Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

Il contatore di cellule con scettro è un dispositivo portatile automatizzato per il conteggio delle cellule, il monitoraggio del diametro e del volume delle cellule e il controllo della salute e della qualità delle popolazioni cellulari. Offre vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di conteggio, tra cui una maggiore precisione, facilità d'uso e basso costo per contare le cellule. Utilizzando lo scettro, seguire le istruzioni sul suo display grafico per aspirare le cellule nel sensore monouso.

Le cellule vengono quindi contate e il dispositivo riporta le concentrazioni e le statistiche delle cellule, che possono essere caricate su un computer e analizzate. Ciao, sono Sonya. Sono un ricercatore qui a Millport, e oggi vi mostrerò come usare lo scettro.

Contatore di cellule Il conteggio delle cellule è un passaggio necessario ma noioso per la coltura cellulare in vitro. Le concentrazioni costanti delle cellule garantiscono la riproducibilità e l'accuratezza degli esperimenti. La conta cellulare è importante per monitorare la salute e il tasso di proliferazione cellulare, valutare le cellule immortali o di trasformazione per successivi esperimenti, trasfezione o infezione e prepararsi per i saggi basati su cellule nonostante la necessità di velocità e precisione.

Per quanto riguarda il conteggio delle cellule, il 71% dei 400 ricercatori ha esaminato il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Sebbene l'emocitometria sia poco costosa, è laboriosa e soggetta a pregiudizi e uso improprio da parte dell'utente, il che si traduce in conteggi imprecisi. Le fonti di errore nell'emocitometria includono una distribuzione irregolare delle cellule nel campione, troppe o troppo poche cellule nel campione.

Decisioni soggettive sul fatto che una determinata cella rientri nell'area di conteggio definita. Contaminazione dell'emocitometro, variazione del numero di giorni dell'utente e variazione della velocità di riempimento dell'emocitometro per alleviare la noia associata al conteggio manuale. Il 29% dei ricercatori conta le cellule utilizzando dispositivi di conteggio automatico delle cellule.

Tuttavia, per la maggior parte dei ricercatori, il prezzo associato a questi grandi strumenti da banco è un ostacolo al loro utilizzo. Il contatore di celle a scettro è un dispositivo portatile automatizzato che offre l'automazione e l'accuratezza del conteggio dei coter a un costo relativamente basso in un formato portatile facile da usare. Il sistema impiega il principio di Coter del rilevamento di particelle basato sull'impedenza in un formato miniaturizzato utilizzando una combinazione di hardware analogico e digitale per l'elaborazione del segnale di rilevamento, l'archiviazione dei dati e la visualizzazione grafica.

Il sensore monouso è progettato con una zona di rilevamento cellulare microfabbricata che consente la discriminazione in base alle dimensioni e al volume delle celle con una risoluzione inferiore al micron e al picolitro migliorata con canali di manipolazione dei liquidi di precisione ed elettronica. Il contatore di cellule a scettro visualizza graficamente le statistiche sulla popolazione cellulare come un istogramma da utilizzare. Il contatore di cellule con scettro inizia diluendo una singola sospensione cellulare di cellule in soluzione salina tamponata con fosfato.

Una concentrazione da 10.000 a 500.000 cellule per millilitro è ottimale. Trasferire 100 microlitri di cellule diluite in una provetta microview da 1,5 millilitri. Accendi il contatore di celle dello scettro tenendo premuto l'interruttore sul retro dello strumento e attendi che appaiano le istruzioni sullo schermo.

Quando richiesto, collegare un sensore all'estremità dell'unità scettro con il pannello di rilevamento degli elettrodi rivolto verso la parte anteriore dello strumento. I sensori a scettro sono costituiti da una camera di campionamento stampata con precisione con una zona di rilevamento elettronica ed elettrodi di rilevamento delle celle integrati. I sensori consentono di discriminare le dimensioni delle cellule con risoluzione submicronica e il volume delle cellule con risoluzione inferiore ai picolitri.

L'ingegneria coerente dei sensori garantisce che vengano contati volumi di campione uguali e che vengano effettuate misurazioni accurate delle dimensioni. Una volta collegato il sensore, eseguire ogni fase del processo di conteggio secondo le istruzioni sullo schermo come segue. Quando lo schermo legge, tieni premuto lo stantuffo per iniziare a premere lo stantuffo, lo schermo leggerà quindi immergere il sensore, immergere il sensore nella soluzione di sospensione cellulare e rilasciare lo stantuffo per aspirare la sospensione cellulare nel sensore.

Lo stantuffo funge da segnale elettrico e attira il campione e il volume morto nel sensore. La velocità o l'accuratezza dell'immersione non hanno importanza come nel caso del pipettaggio. Questo processo richiederà alcuni secondi quando è pronto.

Lo strumento emetterà un segnale acustico e sullo schermo verrà visualizzato sample caricato. Una volta caricato il campione nel sensore, viene aspirato attraverso la zona di rilevamento per valutare le dimensioni e il volume delle celle. Quindi, attraverso i microcanali, una volta contati 50 microlitri di campione, il sensore dice allo strumento di interrompere il conteggio.

Al termine del conteggio, lo schermo dello strumento leggerà il conteggio completato. Rimuovere il sensore e gettarlo. Seguire le istruzioni e rimuovere ed eliminare il sensore.

Lo strumento visualizzerà quindi un istogramma delle dimensioni o del diametro delle cellule sullo schermo, nonché la concentrazione di cellule per millilitro. Dopo che il conteggio è completo e l'istogramma è stato visualizzato sullo strumento, applicare i varchi premendo il pulsante di attivazione/disattivazione, selezionare il gating automatico o utilizzare l'ultimo per impostare automaticamente il gate in base al profilo dell'istogramma o per utilizzare i gate del conteggio precedente. Indipendentemente dalla selezione, i cancelli possono essere spostati manualmente a fine.

Sintonizzare i dati, premere nuovamente il pulsante di commutazione per selezionare il cancello sinistro e scorrere l'interruttore per spostare il cancello come desiderato. Quindi premere nuovamente l'interruttore per attivare il cancello destro e scorrere l'interruttore per posizionare il cancello destro. Fare clic di nuovo.

Verranno visualizzati una nuova concentrazione cellulare, il volume medio e il diametro cellulare. L'interruttore può anche essere spostato su entrambi i lati per alternare la visualizzazione tra data e ora, dimensione media della cella e volume medio della cella, è possibile memorizzare fino a 72 istogrammi sullo strumento stesso. Per caricare i dati su un personal computer, collegare lo strumento tramite la porta del cavo USB, sullo schermo del display del pc.

Fare doppio clic sull'applicazione software dello scettro per avviare il software. Quindi fare clic su Connetti. Tutti i conteggi verranno automaticamente trasferiti al software.

Il software applicativo dello scettro visualizza l'istogramma che descrive in dettaglio la distribuzione della popolazione della coltura in volume o diametro. I file scaricati possono quindi essere esportati in Microsoft Excel, dove i dati grezzi verranno visualizzati in contenitori di diametri o volumi di celle specificati. Sono state preparate 19 diverse linee cellulari per il conteggio e le concentrazioni iniziali teoriche sono state determinate utilizzando il contatore di acultro.

Queste sospensioni cellulari sono state poi ulteriormente diluite per ottenere sospensioni cellulari a concentrazioni cellulari teoriche. Il contatore di cellule a scettro è stato quindi utilizzato per determinare le concentrazioni cellulari. Questa figura mostra cinque diluizioni che sono state misurate per cinque linee cellulari rappresentative insieme alla concentrazione teorica delle cellule.

L'alto grado di linearità, come indicato dai valori di r al quadrato, dimostra che il conteggio degli scettri è un metodo affidabile per le linee cellulari testate in un ampio intervallo operativo lineare. L'accuratezza relativa complessiva del conteggio degli scettri è dimostrata qui, in cui i dati ottenuti dal conteggio degli scettri vengono confrontati con i conteggi ottenuti dal conteggio dei coter. Il registro della conta delle cellule dello scettro viene confrontato con il registro della conta dei coter e mostra che in tutte le linee cellulari testate la conta degli scettri corrisponde alla conta dei coter.

I conteggi di 19 linee cellulari sono stati eseguiti utilizzando un contatore di due coltri Z. Il contatore di cellule scettro, un contatore automatizzato basato sulla visione, come le cellule V o il sistema di test della conta, e un conteggio emoTER sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore utilizzando la stessa sospensione iniziale della cella e diluizioni identiche. I risultati mostrati in questa figura dimostrano che le concentrazioni cellulari misurate mediante il conteggio degli scettri corrispondono strettamente alle concentrazioni cellulari teoriche con un'elevata linearità.

Il coefficiente di variazione percentuale o CV è stato calcolato per ogni diluizione di ciascuna linea cellulare. Per ogni sistema di conteggio mostrato di seguito sono riportate la percentuale media di CVS su 19 linee cellulari rispetto alla concentrazione cellulare e al metodo di conteggio all'interno dell'intervallo operativo. Il contatore di cellule a scettro è più preciso del conteggio dell'emocitometro, mostrando deviazioni standard più piccole e coefficienti di variazione medi più piccoli.

Il conteggio degli scettri è 10 volte più veloce dell'emocitometria e anche più veloce di altri contatori automatici. Qui sono state contate le cellule SF nove, MCF sette e HC 2 93 utilizzando i metodi descritti in questo video. È stato registrato il tempo medio necessario per misurare la concentrazione cellulare.

Si noti che l'emocitometria è stata eseguita solo una volta per campione. Scepter effettua misurazioni in base alle dimensioni delle celle. Pertanto, qualsiasi cambiamento nella morfologia cellulare può essere catturato nell'istogramma.

Le colture sane mostrano una bella distribuzione gaussiana a forma di campana, mentre le cellule malsane fanno i pidocchi e causano uno spostamento dell'istogramma a sinistra. Allo stesso modo, quando una popolazione del 50% di cellule morte è stata mescolata con il 50% di cellule vive, sono stati osservati anche spostamenti dell'istogramma. Vi ho appena mostrato come utilizzare il nuovo contatore di cellule a scettro per i millipori, che sta rivoluzionando il modo in cui i ricercatori contano le loro cellule.