Protocollo per la cura dei Mosquito (A. gambiae)

Il mio nome è Shish e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio del Dott. George OU presso la John Hopkins School of Public Health. Nel Dipartimento di Microbiologia Molecolare e Immunologia, mostrerò come allevare le zanzare *phis Gambi*. In laboratorio, le manteniamo nella stanza per insetti, che di solito è mantenuta a 27 gradi centigradi e all'80% di umidità.

La stanza degli insetti viene mantenuta anche in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, in modo da poter simulare le condizioni naturali. Questa è dunque la stanza degli insetti che abbiamo, una struttura centrale qui presente, dedicata al mantenimento di questi insetti. Come si può vedere, ci sono diversi vassoi contenenti zanzare in tutte le fasi di sviluppo: uova, stadi larvali e pupe.

Questi vassoi contengono larve di circa 11 o 12 giorni e questa è una gabbia in cui raccogliamo le zanzare adulte, mantenendole in soluzione di saccarosio al 10%. Per iniziare l'allevamento delle zanzare, dobbiamo nutrire le zanzare con sangue, poiché necessitano delle proteine del sangue per deporre le uova. Il giorno uno è il giorno successivo al raggruppamento degli adulti nella gabbia e al loro mantenimento con saccarosio al 10%.

Il giorno uno prevede di nutrire le zanzare con sangue, ed è per questo che si ricorre all'alimentazione artificiale attraverso membrana. Si tratta di un alimentatore in vetro, che utilizziamo per la somministrazione di sangue tramite membrana alle zanzare. Inseriamo il sangue all'interno attraverso il piccolo foro che si vede, e il sangue rimane contenuto in esso.

In basso lateralmente sono presenti due ugelli, collegati a un bagno d'acqua mantenuto a 37 gradi. Per mantenere il sangue a 37 gradi e preparare l'alimentatore per l'alimentazione, prendiamo un piccolo pezzo di paraffina. Lo stendiamo dai due estremi su tutti e quattro i lati, quindi lo posizioniamo sul lato aperto dell'alimentatore di vetro in modo da formare un sottile strato di membrana che imiti la pelle.

Questo è ciò che viene chiamato alimentazione tramite membrana. Si tratta di un bagno d'acqua circolante, che mantiene l'acqua a 37 °C e la circola attraverso l'alimentatore di vetro in modo che il sangue rimanga caldo a 37 °C. Colleghiamo quindi l'alimentatore di vetro attraverso i piccoli capillari e lo connettiamo al bagno d'acqua circolante, accendendo il bagno in modo che l'acqua circoli; l'acqua e il sangue non si mescolano mai poiché si trovano in due camere separate.

Questa è una gabbia di zanzare adulte di Phis Gambi. Questo è il beccuccio di vetro, che viene collegato al bagno circolante, e posizioniamo una pinza sulla parte superiore della gabbia aggiungendo 200 microlitri di sangue. La gabbia contiene sia zanzare maschili che femminili.

È solo la femmina che si avvicina per nutrirsi di sangue. Il pasto dura circa 30 minuti. Due giorni dopo l'assunzione di sangue, posizioniamo dei bicchieri per le uova all'interno della gabbia delle zanzare affinché vi depongano le uova.

Questo è il modo in cui si procede. Prendiamo un becher piccolo, lo riempiamo parzialmente con acqua distillata, prendiamo un foglio di carta e lo arrotoliamo a forma di cono, quindi lo inseriamo nel becher contenente l'acqua distillata e ci assicuriamo che il peperoncino indiano venga inumidito. Ora apriamo lentamente la gabbia delle zanzare avendo cura di non farne uscire alcuna e inseriamo all'interno i contenitori per le uova.

Il giorno successivo all'inserimento dei bicchieri nella gabbia, ovvero il quarto giorno, questi vengono estratti lentamente dalla gabbia. Queste sono le uova, quelle nere, tra cui si trovano anche alcune zanzare morte. Una volta pronte le uova, le si pongono su un vassoio di plastica.

Nel passato, il vassoio di plastica viene riempito con acqua distillata. Prendere il filtro con le uova e rimuoverlo. Aggiungere anche un pizzico di alimento A, che è cibo per pesci macinato, e posizionare il vassoio sullo scaffale.

Dovremmo livellare il vassoio il giorno in cui iniziamo il vassoio e indicare anche quali specie sono presenti. Questo è il giorno successivo, cioè il giorno dopo aver inserito l'uovo nel vassoio. Cioè, questi hanno un giorno di vita, ma il protocollo effettivo è al quinto giorno del ciclo della zanzara.

Questi neri sono le uova, che stanno per schiudersi in larve. E questo è il cibo per le zanzare. Per l'allevamento delle zanzare, di solito utilizziamo tre tipi diversi di alimenti.

Il cibo A è in realtà cibo per pesci macinato, e questo cibo lo aggiungiamo all'inizio della coltura di zanzare, quando si trovano alla fase X; ogni giorno aggiungiamo due compresse di cibo C, ovvero cibo per gatti acquistato da Purina. Dopo otto o nove giorni, cambiamo l'acqua del vassoio e aggiungiamo acqua fresca. In quel momento, invece del cibo A, aggiungiamo una presa di cibo B, che non è altro che cibo macinato, C, cioè cibo per gatti macinato, oltre ad aggiungere due compresse di cibo C; le uova schiudono in larve.

E ci sono tre stadi diversi delle larve. Primo stadio, secondo stadio e terzo stadio. Questi sono vassoi che contengono larve di cinque o sei giorni di età.

Questi Ravi, che si trovano in una fase molto più avanzata, come nove-dieci giorni di vita, hanno avuto l'acqua sostituita e sono stati aggiunti acqua fresca e cibo fresco. Questo vassoio contiene sia gli adulti che i ppe.

Questi sono gli adulti, come potete vedere, che volano sotto le zanzariere. E lungo il bordo potete vedere tutti i ppe di colore scuro, che si schiuderanno in adulti. Una volta ottenuti gli adulti, sono pronti per essere raccolti in una gabbia, simile a questa.

È foderato internamente con carta assorbente e contiene un piccolo flacone con una soluzione al 10% e un batuffolo di cotone imbevuto di sapone, che fungerà da fonte alimentare per le zanzare. Abbiamo quindi coperto il coperchio, e questo è l'apparato, l'aspiratore, che è collegato al vuoto attraverso il quale raccoglieremo gli adulti da questi vassoi. Questa parte dell'aspiratore è collegata qui ed è all'altra estremità.

Collegato al vuoto. Inseriamo la gabbia, dove raccoglieremo gli adulti in questo piccolo contenitore. Questa è un'altra parte dell'aspiratore, che ha un tubo lungo, da inserire all'interno del vassoio per zanzare.

L'altro lato verrà collegato alla gabbia. È necessario assicurarsi che tutto sia ben stretto, in modo che il vuoto funzioni correttamente. Chiudiamo il coperchio e verifichiamo che tutto sia ben sigillato.

Avviare lentamente il backend. Una volta che l'allestimento è pronto, inserire lentamente questo lungo tubo all'interno del vassoio delle zanzare, assicurandosi di chiudere la rete e di non permettere alle zanzare di scappare. Come si può vedere, le zanzare vengono raccolte nella piccola gabbia.

Portate lentamente il tubo in giro per raccogliere tutti gli adulti. Ora ho quasi finito. Tutti gli adulti sono stati raccolti e si trovano tutti in questa gabbia, che potete vedere.

Poi, lentamente, rilasciamo il vuoto e smontiamo l'apparato di raccolta. Questi sono gli adulti di Ana Gambi, che rimarranno in questa gabbia per alcuni giorni. Verranno nutriti con soluzione di saccarosio al 10% e riceveranno sangue da ingerire solo quando sarà necessario deporre le uova.

Vi ho appena mostrato come utilizzare i contenitori per zanzare. Nelle condizioni di laboratorio, i passaggi importanti sono l'alimentazione con sangue. Successivamente si posizionano i bicchieri per le uova, si seguono le uova, che poi attraversano diverse fasi come larve, pupe e adulti.

E infine, raccogliamo gli adulti. L'importanza di questa tecnica consiste nel dover mimare le condizioni presenti all'esterno in ambienti naturali, in modo da ottenere zanzare sane, per poi infettarle con il plasmodio ed effettuare diversi tipi di studi sulla malaria, il cui obiettivo principale è l'eliminazione della malattia dal mondo.