Determinazione del ruolo delle cellule simili ai neutrofili nella sensibilità delle cellule di linfoma a un farmaco in esame

Prelevare una piastra a più pozzetti contenente monocolture sferoidi 3D di cellule di linfoma, globuli bianchi cancerosi e co-colture di cellule simili a linfomi e neutrofili in una matrice di membrana basale.

Aggiungi un farmaco di prova che si lega alla tubulina intracellulare e interrompe la polimerizzazione dei microtubuli, provocando l'apoptosi cellulare.

Nella co-coltura, il contatto diretto con le cellule del linfoma attiva le cellule simili ai neutrofili, inducendo la secrezione di citochine.

Queste citochine interagiscono con i recettori delle cellule del linfoma, innescando cascate di segnalazione a valle e sovraregolando l'espressione proteica anti-apoptotica, promuovendo la sopravvivenza cellulare.

Eliminare il supporto. Aggiungere un tampone di dissociazione per interrompere l'adesione cellulare.

Raschiare gli sferoidi e incubarli sotto agitazione. Trasferire la sospensione in provette e continuare l'agitazione per formare sospensioni unicellulari.

Introdurre un cocktail di anticorpi coniugati con fluorofori che marcano il linfoma e le cellule simili ai neutrofili.

Aggiungere l'annessina V marcata con fluoroforo e lo ioduro di propidio per marcare le cellule apoptotiche e morte.

Utilizzando la citometria a flusso, rilevare un aumento della sopravvivenza delle cellule di linfoma nella co-coltura, indicando una protezione mediata dai neutrofili contro il farmaco.

Per impostare una co-coltura 3D, aggiungere 50.000 cellule B di linfoma RL da sole o mescolare con cellule differenziate HL60 in provette sterili da 15 millilitri.

Centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 300 microlitri di matrice a membrana basale utilizzando una punta per pipetta da 1 millilitro con l'apertura tagliata a 2 o 3 millimetri. Successivamente, incubare 300 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Al termine dell'incubazione, aggiungere 1 millilitro di terreno RPMI completo a ciascun pozzetto e tornare alle colture 3D nell'incubatore per altri sette giorni con cambi di terreno ogni due giorni. Il giorno 5, aggiungere 10 nanomolari di vincristina alle colture.

Dopo una settimana di coltura, aspirare il terreno e lavare ogni pozzetto 2 volte con 1 millilitro di PBS ghiacciato. Quindi, aggiungi 3 millilitri di PBS ghiacciato con EDTA a ciascun pozzetto e raschia il fondo dei pozzetti con una punta di pipetta da 200 microlitri per staccare i gel. Agitare delicatamente la piastra con ghiaccio per 30 minuti. Quindi, trasferire le sospensioni cellulari in singole provette sterili da 15 millilitri per agitarle delicatamente con ghiaccio per altri 30 minuti.

Confermare l'aspetto di una sospensione cellulare omogenea. Quindi, centrifugare le cellule, seguito da un lavaggio PBS, e risospendere i pellet in PBS fresco con FBS. Infine, etichettare le cellule con gli anticorpi appropriati e i coloranti vitali come appena dimostrato e analizzare le cellule differenziate RL e HL60 mediante citometria a flusso utilizzando la strategia di gating illustrata.