Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

Sono George Dimopoulos e ora vi mostreremo una procedura su come infettare la zanzara Aidas GTI con il virus della dengue. E la prima cosa che dovremo fare è propagare il virus in una linea cellulare di Aidas Aus. Mi chiamo Jose Luis Ramirez e sono uno studente di dottorato nel laboratorio ous.

Per questa procedura, avremo bisogno di una struttura BSL two con una cappa per colture tissutali, un incubatore a CO2 impostato a 37 gradi Celsius. Abbiamo bisogno di tubi conici di plastica da 50 ml. Abbiamo bisogno di siero umano, abbiamo bisogno di un bagno d'acqua, di una 37 gradi Celsius, di una centrifuga.

Abbiamo bisogno di piastre da 96 pozzetti e altri standard di biologia molecolare e biochimica, reagenti e materiali di consumo. Quindi questa è una normale cappa di coltura tissutale in una struttura BSL due, e il primo passo è estrarre le cellule che sono cresciute fino a una fluenza dell'80% di co in un pallone di 75 centimetri quadrati. Si tratta di un terreno MEM con il 10% di calore, calore e siero fetale bovino attivato integrato con l'1% di L-glutammina e aminoacidi non essenziali.

Ok, ora aggiungeremo il virus della dengue alle cellule. Abbiamo tolto la scorta di virus dal congelatore a meno 80 e l'abbiamo scongelata su un'incubatrice a 37 gradi. Aggiungiamo circa 0,5 millilitri di virus stock alle cellule per ottenere una concentrazione di circa 1,5 particelle virali per cellula.

Le cellule vengono quindi poste su uno shaker per circa 15 minuti a una velocità di agitazione lenta. Successivamente, le cellule vengono poste in un incubatore a CO2 per circa 45 minuti. A 37 gradi Celsius, la concentrazione di CO2 è del 5%Dopo l'incubazione di 45 minuti, estrarremo le cellule e aggiungeremo 30 ml di terreno, quindi metteremo nuovamente le cellule nell'incubatore e incuberemo per altri cinque giorni.

Ora prepareremo le particelle virali per l'infezione. Per prima cosa, dobbiamo staccare le cellule dal pallone con un raschietto e poi trasferirle insieme a un terreno in una provetta conica da 50 ml. Ora abbiamo celle di centrifugazione a 12.000 giri/min per 10 minuti per pellettizzarle.

Sul fondo di questa bottiglia si può vedere il pellet. Successivamente, rimuoveremo il surnatante e lasceremo solo un ml con le cellule per rilasciare il virus dalle cellule. Li congeleremo.

Questo romperà le cellule, e poi le scongelaremo e poi le congeleremo di nuovo e ripeteremo questa procedura tre o quattro volte e il congelamento viene effettuato su ghiaccio secco. Dopo il congelamento, il pellet di cellule viene posto su un bagno d'acqua a 37 gradi per scongelarle, quindi vengono nuovamente congelate sugli occhi asciutti tra ogni fase di congelamento, WEP sospende le cellule attraverso il vortex. Ora stiamo raccogliendo il virus contenente surnatante e aggiungendolo al surnatante della centrifugazione precedente, che contiene anche particelle virali.

Questo preparato virale è ora pronto per essere combinato con una quantità uguale di sangue umano intero e siero. Qui abbiamo combinato il preparato virale con sangue umano intero integrato con il 15% di siero umano. Questa soluzione per il virus del sangue sta per essere utilizzata ora per nutrire le zanzare e infettarle.

Aggiungeremo questo sangue in un alimentatore a membrana e questo alimentatore a membrana verrà posizionato su una tazza contenente le zanzare e lasceremo che le zanzare si nutrano di questo sangue per circa 25 minuti. Abbiamo posizionato una clip sull'alimentatore a membrana per stabilizzarlo. Lo appesantisce fondamentalmente sulla rete e ora aggiungeremo il sangue nell'alimentatore.

In alcune occasioni, questo esperimento può funzionare meglio quando viene fatto al buio poiché naturalmente le zanzare si nutrono spesso al buio. Questo dipende ovviamente da come è stata condizionata la colonia di zanzare. Le zanzare si sono nutrite per circa 25-30 minuti e possiamo rimuovere l'alimentatore a membrana e metterlo in un contenitore sicuro per la decontaminazione.

Dopo l'applicazione del sangue, le zanzare non idonee devono essere rimosse da quelle della Fed. Per fare questo, abbiamo abbattuto le zanzare mettendo le piccole tazze contenenti le zanzare alimentate con sangue in una stanza fredda per 5-10 minuti. Come possiamo vedere, le zanzare sono già a terra al freddo.

Apriamo il coperchio e trasferiamo le zanzare in una piccola ciotola di benzina, che viene tenuta su un secchiello del ghiaccio in modo che le zanzare siano tenute al freddo per tutto il tempo e non possano scappare. Ricorda, queste sono zanzare infette, quindi bisogna fare tutta la cura per non lasciarle andare. Una volta che le zanzare sono giù nella cella frigorifera, che trasferisce le zanzare al normale insectory, che viene mantenuto a temperatura ambiente, ma mettiamo le zanzare sempre nella capsula di Petro, che viene tenuta nel secchiello del ghiaccio, in modo che siano lì in modo che siano sempre giù.

Si può vedere come le zanzare della Fed possono essere rimosse da quelle dell'UNFI. Quelli della Fed hanno il sangue in loro. Sono completamente ingarbugliati.

Alcuni di loro si sono nutriti parzialmente di sangue in modo da non essere completamente ingorgati. Hanno un piccolo sangue nell'addome, ma altri hanno molto sangue nell'addome. Quelli dell'UNFI non hanno sangue nell'addome, e quindi si può facilmente distinguere tra quelli della Fed e quelli non adatti.

Quindi trasferiremo queste zanzare dalla ciotola della benzina alle tazze di cartone della linea di cera. Il passo successivo è quello di analizzare l'infezione da virus dengue nella zanzara. Se vogliamo analizzare l'infezione virale nell'intestino medio della zanzara, dovremmo sezionare le zanzare intorno al settimo giorno dopo che hanno assunto il pasto di sangue.

E se vuoi analizzare l'infezione virale nella ghiandola del sale, dovremmo sezionare le zanzare a circa 14 giorni dopo l'alimentazione del sangue, Jose ora ti mostrerà come sezionare l'intestino dalla zanzara. Le zanzare sono state anestetizzate sul ghiaccio e le uccideremo attraverso un'incubazione in etanolo al 70% per circa un minuto. Successivamente, trasferiamo le zanzare in due bagni d'acqua successivi.

Un minuto ciascuno. Questo serve a lavare via l'etanolo dalle zanzare. Ora sezioniamo le zanzare in PBS su vetrini da microscopio.

Il modo migliore per sezionare l'intestino medio da una zanzara del tempo di gesso è posizionare la zanzara a testa in giù sulle ali e afferrare la parte addominale con una pinza e il torace con un'altra pinza, e poi tirare la zanzara. Ora Jose sta separando la zanzara e l'intestino apparirà tra l'addome e la parte toracica della zanzara. Ora l'intestino è il tessuto semitrasparente che è apparso sulla parte superiore della zanzara.

Ora trasferiremo l'intestino sezionato in un terreno di coltura cellulare e lo porteremo nella cappa di coltura tissutale per isolare le particelle virali dall'intestino. Portiamo l'intestino medio sezionato nella sala di coltura dei tessuti e omogeneizziamo con un pestello per rilasciare le particelle virali. Dopo l'omogeneizzazione dell'intestino medio, aggiungiamo del terreno all'omogenato per ottenere una diluizione da uno a 100 delle particelle virali.

Quindi continuiamo a diluirlo ulteriormente a 1 a 10, da 1 a 101 a 1000. Nella piastra a 96 pozzetti, abbiamo preparato una linea di cellule pittografiche Alba con una fluenza dell'80% di co in una piastra a 24 pozzetti. Quindi rimuoviamo il surnatante dalle cellule pittopitarie di iato alba e a queste cellule aggiungiamo le particelle virali diluite per determinare la concentrazione di particelle virali in ogni diluizione.

Questo ci permetterà di determinare il livello di infezione del virus. Nell'intestino medio della zanzara, le cellule vengono quindi agitate lentamente per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi posizioniamo le celle per 45 minuti nell'incubatore a CO2 a 37 gradi.

Successivamente aggiungiamo un ml di rivestimento di metilcellulosa all'1% a ciascun pozzetto e la piastra viene quindi incubata nuovamente a 37 gradi di CO2 Incubator per cinque giorni. Dopo l'incubazione di cinque giorni, aggiungiamo un ml di un fissativo acetone metanolo a ciascun pozzetto. Quindi incubiamo la piastra a quattro gradi Celsius in frigorifero per un'ora.

Successivamente, rimuoviamo il fissativo e laviamo ogni pozzetto una volta con PBS. Successivamente, effettuiamo una diluizione da uno a 1000 dell'anticorpo primario anti dengue in una soluzione di sangue al 5%. Successivamente, aggiungiamo 200 microlitri di questa soluzione anticorpale.

A ciascuno, bene Muovi la testa. Grazie. Successivamente, incubiamo la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente rimuoviamo il liquido iperimmune e laviamo ogni pozzetto con un XPBS.

Successivamente, ripetiamo la procedura esattamente allo stesso modo con un anticorpo secondario. Ci vengono preparati 20 ml di substrato secondo il protocollo e lo aggiungiamo in un contenitore. Quindi aggiungiamo 200 microlitri di substrato a ciascun pozzetto.

Successivamente fermiamo la reazione rimuovendo il substrato e aggiungiamo un ml di acqua distillata a ciascun pozzetto. Quindi scartiamo l'acqua dal piatto e lasciamo asciugare il piatto. Ogni punto di colore rappresenta una placca di virus e, contando queste placche, possiamo stimare il numero di particelle virali che si trovavano nell'intestino medio originale della zanzara che abbiamo omogeneizzato.

Ti abbiamo appena mostrato la procedura di come eseguire un'infezione da virus dengue nella zanzara aegypti. Questo protocollo prevede la produzione di virus nella linea cellulare di zanzara. Le particelle virali vengono quindi purificate dalla linea cellulare e isolate, e vengono mescolate con sangue intero umano e somministrate alle zanzare.

Il virus infetterà le zanzare e, una volta stabilita l'infezione, vi abbiamo mostrato come isolare il tessuto intestinale medio della zanzara e come determinare il livello di infezione di questo intestino medio. Fondamentalmente omogeneizziamo l'intestino medio e usiamo la procedura per rilasciare le particelle virali da questo intestino medio. Quindi usiamo queste particelle virali per infettare nuovamente la linea cellulare della zanzara al fine di determinare il livello di infezione dell'intestino medio, il numero di particelle virali che hanno infettato l'intestino della zanzara.