiandola pituitaria per staccare le meningi.Una volta che l'ipofisi si muove liberamente su questo osso fen, afferrare un'estremità della ghiandola con una pinzetta ed estrarla con cura da questo osso fen. Posizionare il tessuto in una provetta per microcentrifuga contenente un millilitro di soluzione bettata, un fissativo a base di zinco, e fissare la ghiandola tutta la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, trasferire l'ipofisi su un pezzo di carta per lenti.Avvolgere la ghiandola pituitaria nella carta da filtro e posizionarla in una cassetta per istologia. Processare il campione incubandolo in concentrazioni crescenti di alcol e successivamente in xilene dopo il trattamento. Rimuovere la carta da filtro e posizionare l'ipofisi in uno stampo metallico.Quindi coprire l'ipofisi con paraffina. Posizionare la capsula per tessuti in cima allo stampo e riempirla con ulteriore paraffina. Infine, appoggiare l'insieme sul ghiaccio per far solidificare la paraffina.Una volta che la paraffina si è solidificata, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni spesse cinque micron. Raccogliere le sezioni su un vetrino in vetro. Raccogliere almeno cinque sezioni non consecutive sullo stesso vetrino da ciascuna ghiandola pituitaria di topo.Colorare i vetrini con ematossilina ed eosina utilizzando una stazione automatizzata per la colorazione dei tessuti. Esaminare i vetrini al microscopio ottico per raccogliere i risultati. La caratteristica principale di una ghiandola pituitaria che ha sviluppato un'ipofisite è l'infiltrazione da linfociti, che appaiono come piccole cellule blu che si diffondono attraverso il parenchima pituitario in modo isolato o formando aggregati.I linfociti sono associati a vari gradi di distruzione delle normali cellule endocrine dell'ipofisi. La sezione con l'infiltrazione linfocitaria più grave e la distruzione della ghiandola pituitaria viene scelta per la valutazione da due ricercatori a conoscenza cieca delle condizioni sperimentali. La valutazione si basa su una stima soggettiva dell'entità del danno.Un punteggio pari a zero indica una ghiandola pituitaria normale oppure la presenza rara di linfociti e altre cellule mononucleate ematopoietiche. Un punteggio pari a uno indica che l'infiltrazione mononucleata occupa dal 2 al 20% della superficie totale dell'ipofisi anteriore. Un punteggio pari a due indica che l'infiltrazione mononucleata occupa dal 20 al 30% della superficie totale dell'ipofisi anteriore.Un punteggio di tre indica che l'infiltrazione mononucleare occupa dal 30 al 50% dell'area totale dell'ipofisi anteriore. Un punteggio di quattro indica che l'infiltrazione mononucleare occupa dal 50 al 90% dell'area totale dell'ipofisi anteriore, e un punteggio di cinque indica che l'infiltrazione mononucleare ha occupato quasi l'intera area dell'ipofisi anteriore. Una volta acquisita padronanza, l'iniezione dell'immunogeno in un topo può essere eseguita in 15 minuti.Il prelievo di sangue periferico da un topo può essere eseguito in cinque minuti e la preparazione dei vetrini per l'istopatologia in sei ore, mentre si tenta la procedura di immunizzazione. È importante prestare particolare attenzione alla salute del topo dopo l'anestesia e l'iniezione dell'immunogeno. Oltre all'istopatologia pituitaria.Questa procedura può essere utilizzata per raccogliere una vasta gamma di risultati sperimentali mediante diversi metodi, come la valutazione delle sottopopolazioni linfocitarie nei linfonodi drenanti mediante citometria a flusso. La tecnica di immunizzazione con un estratto tissutale per l'induzione di una malattia autoimmune apre la strada ai ricercatori nel campo dell'autoimmunità per scoprire gli eventi chiave nella patogenesi della malattia. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come immunizzare i topi per indurre un'ipofisite autoimmune sperimentale e di come valutarne l'incidenza e la gravità.Non dimenticare che lavorare con lame microtomiche può essere pericoloso. È sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti e lavorare in condizioni di buona illuminazione.

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