Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è la microfabbricazione di dispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule in ambienti di coltura bidimensionali e tridimensionali. Questo risultato si ottiene mediante una tecnica di stampaggio e sovrapposizione a più strati, che consente di produrre un reticolo di micropilastri attivati verticalmente. Come secondo passaggio, il reticolo di micropilastri attivati verticalmente viene modificato per stirare un film di coltura, applicando così deformazioni ben controllate alle cellule coltivate sul film.

In alternativa, l'array può essere modificato per comprimere costrutti di biomateriali con micro-pattern al fine di applicare una stimolazione meccanica alle cellule. I risultati ottenuti dalla coltura in un array di idrogeli tridimensionali mostrano l'applicazione simultanea di una gamma di deformazioni biaxiali ecografiche bidimensionali e di compressioni tridimensionali sull'intero array, basata sull'analisi di immagini di marcatori fluorescenti fiduciali. Ciao, sono Chris Mariahs dai laboratori di Craig Simmons e U Sun del Dipartimento di Ingegneria Meccanica e Industriale e dell'Istituto di Biomateriali e Ingegneria Biomedica dell'Università di Toronto.

Oggi vi mostreremo un procedimento per fabbricare microdispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come le cellule rispondono a una varietà di forze meccaniche in colture in vitro. Cominciamo dunque.

Il processo di fabbricazione dello stampo a sandwich prevede il posizionamento di una pellicola trasparente per fotoriproduzioni su una superficie di poli dimetil silossano non polimerizzato, o PDMS, posta su un master in SU-8. Il sandwich viene quindi inserito in una pila costituita da schiuma, vetro e metallo e polimerizzato in forno sotto compressione. Infine, la pila viene smontata e la pellicola trasparente viene rimossa, lasciando uno strato di PDMS con il disegno desiderato.

Per iniziare questo processo, mescolare accuratamente PDMS, monomero e crosslinker. Nel rapporto standard di 10 a 1, depositare tre millilitri della miscela di PDMS non polimerizzato su un master in SU-8 precedentemente realizzato e degasare il polimero in una camera a vuoto. Successivamente, posizionare il tampone in schiuma e il master in SU-8 su una piastra di base in plexiglass.

Abbassi con attenzione il lato liscio di una trasparenza per stampante a getto d'inchiostro sulla PDMS non polimerizzata, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria. Poi posizioni un vetrino silanizzato sopra la trasparenza al di sotto del secondo cuscinetto di schiuma e di una piastra superiore in plexiglass. Fissi il sandwich insieme utilizzando una morsetto a C.

Polimerizzare il sandwich in PDMS in un forno a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Dopo la polimerizzazione, rimuovere il sandwich dal forno e lasciarlo raffreddare. Una volta raffreddato, rimuovere la morsa e smontare il sandwich.

Staccare con attenzione la trasparenza dal master SU-8, mantenendo il film di PDMS del brevetto. Tagliare i bordi del film stampato per rimuovere l'eccesso di PDMS e conservare i livelli stampati in un ambiente privo di polvere fino al momento dell'utilizzo. La parte successiva di questo protocollo riguarda la costruzione di un array microfabbricato di micropilastri azionati verticalmente.

È necessario un processo di fabbricazione multistrato per realizzare l'array di micro-pilastri. Lo strato inferiore di PDMS strutturato viene preparato mediante fabbricazione con stampo a sandwich. Per questi esperimenti, sono stati utilizzati schemi circolari con diametro compreso tra 600 e 1.200 micron.

Per trasferire lo strato di PDMS su un vetrino pulito, utilizzare un'unità a scarica al corona per trattare le superfici di PDMS e vetro con plasma di ossigeno. Successivamente, porre le due superfici a contatto l'una con l'altra. Posizionare l'impilato su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius per 10 minuti per completare il processo di legame.

Rimuovere la pellicola trasparente e scartarla. Questo processo garantisce che il film di PDMS strutturato non venga mai separato da un substrato rigido, prevenendo così il restringimento dei singoli strati. Il secondo strato modellato a sandwich viene formato come stampo replicato negativo della struttura desiderata della membrana e dei pilastri.

In questa dimostrazione, sono stati utilizzati perni circolari del diametro di 500 micrometri per formare questo strato. Innanzitutto, fissare temporaneamente il mold in replica negativa a un vetrino utilizzando nastro adesivo doppio e siloizzare in un essiccatore sotto vuoto. Depositare PDMS non polimerizzato sul sandwich, sullo strato mold, sottoporre a degasaggio e applicare la tecnica dello spin coating per 45 secondi a 1000 giri al minuto, ottenendo così una membrana attuatrice spessa 60 micrometri. Polimerizzare parzialmente lo strato di PDMS ottenuto con lo spin coating a 80 gradi Celsius per circa 20 minuti, oppure fino a quando il PDMS risulta appiccicoso ma non si deforma permanentemente al tatto. A questo punto, rimuovere il vetrino e il nastro adesivo doppio dallo strato di PDMS parzialmente polimerizzato e fissare il film trasparente a una coppia di vetrini ausiliari per la manipolazione, quindi sottoporre a trattamento al plasma.

Trattare il PDMS parzialmente polimerizzato, quindi capovolgere il PDMS e posizionarlo in un allineatore su misura. L'allineatore è costituito da un morsetto a vuoto montato su un micromanipolatore. Successivamente, sottoporre a trattamento al plasma il primo strato di PDMS, quindi posizionarlo su una piattaforma rotante al di sotto del morsetto a vuoto.

Osservare l'allineamento tra i due strati mediante un sistema di visione artificiale con ingrandimento 12 volte. Utilizzando il manipolatore, allineare gli strati e avvicinarli con attenzione fino al contatto. Applicare una leggera pressione con un dito per far aderire gli strati tra loro.

Quindi rimuovere il sandwich dall'allineatore. Rimuovere le slide di vetro di supporto e assicurarsi che gli strati siano a completo contatto tra loro. Polimerizzare in forno a 80 gradi Celsius per ulteriori 30 minuti.

Dopo 30 minuti, il modulo in PDMS trasparente e stratificato può essere staccato dal dispositivo e smaltito. Il dispositivo viene quindi completamente reticolato a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore, per consentire esperimenti su cellule coltivate su un substrato bidimensionale deformabile. L'array di micromotuatori viene modificato unendo un terzo strato di PDMS al dispositivo.

Il terzo strato di PDMS è costituito da una struttura a due strati. Il cerchio inferiore corrisponde alle dimensioni della cavità di attuazione situata al di sotto dei microperni attuati. Il diametro del cerchio superiore è di 100 micron maggiore rispetto al diametro dei perni di carico.

Un microcanale largo 200 micron collega queste caratteristiche a un'area di connessione e verrà utilizzato per lubrificare i perni di carico e il film di coltura. Per modificare il dispositivo per la coltura in 2D, fabbricare e incollare prima i connettori ad esso come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, applicare per centrifugazione uno strato di PDMS spesso da 10 a 15 micron sul lato liscio di una pellicola trasparente e polimerizzare.

Fare essiccare il sottile film di PDMS a 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Il passo successivo consiste nell'applicare un vuoto agli attuatori e incollare lo strato di PDMS al dispositivo. Per realizzare ciò.

Prima di tutto, applicare un vuoto a basso livello agli attuatori, abbassando l'array di perni; eseguire il trattamento al plasma e la saldatura. Rivestire con spin coating il film di PDMS sul dispositivo microattuato come descritto nel protocollo scritto; i perni e il film per colture rimarranno idrofili per un breve periodo. Successivamente, collegare la siringa del lubrificante al dispositivo e riempire i canali di lubrificazione con una soluzione al 90% di glicerolo in acqua deionizzata.

Oltre alla lubrificazione, questa formulazione mantiene indefinitamente l'idrofilicità del PDMS, riducendo i coefficienti di attrito. Posizionare il dispositivo su una piastra riscaldante a 40 gradi Celsius e continuare a iniettare lubrificante nel canale, provocando un lieve aumento di pressione. Dopo alcuni minuti, le bolle d'aria si diffondono attraverso il PDMS e tutte le superfici risulteranno lubrificate.

Per l'ultimo passaggio, rimuovere la pressione negativa rilasciando i perni utilizzando un bisturi. Tagliare attorno al sottile film di PDMS. Staccare con attenzione il supporto trasparente dal legame al plasma del dispositivo.

Un guarnizione in PDMS tagliata a mano intorno all'area di coltura del dispositivo. Sterilizzare il dispositivo immergendolo in etanolo al 70% per cinque minuti, seguito da un trattamento sotto luce UV germicida in una cappa a sicurezza biologica per 45 minuti. Trattare la superficie al plasma e incubare con collagene a 100 microgrammi per millilitro durante la notte a quattro gradi Celsius.

Dopo un'incubazione notturna, lavare il dispositivo con soluzione salina tamponata al fosfato sterile o PBS e seminare le cellule a una densità di 10-15.000 cellule per centimetro quadrato. Seguendo protocolli standard di coltura cellulare, l'array di microattuatori può essere modificato per condurre esperimenti su cellule coltivate in costrutti tridimensionali di idrogel fotolitografati. In primo luogo, viene realizzata una piattaforma in PDMS multistrato.

Dopo aver ricoperto la piattaforma di base con un met, viene iniettata una soluzione precursore dell'idrogel su un'ulteriore copertura in vetro. Successivamente, un biomateriale foto-polimerizzabile viene micro-patterningato nell'array e la soluzione precursore residua viene rimossa con un risciacquo. L'array di perni di carico attivati verticalmente può quindi essere utilizzato per applicare forze meccaniche compressive a cellule coltivate in biomateriali tridimensionali, utilizzando pezzi di nastro adesivo trasparente per mascherare le aree intorno ai perni, rivestendo il dispositivo con paralina C in un sistema PDS 2010 lab COTER due.

Questo migliorerà la cinetica di polimerizzazione per il sistema di biomateriale. Una volta ricoperto, rimuovere il dispositivo dal sistema di rivestimento e staccare il nastro adesivo, lasciando uno strato conformale di paralina C sui perni. Successivamente, silanizzare la lamella di vetro con metacrilato immergendola per due minuti in una soluzione al 2% in volume di trimetossi propil metacrilato in etanolo al 95%.

Risciacquare il coperchio. Immergere in etanolo al 100%, seguito da essiccazione a 100 gradi Celsius, lasciando gruppi metacrilato sulla superficie. Versare uno spaziatore in PDMS di 200 micron di spessore.

Posizionare il film in una piastra di Petri e tagliarlo in piccole sezioni. Unire tramite plasma bonding quattro di queste piccole sezioni lungo il bordo del cover slip relativo al meac. Successivamente, unire tramite plasma bonding le aree ai settori in PDMS del dispositivo che ricopre il rivestimento in Lene C.

Infine, sterilizzare il dispositivo lavandolo con etanolo al 70% ed esponendolo a un germicida o a luce UV in una cappa a sicurezza biologica per 45 minuti. Per ottenere un patterning fotolitografico degli idrogeli a base di PEG caricati con cellule all'interno dei dispositivi, preparare le soluzioni del precursore e dell'iniziatore fotoreattivo come descritto nel protocollo scritto e mescolarle accuratamente per ottenere una soluzione con una concentrazione di 0,4% peso/volume di iniziatore fotoreattivo.

Filtrare la miscela attraverso un filtro siringa da 0,45 micron per sterilizzare ed eliminare le particelle, le culture cellulari con tripsina su ghiaccio e preparare una sospensione cellulare nel mezzo di coltura a una concentrazione cellulare doppia rispetto a quella finale desiderata. Successivamente, mescolare la sospensione cellulare e la soluzione filtrata del foto-iniziatore del precursor del gel idrico in rapporto uno a uno. Iniettare la soluzione nel microdispositivo utilizzando un ago lungo da 25 gauge.

Evitare con attenzione la formazione di bolle nel dispositivo. Allineare una maschera di trasparenza stampata ai segni di allineamento sulla superficie del dispositivo. Configurare un sistema di illuminazione UV per fornire una dose di luce UV a 365 nanometri di 17,5 milliwatt per centimetro quadrato sulla superficie del dispositivo.

Illuminare l'idrogel attraverso la maschera per 195 secondi dopo l'illuminazione. Rimuovere con il PBS la soluzione precursora di idrogel non polimerizzata e sostituire il PBS con il mezzo di coltura; attivare i perni di carico per comprimere le strutture di idrogel. Qui viene mostrato un dispositivo campione completato per la coltura meccanostimolatoria 2D.

Il colorante rosso viene utilizzato per contrassegnare i canali di erogazione della pressione di attuazione e il colorante blu D viene utilizzato per contrassegnare i canali di lubrificazione per la caratterizzazione della deformazione. Gli esperimenti possono essere utilizzati per determinare i campi di deformazione applicati tracciando il movimento delle perle fluorescenti sui substrati. I punti rossi rappresentano la posizione originale delle perle, mentre i punti verdi rappresentano le posizioni deformate.

Un dispositivo campione per esperimenti compressivi tridimensionali è mostrato qui, dove un colorante verde viene utilizzato per evidenziare i canali della pressione di attuazione. La vista dall'alto dell'array di micropilastri rivela il costrutto di idrogel modellato sulla parte superiore; immagini ricostruite dei lati dei pilastri mostrano le perle fluorescenti all'interno del costrutto di idrogel. Le condizioni di riposo e di pressione di attuazione di 55 chilopascal dimostrano il processo di caratterizzazione della deformazione in un sistema di coltura tridimensionale.

Abbiamo appena illustrato come realizzare dispositivi utilizzati per stimolare meccanicamente le cellule in sistemi di coltura bidimensionali o tridimensionali. Durante questa procedura, è importante ricordare di mantenere i dispositivi il più possibile puliti e privi di polvere e di essere pazienti, specialmente durante i passaggi di allineamento. Ecco fatto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.