Name: Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Scopri la microscopia confocale corneale per valutare le neuropatie periferiche in modo non invasivo. Questa tecnica permette di quantificare i danni alle fibre nervose corneali e stratificare la gravità della neuropatia.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Juvenile Diabetes Research Foundation International (concedere 17-2008-1031) e il National Institutes of Health (borsa 1R01DK077903-01A1).

Introduzione: La quantificazione precisa di neuropatia periferica è importante definire i pazienti a rischio, anticipare il deterioramento, e valutare nuove terapie. I metodi convenzionali di valutare i deficit neurologici e elettrofisiologia e quantitativa test sensoriali quantifica le alterazioni funzionali a rilevare la neuropatia. Tuttavia, i primi danni sembra essere alle fibre piccolo ma questi test in primo luogo valutare la disfunzione grandi fibre e hanno una limitata capacità di dimostrare la rigenerazione e la riparazione. Le tecniche che permettono solo un esame diretto del danno amieliniche fibre nervose e di riparazione sono biopsia del nervo surale con il microscopio elettronico e la pelle-biopsia. Tuttavia, entrambi sono procedure invasive e richiedono lunghe procedure di laboratorio e di una notevole esperienza. Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinico che fornisce in vivo immagini di fibre nervose corneali. HRT-III Modulo Rostock Cornea (RCM) Manuale di funzionamento 1. Preparazione della fotocamera Il primo passo in esame con HRT è la preparazione della punta della lente obiettiva. <ol><li> Prima il tubo obiettivo della macchina fotografica laser a scansione, impostare la rifrazione a +12 diottrie e quindi regolare la telecamera nella posizione più bassa. </li><li> Applicare una grande omogenea, bolla libero, goccia dentifricio, di Viscotears sulla punta lente. </li><li> Rimuovere un TomoCap dal suo contenitore sterile e montarlo sulla punta lenti in modo che il gel forma un menisco tra le lenti dell'obiettivo e il tappo. Spingere il più lontano possibile, oltre al titolare. Fare attenzione a non toccare la superficie anteriore del TomoCap durante il montaggio. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparazione della punta lente dell'obiettivo (in alto) applicando viscotear gel (in basso) Applicazione del TomoCap. </li><li> Spostare la telecamera laser a scansione il più indietro possibile, sul monte fotocamera. </li><li> La superficie interna ed esterna del TomoCap entrambi appaiono come un riflesso laser luminoso. La rotella di regolazione focale aereo deve essere regolato fino a un riflesso luminoso è osservato, indicando che l'obiettivo è focalizzato nella parte anteriore del coperchio. Il valore di profondità visualizzato sul display posizione opportuno concentrarsi ora tra -150 micron e 150 micron. </li><li> Ripristina l'impostazione della profondità a zero. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Regolazione del piano focale. </li></ol> 2. Preparazione del paziente Gli occhi del soggetto sono anestetizzati con un calo del 0,4% cloridrato benoxinate, e Viscotears è utilizzato sulla parte anteriore dell'occhio per la lubrificazione. Il soggetto è seduto comodamente, con il mento sulla mentoniera e ha chiesto di premere il fronte con fermezza contro il bar fronte. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Preparazione del paziente 3. Allineamento della Camera Rende l'esame più facile se si istruire il paziente a fissare la luce fissazione esterna con l'occhio non è in corso di esame. Le dimensioni compatte della testa microscopio significa che l'occhio controlaterale del soggetto non è oscurata, consentendo l'uso di obiettivi a distanza. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Lente Obiettivo del modulo corneale. <ol><li> Posizionare la fotocamera CCD tale che il suo asse ottico è perpendicolare all'asse ottico della camera di scansione laser. La fotocamera dovrebbe essere sul lato destro del paziente quando l'imaging l'occhio destro e viceversa. In questa posizione, si dovrebbe vedere la superficie anteriore del TomoCap al centro dell'immagine camera CCD dal vivo. </li><li> Spostare la telecamera a scansione laser verso il paziente fino cornea del paziente si trova ad una distanza di circa 5 a 10 mm dal TomoCap, quindi spostare la telecamera scansione laser su / giù e sinistra / destra con le manopole nere sul monte fotocamera fino a quando il TomoCap è posizionato al centro della cornea del paziente. In questa fase è possibile verificare che la luce laser rosso si trova nel centro della cornea e per la regolazione fine, osservare il riflesso del raggio laser dalla cornea, che è visibile nell'immagine camera CCD. Questa riflessione deve avvenire esattamente al polo anteriore della cornea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Allineamento del fascio laser sul polo anteriore della cornea per catturare immagini corneale centrale. </li><li> Chiedere al paziente di aprire gli occhi suoi / sue più ampio possibile. Spostare la telecamera scansione laser lentamente in avanti verso il paziente fino a quando i contatti TomoCap cornea del paziente. Se è necessarioper correggere la posizione della telecamera di scansione laser, quindi spostare la telecamera dal primo paziente, fare la correzione, poi andare avanti di nuovo a contatto con la cornea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Dimostrazione del ponte gel sottile tra la TomoCap e la cornea. </li><li> Minimo contatto tra la fotocamera e la cornea è sufficiente. In una regolazione ottimale, un ponte sottile tra il gel TomoCap e la cornea è visibile l'immagine della telecamera CCD dal vivo. </li></ol> Se si preme il TomoCap o spostare la cornea troppo vicino alla fotocamera poi si vedrà pressione sulla cornea con un aspetto appiattito nella cornea attraverso l'immagine della telecamera CCD dal vivo. Anche nelle immagini ottenute una linea che mostra la pressione appare, pertanto, non applicare troppa pressione alla cornea. Una volta che il contatto è stato stabilito, non spostare la posizione del headrestto evitare di scivolare la cornea sul TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7 (a sinistra) aspetto di un straie a causa di applicazione di una pressione eccessiva sulla cornea dalla TomoCap;. (A destra) Un'immagine con aspetto normale, senza eccesso di pressione. 4. Esaminando il paziente Dopo il campo di vista è stato selezionato, la HRT III fotocamera laser è acceso e la finestra di acquisizione immagine viene visualizzata sullo schermo. Utilizzare l'immagine CCD per posizionare il TomoCap e la luce laser sulla cornea del paziente. Esame con la modalità selezionata può quindi essere avviato. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Modalità di visualizzazione sul monitor durante l'acquisizione di immagini. La modalità di acquisizione Nella modalità di sezione, una singola immagine viene acquisita e memorizzati ogni volta che si preme il pedale. Noi utilizziamo questa modalità per catturare le immagini dallo strato corneo tutto compreso strato di Bowman nel centro della cornea. E poi, dopo aver catturato un numero sufficiente di immagini, si possono provare le altre modalità tra cui la sequenza e il volume. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Display con scelta di diverse modalità di acquisizione delle immagini. Con la scansione di sequenza, si può acquisire una sequenza fino a 100 immagini con un frame rate regolabile. È possibile scegliere un frame rate tra i 30 frame e 1 frame al secondo (fps) e sulla base di questa modalità permette di acquisire un film con una durata da 3 a 100 secondi. In modalità di scansione del volume, la fotocamera acquisisce automaticamente una serie di 40 immagini consecutive a piani focali. Una profondità totale di 85 micron possono essere acquisiti con il "FOV 400 micron" lente di campo e la distanza focale tra due immagini consecutive saranno circa 2,1 micron. Dopo un paio di scansioni il piano di messa a fuoco dell'obiettivo può essere modificata per misurare la profondità di uno strato di cellule della cornea rispetto alla superficie della cornea portando lo strato delle cellule epiteliali a fuoco e quindi facendo clic sul pulsante Ripristina per impostare il valore della profondità a 0. Ai fini del presente studio, si ottengono immagini dalla cornea centrale a diverse profondità. Perciò non muovere la telecamera a scansione laser attorno alla cornea orizzontalmente o verticalmente, dobbiamo solo spostare avanti e indietro e catturare le immagini da tutte le profondità dello strato di Bowman nello stesso punto della cornea. La distanza tra ogni immagine è di circa 1 micron, quindi se la profondità del Bowman è di 10 micron, avremo 10 immagini. Tuttavia per l'analisi finale, selezioniamo le immagini con una distanza di circa 2-3 micron tra di loro. Dopo l'esame è completa spegnere la fotocamera premendo il pulsante di alimentazione della fotocamera nella finestra di acquisizione. Rendere il paziente consapevole che lui o lei non deve strofinare gli occhi la sua fino a quando l'anestesia locale ha portato fuori. Per precauzione, si consiglia di eseguire un esame lampada a fessura della cornea del paziente dopo l'esame. Rimuovere il TomoCap dalla fotocamera e smaltire e poi pulire la lente del microscopio con un bastoncino di cotone inumidito con acqua distillata. 5. Analisi di un esame a. Selezione del frame Per rivedere ed analizzare gli esami esistenti, la cartella clinica appropriata (s) deve essere selezionata nella finestra del database. La finestra di visualizzazione delle immagini offre una panoramica degli esami cornea esistenti per il paziente selezionato. Esami eseguiti in giorni diversi sono memorizzati in schede differenti visite. I tre tipi diversi di scansione sono rappresentate da tre icone differenti nella scheda cornea visita HRT III della finestra di visualizzazione dell'immagine della Heidelberg Eye Explorer. Per controllare l'immagine della cornea, fare doppio clic sull'icona desiderata immagine e la funzione "Visualizza" si apre la seguente finestra: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Visualizzazione di tutte le immagini acquisite dopo l'esame. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Visualizzazione di immagini selezionate prima dell'esportazione con telecamera CCD dell'occhio per mostrare il corretto allineamento. Per esportare le immagini appropriate per ulteriori analisi, fare clic su "Esporta" nella barra degli strumenti e quindi selezionare la cartella che si desidera salvare le immagini. Otteniamo e catturare le immagini da tutti gli strati della cornea per ogni paziente, ma come l'obiettivo principale di questa ricerca è sullo strato di Bowman e dei nervi corneali, solo le immagini di questo strato saranno analizzati. Selezioniamo 5-6 fotogrammi da strato di Bowman per ogni soggetto a diverse profondità della cornea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Figura 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. Visualizzazione di tutti gli strati corneali da un soggetto sano. In media 5-6 fotogrammi da strato di Bowman nel centro della cornea a diverse profondità sono selezionati in modo casuale per misure quantitative e di analisi. b. Analizzando le immagini Per analizzare le immagini catturate dallo strato di Bowman della cornea centrale con HRT III, utilizziamo software specializzato che è stato sviluppato all'interno del nostro gruppo chiamato "CCM Image Analysis Tools v 0.6". Quattro i principali parametri per i nervi corneali sono misurati con questo software: <ul><li> Densità delle fibre nervose (NFD) che è definita come il numero di nervi principali / telaio. </li><li> Nervo ramo densità (NBD) il numero degli sportelli principali / telaio. </li><li> Lunghezza delle fibre nervose (NFL), che è la lunghezza totale di tutti i nervi / frame. </li><li> Tortuosità delle fibre nervose (NFT) dei principali nervi / telaio. </li></ul> Per aprire l'immagine CCM, passare al file&gt; aperto. <ul><li> Una volta che l'immagine viene caricata, le sue dimensioni e il tipo viene visualizzato nella finestra Informazioni immagine in alto a sinistra mano-lato del pannello di controllo. </li><li> La scala di default viene visualizzato nella riga di modifica delle informazioni immagine. Se la scala è diversa, modificare il numero nella riga di modifica. </li><li> Per iniziare l'analisi dell'immagine, selezionare il parametro che si vuole misurare dal Box metriche in alto a destra del pannello di controllo. </li><li> Nella finestra di risultato in fondo alla pagina il numero di NFD, NBD è presentata in numero effettivo, NFL in mm e tortuosità come un coefficiente Tortuosity (TC). </li><li> Tuttavia dopo l'esportazione i risultati in un foglio excel, i risultati saranno presentati in nessun / mm 2 per NFD e NBD e mm / mm 2 per la NFL. </li><li> A tale scopo dopo aver terminato le misurazioni cliccare su misurazioni Aggiungi, poi andare su File&gt; Salva con nome e quindi aprire i risultati salvati con Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Figura 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. Visualizzazione di immagini nervose corneali con l'analisi in strumento di analisi l'utilizzo di "Image Tool CCM Analysis". 6. Rappresentante dei risultati: Abbiamo dimostrato un progressivo aumento nella degenerazione dei nervi corneali con gravità crescente della neuropatia diabetica 1 e danni al sistema nervoso nelle prime diabete che precede la perdita di fibre nervose intraepidermiche nelle biopsie cutanee 2 assieme ad stratificazione di gravità neuropatico e riparazione di pancreas trapianto 3 in pazienti diabetici. Abbiamo anche dimostrato danni al sistema nervoso in idiopatica neuropatia delle piccole fibre malattia di Fabry 4 e 5. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Figura 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. Corneale immagini di microscopia confocale con HRT III strato della cornea Bowman (a) soggetti di controllo rispetto a (b) Paziente con neuropatia e gravi danni ai nervi.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Figure 4 - 6: Per gentile concessione di Heidelberg Ingegneria

Microscopia corneale confocale (CCM) è una tecnica non invasiva clinici che possono essere utilizzati per rilevare i danni primi nervi e quantificare piccole fibre patologia in neuropatie periferiche tra cui il diabete, malattia di Fabry e idiopatica neuropatie delle piccole fibre (ISFN). L&#39;impatto immediato clinico di questa tecnica rappresenta un enorme passo in avanti in termini di capacità di diagnosticare, seguire la progressione e valutare la risposta terapeutica nei pazienti con neuropatia diabetica e di altr...

<table><tbody><tr><td>Macchina HRT III CCM - Modulo Cornea di Rostock</td><td></td><td></td><td>Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini CCM v0.6</td><td></td><td></td><td>Università di Manchester</td></tr></tbody></table>

microscopia corneale confocale: a novel tecnica non invasiva per quantificare piccole fibre patologia neuropatie periferiche

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

La quantificazione precisa di neuropatia periferica è importante definire i pazienti a rischio, anticipare il deterioramento, e valutare nuove terapie. I metodi convenzionali di valutare i deficit neurologici e elettrofisiologia e quantitativa test sensoriali quantifica le alterazioni funzionali a rilevare la neuropatia. Tuttavia, i primi danni sembra essere alle fibre piccolo ma questi test in primo luogo valutare la disfunzione grandi fibre e hanno una limitata capacità di dimostrare la rigenerazione e la riparazione. Le tecniche che permettono solo un esame diretto del danno amieliniche fibre nervose e di riparazione sono biopsia del nervo surale con il microscopio elettronico e la pelle-biopsia. Tuttavia, entrambi sono procedure invasive e richiedono lunghe procedure di laboratorio e di una notevole esperienza. Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinico che fornisce in vivo immagini di fibre nervose corneali. Abbiamo dimostrato danno precoce del nervo, che precede la perdita di fibre nervose intraepidermiche nelle biopsie cutanee con stratificazione di gravità neuropatico e del trapianto di pancreas riparazione seguito nei pazienti diabetici. Abbiamo anche dimostrato danni al sistema nervoso in idiopatica neuropatia delle piccole fibre e la malattia di Fabry.

Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinici che possono essere utilizzati per quantificare i danni delle fibre C di diagnosticare e stratificare i pazienti con l&#39;aumentare della gravità neuropatico.

Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche

La quantificazione accurata della neuropatia periferica è importante per definire i pazienti a rischio, anticipare il deterioramento e valutare nuove terapie. ...

Questo video dimostra una procedura per l'imaging delle fibre C corneali mediante la tecnica non invasiva della microscopia confocale corneale o CCM, che consente la quantificazione del danno alle fibre nervose. Innanzitutto, si regola il piano focale della lente sulla CCM e si applica un gel visco lacrimale sulla lente prima di posizionare il cappuccio monouso. Successivamente, si instillano gocce anestetiche e gel visco lacrimale sull'occhio.Successivamente, la telecamera viene regolata per stabilire il contatto tra il gel sulla parte anteriore della lente e la cornea del paziente. Infine, si regola la profondità del piano di messa a fuoco e vengono acquisite immagini dei nervi corneali provenienti dalla parte centrale del strato di Bowman. È possibile osservare cambiamenti morfologici nelle fibre nervose corneali per quantificare la neuropatia.Questa è una tecnica molto innovativa che in realtà era già stata utilizzata in precedenza nel campo dell'ottica e dell'oftalmologia, ma negli ultimi otto anni circa l'abbiamo impiegata in modo molto efficace per studiare e valutare la neuropatia diabetica e altre neuropatie periferiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di quantificare i danni alle fibre piccole in una fase molto precoce, per poi stratificare interamente in modo non invasivo la gravità della neuropatia nei pazienti; ciò può essere fatto rapidamente mediante una scansione di due minuti, che successivamente può essere quantificata in termini di severità della neuropatia. Pertanto, speriamo che questo metodo sostituisca alcune delle altre tecniche molto più invasive, come la biopsia cutanea e la biopsia nervosa. Sebbene complessivamente la tecnica possa apparire semplice, in realtà richiede passaggi ben definiti per acquisire in modo ottimale l'immagine e quindi per quantificarla.E in realtà vogliamo rendere chiaro ed evidente l'intero processo a chiunque altro desideri utilizzare questa tecnica. Il primo passo nell'esame mediante il microscopio confocale corneale HRT consiste nella preparazione della punta dell'obiettivo al tubo dell'obiettivo della telecamera a scansione laser. Impostare la rifrazione a +12 diottrie, quindi regolare la telecamera alla posizione più bassa e bloccare l'obiettivo ruotandolo in senso antiorario.Applicare una goccia di dimensioni P grande, omogenea e priva di bolle di visco lacrime sulla punta della lente. Rimuovere un tappo tomo dal suo contenitore sterile e montarlo sulla punta della lente il più possibile oltre il supporto, in modo che il gel formi un menisco tra la lente obiettivo e il tappo. Fare attenzione a non toccare la superficie anteriore del tappo tomo durante il montaggio.Ora, spostare la telecamera a scansione laser il più indietro possibile sul supporto della telecamera rispetto alla superficie interna ed esterna del tappo tomografico. Entrambe appaiono come un'intensa riflessione laser sul monitor del display. Regolare la ghiera di messa a fuoco fino a osservare un'intensa riflessione, indicando che l'obiettivo è messo a fuoco all'interno della parte anteriore del tappo.Il valore di profondità visualizzato nel display della posizione di messa a fuoco dovrebbe ora trovarsi tra meno 150 micrometri e più 150 micrometri. Reimpostare l'impostazione della profondità a zero. Vediamo ora come preparare il paziente.Dopo aver anestetizzato gli occhi del soggetto con una goccia di cloridrato di 0,4%, lubrificare la parte anteriore dell'occhio con lacrime viscose. Far accomodare il soggetto con il mento appoggiato sul sostegno, assicurandosi che la fronte sia premuta saldamente contro la barra frontale. L'esame risulta più agevole istruendo il paziente a fissare la luce di fissazione esterna.Con l'occhio non sottoposto a esame, le dimensioni compatte della testa del microscopio garantiscono che l'occhio controlaterale del soggetto non venga ostruito, permettendo l'utilizzo di target distanti. Posizionare la telecamera CCD in modo che il suo asse ottico sia perpendicolare all'asse ottico della telecamera a scansione laser.La telecamera deve trovarsi sul lato destro del paziente durante l'acquisizione dell'occhio destro e viceversa. In questa posizione, la superficie anteriore del tomo cap appare al centro della telecamera CCD. Immagine in tempo reale.Spostare la telecamera a scansione laser verso il paziente finché la cornea del paziente non si trova a una distanza di circa cinque-dieci millimetri dal tomo cap. Quindi utilizzare le manopole di regolazione verticale e orizzontale sul supporto della telecamera per spostare la telecamera a scansione laser su e giù e a destra e a sinistra, fino a quando il tomo cap non è posizionato al centro della cornea del paziente. A questo punto, chiedere al paziente di aprire gli occhi il più possibile.Spostare lentamente la telecamera a scansione laser verso il paziente finché il cappuccio tomografico non entra in contatto con la cornea del paziente. A questo punto, verificare che la luce laser rossa sia centrata sulla cornea e che il riflesso del raggio laser proveniente dalla cornea avvenga esattamente al polo anteriore della cornea. Con un'ottimale regolazione, il contatto tra lente e cornea è minimo.Un sottile ponte di gel tra il tappo tomografico e la cornea è visibile nell'immagine in tempo reale della telecamera CCD. Se vi è troppa pressione tra il tappo tomografico e la cornea, si osserva un aspetto appiattito della cornea tramite la telecamera CCD. L'immagine in tempo reale e lo strayer compaiono sull'immagine CCM.Dopo aver posizionato il paziente, accendere la telecamera laser HR a tre fasci; la finestra di acquisizione dell'immagine apparirà sullo schermo. Utilizzare l'immagine CCD per posizionare il cappuccio tomografico e il fascio laser sulla cornea del paziente. Il CCM dispone di tre opzioni per l'acquisizione delle immagini.La scansione sequenziale consente di acquisire fino a 100 immagini con una frequenza dei fotogrammi regolabile. Si seleziona una frequenza compresa tra 30 e 1 fotogramma al secondo. In base a questo parametro, è possibile acquisire un filmato della durata compresa tra tre e 100 secondi.In modalità di scansione volumetrica, la telecamera acquisisce automaticamente una serie di 40 immagini in piani focali consecutivi. È possibile scansionare una profondità totale di 85 micrometri, e la distanza focale tra due immagini consecutive è di circa 2,1 micrometri. L'ultima opzione è la modalità sezione, che verrà utilizzata per questo esperimento.Questa modalità consente un'acquisizione ottimale con immagini singole nitide acquisite e memorizzate ogni volta che si preme l'interruttore a pedale. Questa modalità viene utilizzata per acquisire immagini dall'intero strato corneale, inclusa la membrana di Bowman al centro della cornea. Dopo aver acquisito un numero sufficiente di immagini, possono essere utilizzate altre modalità, tra cui sequenza e volume.Dopo alcune scansioni, è possibile modificare il piano focale della lente per misurare la profondità di uno strato cellulare corneale rispetto alla superficie corneale, mettendo a fuoco lo strato delle cellule epiteliali e quindi facendo clic sul pulsante di ripristino per impostare il valore di profondità a zero. Al termine dell'esame, spegnere la telecamera facendo clic sul pulsante di accensione della telecamera nella finestra di acquisizione. Informare il paziente che non deve strofinarsi gli occhi fino a quando l'anestesia locale non sarà svanita.Rimuovere il tappo del tomografo dalla fotocamera, smaltirlo e quindi pulire l'obiettivo del microscopio con un bastoncino di cotone inumidito con acqua distillata. Vediamo ora come analizzare un'immagine e quantificare i parametri delle fibre nervose per rivedere e analizzare esami esistenti. Per prima cosa, selezionare la cartella clinica appropriata nella finestra del database.La finestra di visualizzazione delle immagini fornisce una panoramica degli esami della cornea disponibili per il paziente selezionato. Gli esami effettuati in giorni diversi sono archiviati in schede di visita separate. I tre diversi tipi di scansione sono rappresentati da tre icone differenti. Nella scheda di visita della cornea HRT tre, nella finestra di visualizzazione delle immagini del Heidelberg Eye Explorer.Per esaminare l'immagine della cornea, fare doppio clic sull'icona dell'immagine appropriata e quindi premere "mostra ora" per esportare le immagini appropriate per ulteriori analisi; fare clic su "esporta" nella barra degli strumenti e quindi selezionare la cartella in cui salvare le immagini. Poiché l'obiettivo principale di questa ricerca riguarda soltanto il layer di Bowman e i nervi corneali, verranno analizzate solo le immagini provenienti da questo strato. Per ogni soggetto vengono selezionate da cinque a sei immagini del layer di Bowman a diverse profondità della cornea.L'analisi delle immagini viene eseguita con un software specializzato sviluppato dal nostro gruppo chiamato CCM Image Analysis Tools, versione 0.64. I parametri principali per i nervi corneali vengono misurati con il software: la densità delle fibre nervose, definita come il numero di nervi principali per campo. La densità dei rami nervosi è il numero totale di rami principali per campo.La lunghezza delle fibre nervose è la lunghezza totale dei nervi principali e dei loro rami principali per ogni campo della fibra nervosa. La tortuosità è la tortuosità dei nervi principali per ogni campo. Per aprire un'immagine CCM, andare su file e quindi selezionare apri.Una volta caricata l'immagine, le sue dimensioni e il tipo vengono visualizzati nella casella delle informazioni sull'immagine in alto a sinistra del pannello di controllo; la scala predefinita viene mostrata nella riga di modifica delle informazioni sull'immagine. Se la scala è diversa, modificare il numero nella riga di modifica. Per iniziare ad analizzare l'immagine, selezionare il parametro che si desidera misurare dalla casella metrica in alto a destra del pannello di controllo.Nella casella dei risultati in fondo alla pagina, NFD e MBD sono presentati come numero effettivo. NFL è presentato in millimetri e la tortuosità come coefficiente di tortuosità. I risultati possono essere esportati in un foglio Excel.Quando si apre la pagina di Excel, i risultati verranno presentati in numero per millimetro quadrato per NFD e MBD, millimetri per millimetro quadrato per NFL e coefficiente di tortuosità per NFT. Per effettuare queste misurazioni, iniziare segnando ogni nervo principale, quindi segnare ogni ramo del nervo principale. Infine, tracciare ogni nervo all'interno del campo.Una penna digitale può essere utilizzata per ottenere una maggiore precisione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un minuto, se effettuata correttamente durante il tentativo di questa procedura. È importante seguire attentamente le istruzioni dettagliate.Dopo aver visto questo video, speriamo che abbiate acquisito una buona comprensione di come lavorare e acquisire immagini dallo strato corneale di movimento mediante microscopia confocale corneale, e di come quantificare e analizzare le immagini di questo strato in pazienti con neuropatia periferica, in particolare neuropatia diabetica. E non dimenticate che lavorare con la CCM richiede competenze specifiche ed è stato raccomandato che la procedura sia eseguita da professionisti formati nell'esame oculare.

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