Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche

Questo video dimostra una procedura per l'imaging delle fibre C corneali mediante la tecnica non invasiva della microscopia confocale corneale o CCM, che consente la quantificazione del danno alle fibre nervose. Innanzitutto, si regola il piano focale della lente sulla CCM e si applica un gel visco lacrimale sulla lente prima di posizionare il cappuccio monouso. Successivamente, si instillano gocce anestetiche e gel visco lacrimale sull'occhio.

Successivamente, la telecamera viene regolata per stabilire il contatto tra il gel sulla parte anteriore della lente e la cornea del paziente. Infine, si regola la profondità del piano di messa a fuoco e vengono acquisite immagini dei nervi corneali provenienti dalla parte centrale del strato di Bowman. È possibile osservare cambiamenti morfologici nelle fibre nervose corneali per quantificare la neuropatia.

Questa è una tecnica molto innovativa che in realtà era già stata utilizzata in precedenza nel campo dell'ottica e dell'oftalmologia, ma negli ultimi otto anni circa l'abbiamo impiegata in modo molto efficace per studiare e valutare la neuropatia diabetica e altre neuropatie periferiche. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di quantificare i danni alle fibre piccole in una fase molto precoce, per poi stratificare interamente in modo non invasivo la gravità della neuropatia nei pazienti; ciò può essere fatto rapidamente mediante una scansione di due minuti, che successivamente può essere quantificata in termini di severità della neuropatia. Pertanto, speriamo che questo metodo sostituisca alcune delle altre tecniche molto più invasive, come la biopsia cutanea e la biopsia nervosa. Sebbene complessivamente la tecnica possa apparire semplice, in realtà richiede passaggi ben definiti per acquisire in modo ottimale l'immagine e quindi per quantificarla.

E in realtà vogliamo rendere chiaro ed evidente l'intero processo a chiunque altro desideri utilizzare questa tecnica. Il primo passo nell'esame mediante il microscopio confocale corneale HRT consiste nella preparazione della punta dell'obiettivo al tubo dell'obiettivo della telecamera a scansione laser. Impostare la rifrazione a +12 diottrie, quindi regolare la telecamera alla posizione più bassa e bloccare l'obiettivo ruotandolo in senso antiorario.

Applicare una goccia di dimensioni P grande, omogenea e priva di bolle di visco lacrime sulla punta della lente. Rimuovere un tappo tomo dal suo contenitore sterile e montarlo sulla punta della lente il più possibile oltre il supporto, in modo che il gel formi un menisco tra la lente obiettivo e il tappo. Fare attenzione a non toccare la superficie anteriore del tappo tomo durante il montaggio.

Ora, spostare la telecamera a scansione laser il più indietro possibile sul supporto della telecamera rispetto alla superficie interna ed esterna del tappo tomografico. Entrambe appaiono come un'intensa riflessione laser sul monitor del display. Regolare la ghiera di messa a fuoco fino a osservare un'intensa riflessione, indicando che l'obiettivo è messo a fuoco all'interno della parte anteriore del tappo.

Il valore di profondità visualizzato nel display della posizione di messa a fuoco dovrebbe ora trovarsi tra meno 150 micrometri e più 150 micrometri. Reimpostare l'impostazione della profondità a zero. Vediamo ora come preparare il paziente.

Dopo aver anestetizzato gli occhi del soggetto con una goccia di cloridrato di 0,4%, lubrificare la parte anteriore dell'occhio con lacrime viscose. Far accomodare il soggetto con il mento appoggiato sul sostegno, assicurandosi che la fronte sia premuta saldamente contro la barra frontale. L'esame risulta più agevole istruendo il paziente a fissare la luce di fissazione esterna.

Con l'occhio non sottoposto a esame, le dimensioni compatte della testa del microscopio garantiscono che l'occhio controlaterale del soggetto non venga ostruito, permettendo l'utilizzo di target distanti. Posizionare la telecamera CCD in modo che il suo asse ottico sia perpendicolare all'asse ottico della telecamera a scansione laser.

La telecamera deve trovarsi sul lato destro del paziente durante l'acquisizione dell'occhio destro e viceversa. In questa posizione, la superficie anteriore del tomo cap appare al centro della telecamera CCD. Immagine in tempo reale.

Spostare la telecamera a scansione laser verso il paziente finché la cornea del paziente non si trova a una distanza di circa cinque-dieci millimetri dal tomo cap. Quindi utilizzare le manopole di regolazione verticale e orizzontale sul supporto della telecamera per spostare la telecamera a scansione laser su e giù e a destra e a sinistra, fino a quando il tomo cap non è posizionato al centro della cornea del paziente. A questo punto, chiedere al paziente di aprire gli occhi il più possibile.

Spostare lentamente la telecamera a scansione laser verso il paziente finché il cappuccio tomografico non entra in contatto con la cornea del paziente. A questo punto, verificare che la luce laser rossa sia centrata sulla cornea e che il riflesso del raggio laser proveniente dalla cornea avvenga esattamente al polo anteriore della cornea. Con un'ottimale regolazione, il contatto tra lente e cornea è minimo.

Un sottile ponte di gel tra il tappo tomografico e la cornea è visibile nell'immagine in tempo reale della telecamera CCD. Se vi è troppa pressione tra il tappo tomografico e la cornea, si osserva un aspetto appiattito della cornea tramite la telecamera CCD. L'immagine in tempo reale e lo strayer compaiono sull'immagine CCM.

Dopo aver posizionato il paziente, accendere la telecamera laser HR a tre fasci; la finestra di acquisizione dell'immagine apparirà sullo schermo. Utilizzare l'immagine CCD per posizionare il cappuccio tomografico e il fascio laser sulla cornea del paziente. Il CCM dispone di tre opzioni per l'acquisizione delle immagini.

La scansione sequenziale consente di acquisire fino a 100 immagini con una frequenza dei fotogrammi regolabile. Si seleziona una frequenza compresa tra 30 e 1 fotogramma al secondo. In base a questo parametro, è possibile acquisire un filmato della durata compresa tra tre e 100 secondi.

In modalità di scansione volumetrica, la telecamera acquisisce automaticamente una serie di 40 immagini in piani focali consecutivi. È possibile scansionare una profondità totale di 85 micrometri, e la distanza focale tra due immagini consecutive è di circa 2,1 micrometri. L'ultima opzione è la modalità sezione, che verrà utilizzata per questo esperimento.

Questa modalità consente un'acquisizione ottimale con immagini singole nitide acquisite e memorizzate ogni volta che si preme l'interruttore a pedale. Questa modalità viene utilizzata per acquisire immagini dall'intero strato corneale, inclusa la membrana di Bowman al centro della cornea. Dopo aver acquisito un numero sufficiente di immagini, possono essere utilizzate altre modalità, tra cui sequenza e volume.

Dopo alcune scansioni, è possibile modificare il piano focale della lente per misurare la profondità di uno strato cellulare corneale rispetto alla superficie corneale, mettendo a fuoco lo strato delle cellule epiteliali e quindi facendo clic sul pulsante di ripristino per impostare il valore di profondità a zero. Al termine dell'esame, spegnere la telecamera facendo clic sul pulsante di accensione della telecamera nella finestra di acquisizione. Informare il paziente che non deve strofinarsi gli occhi fino a quando l'anestesia locale non sarà svanita.

Rimuovere il tappo del tomografo dalla fotocamera, smaltirlo e quindi pulire l'obiettivo del microscopio con un bastoncino di cotone inumidito con acqua distillata. Vediamo ora come analizzare un'immagine e quantificare i parametri delle fibre nervose per rivedere e analizzare esami esistenti. Per prima cosa, selezionare la cartella clinica appropriata nella finestra del database.

La finestra di visualizzazione delle immagini fornisce una panoramica degli esami della cornea disponibili per il paziente selezionato. Gli esami effettuati in giorni diversi sono archiviati in schede di visita separate. I tre diversi tipi di scansione sono rappresentati da tre icone differenti. Nella scheda di visita della cornea HRT tre, nella finestra di visualizzazione delle immagini del Heidelberg Eye Explorer.

Per esaminare l'immagine della cornea, fare doppio clic sull'icona dell'immagine appropriata e quindi premere "mostra ora" per esportare le immagini appropriate per ulteriori analisi; fare clic su "esporta" nella barra degli strumenti e quindi selezionare la cartella in cui salvare le immagini. Poiché l'obiettivo principale di questa ricerca riguarda soltanto il layer di Bowman e i nervi corneali, verranno analizzate solo le immagini provenienti da questo strato. Per ogni soggetto vengono selezionate da cinque a sei immagini del layer di Bowman a diverse profondità della cornea.

L'analisi delle immagini viene eseguita con un software specializzato sviluppato dal nostro gruppo chiamato CCM Image Analysis Tools, versione 0.64. I parametri principali per i nervi corneali vengono misurati con il software: la densità delle fibre nervose, definita come il numero di nervi principali per campo. La densità dei rami nervosi è il numero totale di rami principali per campo.

La lunghezza delle fibre nervose è la lunghezza totale dei nervi principali e dei loro rami principali per ogni campo della fibra nervosa. La tortuosità è la tortuosità dei nervi principali per ogni campo. Per aprire un'immagine CCM, andare su file e quindi selezionare apri.

Una volta caricata l'immagine, le sue dimensioni e il tipo vengono visualizzati nella casella delle informazioni sull'immagine in alto a sinistra del pannello di controllo; la scala predefinita viene mostrata nella riga di modifica delle informazioni sull'immagine. Se la scala è diversa, modificare il numero nella riga di modifica. Per iniziare ad analizzare l'immagine, selezionare il parametro che si desidera misurare dalla casella metrica in alto a destra del pannello di controllo.

Nella casella dei risultati in fondo alla pagina, NFD e MBD sono presentati come numero effettivo. NFL è presentato in millimetri e la tortuosità come coefficiente di tortuosità. I risultati possono essere esportati in un foglio Excel.

Quando si apre la pagina di Excel, i risultati verranno presentati in numero per millimetro quadrato per NFD e MBD, millimetri per millimetro quadrato per NFL e coefficiente di tortuosità per NFT. Per effettuare queste misurazioni, iniziare segnando ogni nervo principale, quindi segnare ogni ramo del nervo principale. Infine, tracciare ogni nervo all'interno del campo.

Una penna digitale può essere utilizzata per ottenere una maggiore precisione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un minuto, se effettuata correttamente durante il tentativo di questa procedura. È importante seguire attentamente le istruzioni dettagliate.

Dopo aver visto questo video, speriamo che abbiate acquisito una buona comprensione di come lavorare e acquisire immagini dallo strato corneale di movimento mediante microscopia confocale corneale, e di come quantificare e analizzare le immagini di questo strato in pazienti con neuropatia periferica, in particolare neuropatia diabetica. E non dimenticate che lavorare con la CCM richiede competenze specifiche ed è stato raccomandato che la procedura sia eseguita da professionisti formati nell'esame oculare.