Name: Strategie per lo Studio delle Neuroprotezione dal freddo precondizionamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Scopri le strategie di neuroprotezione mediante precondizionamento al freddo su colture di fette ippocampali di ratto. Questo metodo identifica bersagli terapeutici per prevenire lesioni neurologiche durante anestesia e chirurgia.

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Questo lavoro è stato finanziato dalle concessioni dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke (NS-19.108), la Fondazione di Ricerca Emicrania, e la Fondazione Bianca per Richard P. Kraig. La signora Marcia P. Kraig assistito nella preparazione dei terreni di coltura e manutenzione di culture fetta. Ringraziamo Yelena Grinberg per i suoi commenti e revisioni su una versione finale di questo articolo.

<ol><li>Aptowicz, C. O., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+plasticity+in+hippocampal+slice+cultures+involves+changes+in+voltage-gated+Na%2B+channel+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Homeostatic plasticity in hippocampal slice cultures involves changes in voltage-gated Na+ channel expression.</a> Brain Res. 998, 155-163 (2004).</li>
<li>Beattie, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synaptic+strength+by+glial+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synaptic strength by glial TNFalpha.</a> Science. 295, 2282-2285 (2002).</li>
<li>Breder, C. D., Dewitt, D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+inducible+cyclooxygenase+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characterization of inducible cyclooxygenase in rat brain.</a> J Comp Neurol. 355, 296-315 (1995).</li>
<li>Caggiano, A. O., Breder, C. D., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+elevation+of+cyclooxygenase-2%2C+but+not+lipoxygenase%2C+in+regions+synaptically+distant+from+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Long-term elevation of cyclooxygenase-2, but not lipoxygenase, in regions synaptically distant from spreading depression.</a> J Comp Neurol. 376, 447-462 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eicosanoids+and+nitric+oxide+influence+induction+of+reactive+gliosis+from+spreading+depression+in+microglia+but+not+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Eicosanoids and nitric oxide influence induction of reactive gliosis from spreading depression in microglia but not astrocytes.</a> J Comp Neurol. 369, 93-108 (1996).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+and+4-aminopyridine+prevent+the+lipopolysaccharide-induced+outwardly+rectifying+potassium+current+and+interleukin-1beta+production+in+cultured+rat+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 and 4-aminopyridine prevent the lipopolysaccharide-induced outwardly rectifying potassium current and interleukin-1beta production in cultured rat microglia.</a> J Neurochem. 70, 2357-2368 (1998).</li>
<li>Caggiano, A. O., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E+receptor+subtypes+in+cultured+rat+microglia+and+their+role+in+reducing+lipopolysaccharide-induced+interleukin-1beta+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E receptor subtypes in cultured rat microglia and their role in reducing lipopolysaccharide-induced interleukin-1beta production.</a> J Neurochem. 72, 565-575 (1999).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+therapies+for+stroke+and+traumatic+brain+injury+often+display+U-shaped+dose+responses%3A+occurrence%2C+mechanisms%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Drug therapies for stroke and traumatic brain injury often display U-shaped dose responses: occurrence, mechanisms, and clinical implications.</a> Crit Rev Toxicol. 38, 557-577 (2008).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+stress+response+terminology%3A+Integrating+the+concepts+of+adaptive+response+and+preconditioning+stress+within+a+hormetic+dose-response+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Biological stress response terminology: Integrating the concepts of adaptive response and preconditioning stress within a hormetic dose-response framework.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 222, 122-128 (2007).</li>
<li>Calabrese, E. J., Baldwin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis%3A+the+dose-response+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis: the dose-response revolution.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 175-197 (2003).</li>
<li>Hansel, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD4%2B+T-cell+gene+expression+in+allergic+subjects+using+two+different+microarray+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD4+ T-cell gene expression in allergic subjects using two different microarray platforms.</a> Allergy. 63, 366-369 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Kunkler, P. E., Fedynyshyn, J. P., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+bead-based+cytokine+immunoassays+for+rat+serum+and+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 136, 87-98 (2004).</li>
<li>Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+IgG+is+neuroprotective+via+enhancing+microglial+recycling+endocytosis+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-alpha.</a> J Neurosci. 28, 12199-12211 (2008).</li>
<li>Hulse, R. E., Winterfield, J., Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+clasmatodendrosis+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic clasmatodendrosis in hippocampal organ culture.</a> Glia. 33, 169-179 (2001).</li>
<li>Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+and+Microglial+Hormetic+Involvement+in+Neurological+Health+and+Migraine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dose-Respose+Society%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha and Microglial Hormetic Involvement in Neurological Health and Migraine.</a> International Dose-Respose Society. , (2010).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+cytokine+protein+expression+profiles+from+spreading+depression+in+hippocampal+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Multiplexed cytokine protein expression profiles from spreading depression in hippocampal organotypic cultures.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 24, 829-839 (2004).</li>
<li>Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+current+source+density+analysis+in+hippocampal+organotypic+culture+shows+that+spreading+depression+occurs+with+uniquely+reversing+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents.</a> J Neurosci. 25, 3952-3961 (2005).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytosis+from+excitotoxic+injury+in+hippocampal+organ+culture+parallels+that+seen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytosis from excitotoxic injury in hippocampal organ culture parallels that seen in vivo.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 17, 26-43 (1997).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+precede+electrophysiological+changes+of+spreading+depression+in+hippocampal+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium waves precede electrophysiological changes of spreading depression in hippocampal organ cultures.</a> J Neurosci. 18, 3416-3425 (1998).</li>
<li>Kunkler, P. E., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%2FQ+Ca2%2B+channel+blockade+stops+spreading+depression+and+related+pyramidal+neuronal+Ca2%2B+rise+in+hippocampal+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">P/Q Ca2+ channel blockade stops spreading depression and related pyramidal neuronal Ca2+ rise in hippocampal organ culture.</a> Hippocampus. 14, 356-367 (2004).</li>
<li>Lambertsen, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+protect+neurons+against+ischemia+by+synthesis+of+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia protect neurons against ischemia by synthesis of tumor necrosis factor.</a> J Neurosci. 29, 1319-1330 (2009).</li>
<li>Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormesis+and+disease+resistance%3A+activation+of+cellular+stress+response+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Hormesis and disease resistance: activation of cellular stress response pathways.</a> Hum Exp Toxicol. 27, 155-162 (2008).</li>
<li>Ning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+simultaneous+gene+profiling+of+84+drug-metabolizing+genes+in+primary+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Systematic and simultaneous gene profiling of 84 drug-metabolizing genes in primary human hepatocytes.</a> J Biomol Screen. 13, 194-201 (2008).</li>
<li>Oppenheim, J., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOppenheim%2C+J+%22in+Cytokine+Reference%22">in Cytokine Reference</a>. Oppenheim, J. J., Feldman, M. 1, Academic. New York. (2001).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45-e45 (2001).</li>
<li>Stellwagen, D., Beattie, E. C., Seo, J. Y., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+and+GABA+receptor+trafficking+by+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha.</a> J Neurosci. 25, 3219-3228 (2005).</li>
<li>Stellwagen, D., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+mediated+by+glial+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling mediated by glial TNF-alpha.</a> Nature. 440, 1054-1059 (2006).</li>
<li>Streit, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+neuroprotective%2C+immunocompetent+cells+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS.</a> Glia. 40, 133-139 (2002).</li>
<li>Wilde, G. J., Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Mann, D. A., Iannotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+augmentation+of+ischaemia-related+neuronal+death+by+tumour+necrosis+factor-alpha+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attenuation and augmentation of ischaemia-related neuronal death by tumour necrosis factor-alpha in vitro.</a> Eur J Neurosci. 12, 3863-3870 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Due concetti di fondamentale importanza importante per delineare il sistema di segnalazione delle citochine coinvolte nel freddo precondizionamento neuroprotezione sono illustrati nelle figure 6 e 7. In primo luogo, le citochine sono estremamente basse concentrazioni delle molecole di segnalazione nel cervello normale. Tuttavia, i cambiamenti fisiologici concentrazione delle citochine hanno un immenso potenziale di alterare la struttura del cervello e della funzione (ad esempio, fenotipo) a causa della loro capacità di alterare l'espressione genica (Figura 6). Inoltre, le citochine sono altamente ridondanti e pleiotropici in più che le citochine possono avere effetti simili e una citochina singolo può avere diversi effetti (Figura 7). Quindi, per stabilire con precisione l'innata citochine basi per la neuroprotezione da freddo precondizionamento (o altri stimoli fisiologici precondizionamento), un'analisi composita di variabili relative segnalazioni devono essere determinati. Questo si realizza attraverso strategie di test multiplex. Questo stabilirà la "firma" di citochine freddo precondizionamento neuroprotezione. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Potere di segnalazione al cervello citochine. Le illustrazioni trasmettere l'immenso potere di segnalazione di concentrazioni fisiologiche di citochine cervello rispetto alle concentrazioni di altri ben riconosciuto controparti. La concentrazione è rappresentato come l'inverso della distanza, iniziando con un baffo di gatto solo come punto di riferimento. Di sodio (10 -1 M illustrato da un grano di pepe) e potassio (10 m -3 illustrato da un pomodoro) sono presenti nello spazio interstiziale del cervello a livelli di circa 150 e di 3 mm, rispettivamente, e sono ben noti i ruoli in la funzione delle cellule neurali elettrofisiologiche. Allo stesso modo, il pH (ad esempio, ~ 10 -7 M livelli di ioni di idrogeno e illustrato come 780 metri lungo il lungolago di Chicago) e calcio (per esempio, ~ 10 -8 M mostrato come i livelli di 7,8 km visto da un'immagine satellitare di Google lungo il lungolago di Chicago da McCormick Luogo di Promontory Point a Hyde Park vicino l'Università di Chicago). Inoltre, i neurotrasmettitori liberati nello spazio interstiziale su queste concentrazioni locali di influenzare l'attività regione del cervello. Al contrario, le citochine (mostrato come la distanza dalla Terra a Marte) può alterare la funzione del cervello a concentrazioni più di dieci milioni di volte di meno. <img src="/files/ftp_upload/2192/2192fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Segnalazione di percorsi interattivi citochine innate. Citochine sono altamente ridondanti e pleiotropici in più che le citochine possono avere effetti simili e una citochina singolo può avere diversi effetti. Tale diversità deriva dal complesso di segnalazione interattivo che avviene a livello di ligandi, recettori e fosfoproteine. Ulteriore complessità deriva dal fatto che il cervello è costituito da diversi tipi di cellule, ognuna capace di cellule specifiche citochine innate, recettori e cambiamenti fosfoproteina correlati. Per scopi illustrativi qui, solo citochine innata vie di segnalazione (derivati ​​da studi sulle cellule immunitarie) sono mostrati. Per semplicità, il cervello è disegnata come una singola cellula (linea bianca) che mostra le interazioni innato potenziale di citochine (IL-1α e IL-1β (di cui qui come IL-1α / β), TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-10), i recettori (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR, e IL-10R), e fosfoproteine ​​(cioè chinasi ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) e JNK) e fattori di trascrizione (ATF-2, NFκB e STAT3). Per esempio, il TNF-α segnali via TNFR1 di JNK, p38-MAPK e ERK1 / 2, che attiva l'espressione genica tramite ATF-2. TNF-α altera anche l'espressione genica direttamente attraverso l'attivazione NFκB. Insieme, l'attivazione di questi fattori di trascrizione evocano un aumento (freccia) e diminuito (punta smussata) espressione di citochine e loro recettori come indicato. È importante sottolineare che queste vie mostrano che i cambiamenti in una citochina (ad esempio, TNF-α) influenza la produzione di altri (ad esempio, IL-1β) citochine. Quindi, per stabilire con precisione la citochina basi per la neuroprotezione da freddo precondizionamento, un'analisi composita di variabili legate segnalazione deve essere determinato. Questo stabilirà la innata citochine "firma" di freddo precondizionamento. (Immagine è stato compilato a partire dai dati di riferimento # 25.)

Preparazione delle Culture Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Millicell-CM inserti in tessuto della cultura (30 mm) </td><td> Thermo Fisher </td><td> PICM0-3050 </td><td></td></tr><tr><td> Basale medio Aquila </td><td> Invitrogen </td><td> 21010 </td><td></td></tr><tr><td> Sale Earle s soluzione equilibrata </td><td> Sigma </td><td> E2888 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15295 </td><td></td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td><td></td></tr><tr><td> BSL-1 cappa </td><td> Panettiere </td><td></td><td></td></tr><tr><td> McIlwain tessuto chopper </td><td> Brinkmann </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Teflon dischi </td><td> Brinkmann </td><td> 023-49-310-1 </td><td></td></tr><tr><td> Spatola </td><td> Thermo Fisher </td><td> 14-373-25A </td><td></td></tr><tr><td> Curvo iride forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14091-09 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici lungo rettilineo </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 14002-14 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze lunghe </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-40 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze ad angolo </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11808-02 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe breve </td><td> Thermo Fisher </td><td> 13-812-38 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 Inox forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Iris spatole </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10094-13 </td><td></td></tr><tr><td> 150 x 15 mm Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-148 </td><td></td></tr><tr><td> 60 x 15 mm Petri </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-757-100B </td><td></td></tr><tr><td> Selvatico M8 stereomicroscopio </td><td> Selvatico Heerbrugg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Equilibrio Gey s soluzione salina </td><td> Sigma </td><td> G9779 </td><td></td></tr><tr><td> Blak-Ray onde corte Ultraviolet metro di misura </td><td> UVP </td><td> J-225 </td><td></td></tr><tr><td> 6-bene Falcon cultura piatti </td><td> Thermo Fisher </td><td> 08-772-1B </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103</td><td></td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Gem21 Neuroplex </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 400-160-010 </td><td></td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> Analizzatore di CO 2 </td><td> Bacharach </td><td> # 2820 </td><td></td></tr></tbody></table> Pre-screening per la vitalità delle culture per Slice <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td></td></tr><tr><td> DMIBRE microscopio invertito </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> A freddo di precondizionamento <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> BSL-2 cappa </td><td> NuAire </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Lesioni eccitotossico <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> CoolSnap fx telecamera CCD </td><td> Fotometrici </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluoroscein </td><td> Invitrogen </td><td> F36915 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph software </td><td> Molecular Devices </td><td> v. 7.5.04 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micron emocitometro profondo </td><td> Hausser scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> N-metil-D-aspartato </td><td> Calbiochem </td><td> 454575 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaStat software </td><td> Systat Software Inc. </td><td> v. 3.5 </td><td></td></tr></tbody></table> Co-trattamenti applicati con freddo Precondizionamento <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> sTNFR1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 425-R1-050 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td><td></td></tr></tbody></table> RNA Isolation <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> ATER RNAl </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Kit RNeasy </td><td> Qiagen </td><td> 74004 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Pescatore </td><td> 03446-100 </td><td></td></tr><tr><td> Diposable 1,5 RNasi-free Pestello </td><td> South Jersey utensili di precisione e stampi, Inc. </td><td> 749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> RNasin </td><td> Promega </td><td> N261A </td><td></td></tr><tr><td> Tris [idrossimetil] amminometano </td><td> Sigma </td><td> T3069 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (acido etilendiamminotetracetico sale disodico idrato </td><td> Sigma </td><td> # E7889 </td><td></td></tr></tbody></table> Quantificazione dell&#39;RNA <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> RiboGreen Assay </td><td> Invitrogen </td><td> R11491 </td><td></td></tr><tr><td> Lievito tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> Provette 1,5 ml </td><td> USA scientifico </td><td> 16155500 </td><td></td></tr><tr><td> 96-pozzetti test di fluorescenza </td><td> Nunc </td><td> DK-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ben lettore di piastre a fluorescenza </td><td> Tecan </td><td> Safire II </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitativa <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> iScript kit di trascrizione inversa </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8891 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7563 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq polimerasi </td><td> Invitrogen </td><td> RNA Ultrasense 11732-927 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler termociclatore </td><td> Bio-Rad </td><td> iCycler modulo ottico </td><td></td></tr><tr><td> iCycler sistema software </td><td> Bio-Rad </td><td> v. 3.1 </td><td></td></tr></tbody></table> PCR quantitativa per Microarrays <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> RNasi Lontano </td><td> Bioprodotti molecolare </td><td> # 7000 </td><td></td></tr><tr><td> RT 2 Kit First Strand </td><td> SABiosciences </td><td> C-03 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green PCR mix a base di </td><td> SABiosciences </td><td> PA-011 </td><td> Specifici per iCycler </td></tr><tr><td> RT 2 Profiler PCR Array </td><td> SABiosciences </td><td> Parn-011A </td><td></td></tr></tbody></table> Analisi proteomica <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo/ Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lisi cellulare kit </td><td> Bio-Rad </td><td> 171-304011 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> Micro 7 </td><td></td></tr><tr><td> BSA proteina magazzino </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0007 </td><td></td></tr><tr><td> BCA proteina kit di analisi </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td></td></tr><tr><td> Immuno 96 MicroWell piastre </td><td> Nunc </td><td> 449824 </td><td></td></tr><tr><td> Nastro adesivo </td><td> Bio-Rad </td><td> 2239444 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ben lettore di piastre </td><td> Perkin Elmer </td><td> 1420-mulilabel contatore </td><td></td></tr><tr><td> Bioplex Rat citochina TNF-α test </td><td> Bio-Rad </td><td> X0000001T </td><td></td></tr></tbody></table> Immunocolorazione <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> Alfa Aesar </td><td> 43368 </td><td></td></tr><tr><td> Lisina </td><td> Sigma </td><td> L-6001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio periodato </td><td> Sigma </td><td> S-1878 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S-2002 </td><td></td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno (30%) </td><td> Sigma </td><td> H1009 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Colorado siero Azienda </td><td> CS 0920 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T-8787 </td><td></td></tr><tr><td> Colorazione piatti </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 14511 </td><td></td></tr><tr><td> Piastra Shaker </td><td> Lab-Line Instruments, Inc. </td><td> 3520 </td><td></td></tr><tr><td> # 1 Carte da filtro (185 mm) </td><td> Whatman </td><td> 1001-185 </td><td></td></tr><tr><td> 3,3-diaminobenzidina </td><td> Sigma </td><td> D8001 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xilene </td><td> Fisher Scientific </td><td> X3-4 </td><td></td></tr><tr><td> Permount mezzi di montaggio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SP15-100 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> centimetri 3 050 S </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 27050 </td><td></td></tr><tr><td> Messa a punta di pennello </td><td> Ted Pella </td><td> 11806 </td><td></td></tr><tr><td> PAP penna blocco </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> SFX potenziatore di segnale </td><td> Invitrogen </td><td> A31631 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P7481 </td><td></td></tr></tbody></table>

strategie per lo studio delle neuroprotezione dal freddo precondizionamento

Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Danno neurologico è una causa frequente di morbilità e mortalità da anestesia generale e delle relative procedure chirurgiche che possono essere alleviati dallo sviluppo di un efficace, facile da amministrare e sicura trattamenti precondizionamento. Cerchiamo di definire la segnalazione neurali immunitario responsabile freddo precondizionamento come mezzi per identificare nuovi obiettivi per lo sviluppo di terapie per proteggere il cervello prima di insorgenza lesioni. Basso livello pro-infiammatorie mediatore segnalazione variazioni nel tempo sono essenziali per freddo precondizionamento neuroprotezione. Questa segnalazione è coerente con i principi fondamentali di ormesi condizionata fisiologica, che richiedono che gli stimoli irritativi raggiungere una soglia di grandezza con il tempo sufficiente per l&#39;adattamento agli stimoli per la protezione a diventare evidente. Di conseguenza, la definizione del sistema immunitario coinvolte nella segnalazione freddo precondizionamento neuroprotezione richiede che i sistemi biologici e le manipolazioni sperimentali, più capacità tecniche sono altamente riproducibili e sensibili. Il nostro approccio è quello di utilizzare le culture fetta dell&#39;ippocampo come un modello in vitro che riflette da vicino le loro controparti in vivo con le reti neurali multi-sinaptica influenzato da maturo e quiescenti macroglia / microglia. Questo stato gliale è particolarmente importante per la microglia, poiché sono la principale fonte di citochine, che sono operative nel campo femtomolar. Inoltre, le culture fetta possono essere mantenuti in vitro per diverse settimane, che è il tempo sufficiente ad evocare l&#39;attivazione di stimoli e di valutare le risposte adattative. Infine, le condizioni ambientali possono essere accuratamente controllati utilizzando culture fetta in modo che citochine segnalazione di freddo precondizionamento può essere misurata, imitato, e modulata a sezionare gli aspetti nodo critico. Analisi del sistema di segnalazione delle citochine richiedono l&#39;uso di tecniche di multiplex sensibili e riproducibili. Noi usiamo PCR quantitativa per il TNF-α per lo screening per l&#39;attivazione della microglia seguito da quantitativa in tempo reale lo screening qPCR array per valutare tessuto modifiche a livello di citochine. Quest&#39;ultimo è un mezzo più sensibile e riproducibile per misurare sistema multiplo di citochine segnalazione cambiamenti contemporaneamente. I cambiamenti significativi sono confermati con qPCR mirati e poi il rilevamento delle proteine. Noi sonda per i cambiamenti citochine tessuto a base di proteine ​​mediante citometria a flusso multiplex saggi microsfere utilizzando la tecnologia Luminex. Cell-specifica produzione di citochine è determinato con il doppio marchio di immunoistochimica. Nel loro insieme, questa preparazione tessuto cerebrale e lo stile di utilizzo, unita alle strategie suggerite investigativo, può essere un approccio ottimale per identificare potenziali bersagli per lo sviluppo di nuove terapie che potrebbero imitare i vantaggi del freddo precondizionamento.

Cerchiamo di definire la segnalazione neurali immunitario responsabile freddo precondizionamento come mezzi per identificare nuovi obiettivi per lo sviluppo di terapie per proteggere il cervello prima di insorgenza lesioni. Vi presentiamo le strategie per questi lavori che richiedono sistemi biologici, manipolazioni sperimentali oltre a capacità tecniche che sono altamente riproducibili e sensibili.

Strategie per lo Studio delle Neuroprotezione dal freddo precondizionamento

Il danno neurologico è una causa frequente di morbilità e mortalità associate all'anestesia generale e alle relative procedure chirurgiche, che potrebbe essere attenuata da...

Il danno neurologico è una causa frequente di morbosità e mortalità associata all'anestesia generale. L'obiettivo del lavoro presentato in questo video è esaminare l'effetto del precondizionamento al freddo sulla segnalazione immunitaria neurale nei ratti, al fine di identificare nuovi bersagli terapeutici per la protezione del cervello prima dell'insorgenza del danno. Questo viene ottenuto producendo colture di fette ippocampali di ratti adulti sane e a lunga sopravvivenza.Le colture sono sottoposte a un precondizionamento al freddo per indurre una neuroprotezione di base immunitaria. Successivamente viene aggiunta l'anci tossina e le colture di tessuto a fette vengono analizzate mediante imaging. L'analisi delle immagini suggerisce che il precondizionamento al freddo determina una riduzione drammatica del livello di perdita neuronale selettiva.Mi chiamo Richard Craig, e questa è Heidi Mitchell. Siamo dell'Università di Chicago, del Dipartimento di Neurologia, e oggi vi illustreremo come la preparazione di colture in slice possa essere utilizzata per rispondere a domande riguardanti la neuroprotezione, in particolare coinvolgendo segnali immunitari pro-infiammatori a basso livello come mezzo per rendere il cervello più resistente alle malattie cerebrali. In generale, le persone nuove a questa procedura incontrano difficoltà a causa della necessità di garantire la vitalità a lungo termine e colture sane, in grado di mostrare segnali pro-infiammatori a basso livello.Heidi mostrerà ora una serie di procedure che utilizziamo in laboratorio per superare questi ostacoli, in modo da poter misurare segnali pro-infiammatori a basso livello come strumento per sviluppare neuroprotettori per il cervello. I seguenti esperimenti devono essere eseguiti indossando una camice da laboratorio pulito e guanti sterili infilati sopra le maniche del camice. Iniziare posizionando tutti gli strumenti necessari per la procedura all'interno di una cappa a flusso laminare di livello BSL-1, inclusi un tritatore di tessuti McIlwain con inserti in teflon, una lametta, strumenti chirurgici e piatti di Petri per dissezione.La cappa deve essere posizionata in una stanza di coltura a pressione positiva con filtro HIPAA, in cui l'aria viene purificata da ventilatori autonomi con luce ultravioletta almeno 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti. Posizionare una piastra refrigerata da dissezione all'interno della cappa e collegarla a un bagno termoregolato vicino nella cappa per colture cellulari. Inserire un inserto milli cell in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e aggiungere 1,1 millilitri di mezzo di coltura a ciascuno.Posizionare il vassoio in un incubatore a 36 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per almeno 20 minuti. Mantenere i rattoletti al caldo fino al momento dell'utilizzo posizionandoli sotto una lampada a calore; anestetizzare il rattoletto ponendolo in un'atmosfera di anidride carbonica al 100%. Una volta anestetizzato, immergere il rattoletto in etanolo al 100%, quindi decapitarlo e posizionare il corpo in una capsula di Petri da 100 millimetri e la testa in un'altra.Successivamente, utilizzare forbici curve per iridectomia per aprire il cranio con un'incisione mediana seguita da due tagli laterali a sinistra e a destra dietro gli occhi. Usare pinze angolate per sollevare il cranio sovrastante e una spatola per iniziare a rimuovere il cervello. Estrarre il cervello recidendo i nervi trigemini con la spatola e posizionare il cervello nella metà inferiore di una piastra di Petri da 60 millimetri contenente 10 millilitri di soluzione salina bilanciata sterile fredda arricchita con glucosio.Successivamente, utilizzare la pinzetta n. 5 IOx sotto una spatola d'iride n. 2 per dissezionare gli ippocampi da ciascun emisfero e posizionarli su un disco in teflon per il tagliatore McIlwain. Utilizzando la spatola, allontanare il mezzo dai tessuti cerebrali con il tagliatore impostato su uno spessore di sezione compreso tra 350 e 400 micrometri. Tagliare gli ippocampi perpendicolarmente al loro asse longitudinale con un tagliatore da un millilitro in modo rapido.Lavare le fette appena tagliate dagli inserti in teflon e trasferirle nella metà superiore di una piastra Petri da 60 millimetri contenente BSS freddo. Posizionare le fette sotto un microscopio stereoscopico ed esaminarle. Identificare tutte le fette che presentano un giro dentato intatto e uno strato cellulare parametale.Successivamente, posizionare delicatamente le tre fette più grandi su un inserto, preparando un totale di 12 fette per ogni campione. Collocare gli inserti in un vassoio a sei scomparti e incubare a 36 gradi Celsius, rinnovando il mezzo di crescita ogni tre o quattro giorni sostituendo il mezzo vecchio con mezzo fresco e tiepido.Riportare le cellule nell'incubatore a 36 gradi dopo sette giorni. Sostituire il mezzo con 1,1 millilitri di mezzo neuro Basal privo di siero e integrato. Al giorno 18, esaminare la vitalità delle colture di tessuto a fettine.Iniziare posizionando 1,1 millilitri di ox poel in piatti di coltura a sei pozzetti. Collocare il piatto nell'incubatrice per riscaldarlo fino a 36 gradi Celsius. Nel frattempo, accendere una sorgente luminosa fluorescente con filtro fitzy per il microscopio e lasciarla riscaldare per almeno 20 minuti.Questo garantirà un'intensità luminosa uniforme. Successivamente, utilizzare pinzette per posizionare gli inserti di coltura su tessuto in un mezzo inox per 10 minuti. Quindi trasferirli nuovamente nel mezzo privo di SIM.Posizionare l'inserzione di coltura sul portapreparati del microscopio e segnare l'orientamento per rilevare lesioni parametrali irreversibili. Posizionare le colture su una superficie asettica di un microscopio invertito con un ingrandimento di cinque volte, mantenendo le sezioni in un orientamento simile a quello utilizzato per la pre-selezione.Passare al cubo di emissione per citazione FIT CX. Selezionare colture che presentano meno di 30 cellule positive a cytx nell'area ca uno per il precondizionamento al freddo. Aggiungere 1,1 millilitri di mezzo senza siero in una piastra da coltura a sei pozzetti e posizionare la piastra in un incubatore a 30 gradi con 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per almeno 20 minuti, al fine di equilibrare il mezzo trascorsi 20 minuti.Rimuovere il mezzo equilibrante dall'incubatrice. Trasferire le capsule di coltura con le sezioni dal mezzo normale senza siero al mezzo a 30 gradi. Successivamente, posizionarle nell'incubatrice a 30 gradi per 90 minuti dopo l'incubazione.Riportare le colture di tessuto a fette nel normale mezzo privo di siero e incubare a 36 gradi per 24 ore. Iniziare la pre-selezione per l'uso sperimentale delle colture di fette trasferendo gli inserti di coltura nel mezzo citoplasmatico per 20 minuti. Mentre le fette sono in incubazione, accendere la lampada a ultravioletti e la telecamera CCD e lasciarle riscaldare per 20 minuti.Se necessario, utilizzare il software per azzerare il CCD esponendolo alla luce per 50 cicli. Quindi pepeta una soluzione di 10 microlitri di fluoresceina in 90 microlitri di PBS su un emocitometro profondo 100 micrometri e posizionarlo sul palchetto del microscopio. Utilizzando il software, regolare il tempo di esposizione in modo che la gamma dinamica sia di 1000 su 4.096.Successivamente, posizionare la piastra con colture di fette precondizionate a freddo sul microscopio ed acquisire le immagini. Queste verranno utilizzate per determinare il livello di fluorescenza di fondo, che sarà sottratto dalla fluorescenza emessa dalle fette lesionate. Se il precondizionamento a freddo stesso avesse causato lesioni, si osserveranno cellule con fluorescenza aumentata.Per esaminare l'effetto di un danno da esotossina, trasferire gli inserti in un mezzo privo di siero contenente da 20 a 50 micromolar e MDA che sia stato pre-equilibrato a 36 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Incubare per 60 minuti a 36 gradi Celsius; l'NMDA imita gli effetti del neurotrasmettitore glutammato al termine dell'incubazione. Rimuovere l'NMDA dagli inserti immergendo ciascun inserto tre volte in tre piastre distinte da 60 millimetri.Ciascuno contenente 10 millilitri di mezzo basale neuro arricchito, riscaldato a 36 gradi Celsius. Non utilizzare più di tre inserti per ogni serie di piastre da 360 millimetri. Dopo il lavaggio, posizionare gli inserti in un vassoio contenente mezzo fresco e riporli nell'incubatrice a 36 gradi.Dopo 24 ore, calibrare la telecamera con uno standard di fluoresceina come in precedenza. Quindi posizionare le colture in mezzo OX per 20 minuti prima delle immagini. Se i livelli di danno sono bassi un giorno dopo il trauma, estendere l'esperimento da due a tre giorni, secondo necessità, per quantificare il danno utilizzando il software metamorph.Definire un'area di interesse attorno alla regione del CA1 per misurare l'intensità di una regione selezionata in caso di lesione. Copiare e incollare l'area di interesse dalla lesione all'immagine di sfondo. Successivamente, inserire i valori relativi a lesione e sfondo in Excel utilizzando un software statistico.Quantificare il numeratore meno il fondo per le colture di controllo e quelle precondizionate al freddo; eseguire il test statistico appropriato per confrontare il danno nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo, che deve sempre essere incluso in ogni esecuzione sperimentale. Questa immagine mostra una tipica colorazione di colture di fettine ippocampali mature dopo 21 giorni di coltura in vitro. L'etichettatura degli estremi nuovi, mostrata in verde, viene utilizzata per illustrare l'architettura cellulare dei neuroni principali.I neuroni parametali sono visibili nelle aree CA1 e CA3 dell'ippocampo e i neuroni del giro dentato o DG sono osservabili a sinistra. L'area CA1 mostrata a ingrandimento maggiore illustra l'aspetto ramificato delle microglia quiescenti. All'interno di colture di fettine mature, le cellule sono state marcate con il marcatore superficiale specifico per microglia CD11b. Questa figura mostra gli effetti del precondizionamento al freddo, della neuroprotezione e di colture di fettine ippocampali incubate con il marcatore verde cytx per le cellule morte.Le immagini di prescreening a sinistra mostrano l'assenza di lesioni ca una qui. Le colture di controllo sham sono mostrate nella parte superiore, mentre le colture precondizionate al freddo sono mostrate in basso. Le immagini della riga centrale mostrano il danno relativo delle colture di tessuto 24 ore dopo l'esposizione a 20 micromolari di NMDA.Si noti che il danno nel controllo sham è maggiore rispetto a quello delle colture esposte alla precondizionamento a freddo, indicato con cp. La scala di calibrazione del colore relativo al danno è mostrata nell'immagine in alto a sinistra. Tradizionalmente, le colture vengono quindi esposte a un livello massimo di danno, come ad esempio 20 micromolar e MDA per tutta la notte, al fine di massimizzare i livelli di danno neuronale CA uno e il danno relativo del precondizionamento a freddo rispetto allo sham, indicato come rapporto tra il danno e il danno massimo.Tuttavia, l'esposizione a stimoli di lesione massimali potrebbe non essere sufficiente per superare la neuroprotezione derivante dal precondizionamento. Di conseguenza, l'uso di rapporti tra lesione e lesione massimale potrebbe non riflettere accuratamente la neuroprotezione conferita dal precondizionamento. Ciò è evidente nelle immagini a destra, che mostrano come i livelli massimali nel precondizionamento freddo siano inferiori rispetto a quelli dei controlli fittizi.In questo studio, si è scoperto che l'uso del rapporto tra danno e danno massimo potrebbe oscurare la neuroprotezione derivante dal precondizionamento a freddo. Questo può essere osservato dallo schema in cui il danno sham è mostrato in rosso e quello dopo il precondizionamento a freddo in blu un giorno dopo l'esposizione a NMDA: dopo il precondizionamento a freddo, il livello di danno è stato determinato pari a tre rispetto al livello cinque osservato nel controllo sham. Questo risultato è coerente con una neuroprotezione del 40%.Tuttavia, se si utilizza un formato tradizionale basato su rapporti, come danno rispetto al danno massimale, nessuna protezione risulta evidente. In altre parole, 50% per lo sham rispetto al 50% per il precondizionamento al freddo. È stata eseguita una PCR quantitativa utilizzando campioni di mRNA come mostrato qui.Livelli di TNF alpha dopo il precondizionamento al freddo, rappresentati dalla linea blu, erano più elevati rispetto ai controlli, rappresentati dalle linee verde, gialla e viola. Questo suggerisce che il precondizionamento al freddo induce un aumento della produzione di TNF alpha nel cervello; per confermare i risultati ottenuti con la reazione a catena della polimerasi quantitativa e con l'array di reazione a catena della polimerasi quantitativa, è stata eseguita una colorazione immunoistochimica. Questa coltura di tessuto a fette è stata processata per l'interleuchina 11, mostrata in rosso, e una nuova estremità per mostrare i neuroni, mostrati in verde.Si noti che alcuni neuroni paramediali, indicati dalle frecce, mostrano una colorazione per l'interleuchina 11 e per il nuovo end, ed appaiono in giallo. Le frecce indicano alcune cellule più piccole, ritenute astrociti, che mostrano esclusivamente un aumento della colorazione per l'interleuchina 11. Nell'analizzare il sistema di segnalazione delle citochine coinvolto nella neuroprotezione indotta dal precondizionamento al freddo, è importante sottolineare alcuni concetti fondamentali.Sebbene le citochine siano presenti a concentrazioni estremamente basse nel cervello normale, piccole variazioni delle concentrazioni di citochine alterano l'espressione genica. Pertanto, anche a basse concentrazioni, le citochine hanno un potenziale enorme di modificare la struttura e la funzione cerebrale e, di conseguenza, il fenotipo di un organismo. Questo concetto è rappresentato qui dall'inverso della distanza, partendo da un baffo di gatto come punto di riferimento e confrontando il sodio, il potassio, il pH e il calcio con il TNF alfa.È inoltre importante tenere presente che le citochine sono altamente ridondanti e pleiotropiche: molteplici citochine possono avere effetti simili e una singola citochina può esercitare effetti variabili. Pertanto, per definire con precisione la base innata di citochine alla base della neuroprotezione indotta dal precondizionamento al freddo, è necessario determinare un'analisi composita di variabili di segnalazione correlate. Questo viene ottenuto mediante strategie di saggio multiplex, che permettono di definire il profilo di citochine associato alla neuroprotezione indotta dal precondizionamento al freddo. Una volta acquisite le competenze necessarie, queste colture possono essere preparate in circa tre ore e successivamente utilizzate per esperimenti di studio.La risposta al precondizionamento al freddo può essere eseguita nell'arco di circa tre giorni mentre si effettuano queste procedure; è essenziale ricordare che sono necessarie tecniche sterili e una manipolazione minima per preservare la capacità di rilevare segnali pro-infiammatori a basso livello dopo tali procedure. Altri metodi, come analisi proteomiche e biologico-molecolari, possono essere applicati alle colture per decifrare i meccanismi attraverso cui il precondizionamento al freddo esercita il suo effetto nutritivo e protettivo sul cervello.

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Neuroscienze

Esistono evidenze, che il precondizionamento ischemico (PC) - una sfida ischemica non-dannoso per il cervello - conferisce una protezione transitoria a un successivo insulto ischemico dannoso. Abbiamo stabilito bilaterale dell'arteria carotide comune occlusione (BCCAO) come stimolo di precondizionamento per indurre la tolleranza ischemica precoce (IT) di ischemia cerebrale focale transitoria (indotta da occlusione dell'arteria cerebrale, MCAO) in C57Bl6 / J topi.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

Fonte: Zheng, Y., et al. Modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione del postcondizionamento acido contro l'ischemia cerebrale. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'applicazione del postcondizionamento acido (APC) per valutare i suoi effetti neuroprotettivi contro il danno ischemico in un modello murino di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). Delinea le fasi coinvolte nella riperfusione nel modello MCAO e l'applicazione dell'APC durante la riperfusione per mitigare...

 Valutazione degli effetti neuroprotettivi del postcondizionamento acido in un modello murino di ischemia cerebrale

Fonte: Poinsatte, K., et al., Quantificazione della protezione neurovascolare a seguito di precondizionamento ipossico ripetitivo e occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei topi. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il metodo del precondizionamento ipossico ripetitivo (RHP) esponendo un topo a cicli di ipossia controllati prima di indurre un ictus ischemico. L'esperimento valuta i suoi effetti sulla stabilità della barriera emato-encefalica, sull'adattamento neuronale e...

Adattamento neuronale al precondizionamento ipossico ripetitivo nei topi

Fonte: Brandli, A. Precondizionamento ischemico remoto degli arti: una tecnica neuroprotettiva nei roditori. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra un protocollo di precondizionamento ischemico degli arti non invasivo nei ratti per indurre la neuroprotezione sistemica. La procedura prevede l'occlusione arteriosa controllata e la riperfusione, innescando percorsi di stress cellulare che rilasciano fattori protettivi. Questi fattori aumentano la resistenza alle lesioni ischemiche e metaboliche...

Precondizionamento ischemico non invasivo degli arti in un modello di ratto per la neuroprotezione

Precondizionamento ischemico remoto (RIP) è un metodo di tessuti condizionamento contro lo stress dannoso. Abbiamo stabilito un metodo di ischemia telecomando verso l'arto posteriore, gonfiando un bracciale sfigmomanometro per 5-10 min. Le capacità neuroprotettive del RIP sono stati dimostrati in un modello di degenerazione retinica nei roditori.

Arto Remote ischemica precondizionamento: una tecnica neuroprotettivo nei roditori

Questo protocollo descrive il precondizionamento ipossico ripetitivo, o brevi esposizioni all'ipossia sistemica che riducono i volumi di infarto e l'interruzione della barriera emato-encefalica a seguito di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei topi. Descrive inoltre la doppia quantificazione del volume dell'infarto e dell'interruzione della barriera emato-encefalica dopo l'ictus per valutare l'efficacia della protezione neurovascolare.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

l'occlusione chirurgica di un ramo distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello di uso frequente nella ricerca ictus sperimentale. Questo manoscritto descrive la tecnica base di MCAO permanente, combinata con l'inserimento di una finestra cranica laterale, che offre la possibilità di longitudinale microscopia intravitale nei topi.

Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva In Vivo Condizioni seguito distale Medio occlusione dell'arteria cerebrale nei topi

La postcondizionazione acida protegge contro l'ischemia cerebrale. Qui presentiamo due modelli per eseguire APC. Esse vengono ottenute rispettivamente trasferendo fette corticostriatali in tampone acico dopo la privazione di ossigeno-glucosio in vitro e inalando 20% di CO 2 dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale media in vivo .

Modelli sperimentali per studiare la neuroprotezione del post-condizionamento acido contro l&#39;ischemia cerebrale

Locomozione complesse in ambienti naturalistici che richiedono attento coordinamento degli arti coinvolge regioni della corteccia parietale. Il seguente protocollo descrive l'uso di disattivazione reversibile indotta da raffreddamento per dimostrare il ruolo di zona parietale 5 a evitare di memoria-guida ostacolo nel gatto a piedi.

Disattivazioni reversibile indotta da raffreddamento per studiare corticali contributi alla memoria di ostacolo nel gatto a piedi

Gli effetti distinti dei diversi gradi di ipotermia sulla protezione del miocardio non sono stati valutati a fondo. L'obiettivo del presente studio era quantificare i livelli di morte cellulare a seguito di diversi trattamenti di ipotermia in un modello umano a base di cardiomiociti, gettando le basi per una futura ricerca molecolare approfondita.

Valutazione in vitro della protezione del miocardio a seguito dell'ipotermia-precondizione in un modello di miociti cardiaci umani

Questo articolo descrive due metodi di induzione dell'ipotermia di breve durata su tutto il corpo nei ratti. Il primo, metodo a induzione rapida, impiega il raffreddamento attivo utilizzando ventole e spray etanolo per una rapida diminuzione della temperatura. Il secondo metodo è un metodo di raffreddamento graduale. Ciò si ottiene utilizzando la combinazione di anestesia isoflurano e la riduzione delle impostazioni di temperatura sul tappetino termico omeotermico. Ciò si traduce in una...

Induzione dell'ipotermia di breve durata nei ratti utilizzando modelli per studi che esaminano la rilevanza clinica e i meccanismi

Scopri le strategie di neuroprotezione mediante precondizionamento al freddo su colture di fette ippocampali di ratto. Questo metodo identifica bersagli terapeutici per prevenire lesioni neurologiche durante anestesia e chirurgia.

Strategie per lo Studio delle Neuroprotezione dal freddo precondizionamento

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