Name: Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Erfahren Sie eine nicht-virale Methode zur Gentransfer in das postnatale Rattenhirn mittels In-vivo-Elektroporation. Diese effiziente Technik ermöglicht gezielte Genexpression in lebendem Hirngewebe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Ekaterina Karelina für die Hilfe bei der Aufnahme Soundtrack für das Video, Ivan Molotkov für 3D-Animation und Dr. Peter Blaesse für CAG-EGFP Plasmid-Präparation. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Zentrum für Internationale Mobilität von Finnland, Finnish Cultural Foundation und der Academy of Finland unterstützt.

1. Einführung Erstellung von transgenen Tieren ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung von Genfunktionen in lebenden Tieren 1 und zur Enträtselung Krankheitsmechanismus 2,3 sowie für die Manipulation von Eigenschaften der Zellen 4. Allerdings ist das Verfahren ziemlich aufwendig, extrem zeitaufwendig und teuer, so rechtfertigt die Verwendung von alternativen Gentransfer-Methoden wie virale Injektion 5, neonatalen ventrikulären Injektion mit Elektroporation 6 und in utero Elektroporation 7,8. Die Methode der postnatalen nicht ventrikuläre Injektion und Elektroporation hat eine einzigartige Reihe von Vorteilen: Nutzung von nicht-viralen Gen-Konstrukte, die Möglichkeit zu einem lokalen Expressionsmuster in den Bereich von Interesse zu schaffen; in situ Transfektion von nicht-wandernde Zelltypen, wie zB kortikale Astrozyten. In diesem Video zeigen wir die Einzelheiten des Verfahrens der postnatalen Gentransfer auf die Neugeborenen Rattenhirn mit einem Plasmid kodiert für das Enhanced Green Fluorescent Protein unter chicken beta-Aktin-Promotor mit CMV-Enhancer (pCAG-EGFP) 9. Wir erläutern die Herstellung der Plasmid-haltigen Injektionslösung, die Herstellung von dünnen Glas-Pipetten und Montage der Mikroinjektor auf einem stereotaktischen Instrument. Dann reden wir über betäubende Rattenjungen mit Isofluran, über die Durchführung der Operation, über das Injektionsverfahren und über die Elektroporation mit einer Pinzette Elektroden und die in vivo porator. Schließlich diskutieren wir kurz die zu erwartenden Ergebnisse, Perspektiven und Schwierigkeiten, die während dieser Experimente entstehen können. 2. Plasmid-Präparation für die Elektroporation <ol><li> Wir bereiten meistens 10 ul der Plasmid-Injektionslösung in einer 200 ul dünnwandige Rohr. Diese Lösung ist ausreichend für mehrere Experimente. </li><li> Wir mischen 8 ul der Plasmid-Lösung (siehe Materialien und Geräte) mit 1 ul des 10X PBS (siehe Materialien und Ausrüstung) und 1 ul 0,1% Fast Green-Wasser-Lösung (siehe Materialien und Ausrüstung). </li><li> Die Endkonzentration des Plasmids in der Injektionslösung sollte zwischen 1 und 3 ug / ul werden. Niedrigere Konzentrationen von Plasmid-DNA verringert die Transfektionseffizienz, während die höheren DNA-Konzentration wird zu viskos für die Injektion durch die dünne Spitze der Glaskapillare. </li></ol> 3. Glasnadel Vorbereitung <ol><li> Für die Glaspipette Vorbereitung, verwenden wir Borosilikatglas Kapillare mit einem Filament (siehe Materialien und Ausrüstung) und eine vertikale Elektrode Glas Abzieher (siehe Materialien und Geräte) auf maximale Zugkraft und Heizung Parameter. </li><li> Wir brechen dann die Spitze der Pipette mit einem Stück Papier, um einen Tipp 10-20 um im Durchmesser erreichen. </li><li> Wir überprüfen die Spitze Durchmesser und Form unter dem Mikroskop-Objektiv. </li></ol> 4. Mikroinjektor Assembling <ol><li> Mit einer dünnen Polymerschicht Kapillare (siehe Materialien und Ausrüstung) füllen wir ca. 1 / 3 des Volumens einer 10 ul Hamilton-Spritze (siehe Materialien und Ausrüstung) mit Mineralöl (siehe Materialien und Ausrüstung). Vermeiden Sie Luftblasen! </li><li> Dann füllen wir die Glaspipette mit Mineralöl und legen Sie die Pipette in die Hamilton-Spritze. Vermeiden Sie Luftblasen! </li><li> Die Spritze mit Glaspipette wird dann auf dem Mikroinjektor verbunden mit einem Festwert (siehe Materialien und Ausrüstung). </li><li> Die Mikroinjektion Setup auf einem stereotaktischen Instrument (siehe Materialien und Ausrüstung) fixiert ermöglicht es uns, gefahrlos tauchen die Spitze der Glaspipette in das Rohr mit dem Plasmid Injektionslösung. </li><li> Wenn die Spitze die Oberfläche der Lösung berührt, tauchen sie durch 1 oder 2 mm und füllen Sie die Pipette mit etwa 1 ul der Injektion Mix mit dem Mikro-Injektor-Controller. </li></ol> 5. Narkotisierende Tier Alle Verfahren vorgestellt wurden hier entsprechend der University of Helsinki Regelungen für Tierversuche durchgeführt. <ol><li> Für jedes Experiment, füllen wir eine gasdichte Spritze (siehe Materialien und Geräte) mit ca. 2 ml von Isofluran (siehe Materialien und Ausrüstung). </li><li> Als die Spritze in der Anästhesie-Einheit (siehe Materialien und Ausrüstung) verbunden, um den Luftstrom Quelle festgelegt ist, das Tier-Box und die Maske auf stereotaktische Setup fixiert. </li><li> Auf dem Narkosegerät, passen wir den Luftstrom auf etwa 250 ml / min und die Isofluran-Ebene, um 4%. </li><li> Wir legen Jungtier in das Tier-Box für 2-5 Minuten. </li><li> Wenn der Welpe nicht mehr bewegt, legen Sie es auf dem Heizkissen (siehe Materialien und Geräte) an den stereotaktischen Setup. </li><li> Legen Sie eine rostralen Teil der Welpe den Kopf in die betäubende Maske. </li><li> Es dauert 5 bis 10 Minuten für dieWelpen, die tiefe Narkose geben. </li><li> Überprüfen Narkose Tiefe mit einem Schwanz kneifen und eine Verringerung der Isofluran Zufluss über 1,5 bis 2,0%. </li></ol> 6. Chirurgie, Mikroinjektion und Elektroporation <ol><li> Behandeln Sie die Haut an den Welpen den Kopf mit dem 70% Ethanol. </li><li> Mit einer kleinen Schere (siehe Materialien und Ausrüstung) und dünnen Pinzette (siehe Materialien und Ausrüstung), schneiden Sie die Haut von einem scruff der Welpe seine Stirn. </li><li> Beugen Hautstücke seitwärts und ziehen Ohr Bars leicht in klanglicher Öffnungen des Schädels für Kopf und Haut-Fixierung. </li><li> Mit einem Binokular, suchen wir die Bregma Punkt auf dem Schädel. </li><li> Identifizieren Sie die Region von Interesse mit der stereotaktischen Koordinaten. </li><li> Positionieren Sie den Injektionspipette über diesem Bereich, und markieren Sie durch Fallenlassen 25-50 nl der Injektionslösung auf der Kopfoberfläche. </li><li> Drill des Schädels sanft und vorsichtig an der markierten Stelle mit einem High-Speed-chirurgische Bohrer (siehe Materialien und Geräte) unter dem Mikroskop, bis die Flüssigkeit wird in die gebohrten Gebiet. </li><li> Vereinbaren Sie einen electropotation Pinzette Elektroden (siehe Materialien und Geräte) an den Seiten des Schädels mit aktuellen leitfähiges Gel (siehe Materialien und Ausrüstung), um eine bessere Leitfähigkeit zu erreichen. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit Drop aus dem Bohrloch mit kleinen Tampons (siehe Materialien und Ausrüstung) und tauchen Sie das Glas Nadel in das Loch nach den Koordinaten der Injektionsstelle. </li><li> Infuse von 25 bis 100 nl der Injektionslösung in Höhe von 5 bis 20 nl / sec. </li><li> Schnelles Entfernen der Pipette und elektroporieren sofort. Elektroporation ist durch die Anwendung fünf Rechteck-Impulsen mit der Dauer von 50 ms und Amplitude von 99 V bei einer Frequenz von 1 Hz durchgeführt. </li><li> Entfernen Sie Elektroden und Ohr Bars. </li><li> Nähen Sie den Schnitt der Haut durch eine Kombination eines stummen (siehe Materialien und Ausrüstung) und scharfen Zangen und chirurgische Fäden (siehe Materialien und Ausrüstung). </li><li> Platzieren Sie den Welpen in die warme Kammer für 15-30 Minuten, um ihre Erholung nach der Narkose zu unterstützen. </li><li> Dann legen Sie den Welpen zurück zu seiner Mutter in den Käfig. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Die Expression des Transgens in den erfolgreich transfizierten Zellen erscheinen etwa 10 Stunden nach der Elektroporation, und es bleibt für mehrere Wochen stabil. Wir mikroinjiziert das Plasmid entweder in tiefen kortikalen Schichten oder Striatum Region postnatalen Tag 2 (P2) Wistar Rattenjungen und durchgeführt in vivo Elektroporation wie oben beschrieben. Hirnschnitten (400 um Dicke) wurden nach 2 bis 6 Tage verkürzt (P4-P8) mit einem vibrotome in kaltes Schneiden Medium (Hepes gepuffert Earle Balanced Salt Solution) 10. Bildaufnahme erfolgte mit Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal konfokalen Mikroskop (Zeiss, Deutschland) in der Slicing-Medium bei Raumtemperatur. Die Injektionsstellen in tiefen kortikalen Schichten und Striatum enthielt viele transfizierten Zellen, die EGFP, dass in einem kompakten Region von etwa 200-300 &amp;mgr; m im Durchmesser (Abbildung 1A, B) befanden. Innerhalb transfizierten Zellen, die EGFP Expression ausreichend hoch, um Bildgebung von dünnen zellulären Prozessen (Abbildung 1C) mit Dendriten mit Stacheln in verschiedenen Formen (Abbildung 1D) und Axon-Bundles (Abb. 1E) zu ermöglichen. Die robuste Stabilität des EGFP als auch die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation erlaubt Tracing distalen Teile der Axone (bis 1,5-2 mm vom Zellkörper) wie kortikale Terminals (Abbildung 1F). <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) erfolgreich Zellen in das Striatum Region P4 Rattenhirn Abgrenzung der Plasmid Injektionsstelle transfiziert. (B) transfizierten Zellen in tiefen kortikalen Schichten (ca. 1000 um unten kortikalen Oberfläche) P5 Rattenhirn. (C) A transfizierten Zelle in das Striatum Region P8 Rattenhirn. (D) Dendritische Prozesse einer transfizierten Zelle in das Striatum Region P8 Rattenhirn; Pfeile zeigen verschiedene Arten von dendritischen Dornen und Filopodien. (E) Axone von transfizierten Zellen innerhalb Kollateralweg. (F) Axone enden an der Pia-Oberfläche P8 Rattencortex (Pfeilspitze). Scale-Bars sind 100 um auf A, B, E und F; 10 um auf C und D.

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
<li>Cryan, J. F., Holmes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+mouse%3A+advances+in+modeling+human+depression+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).</li>
<li>Wells, T., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+neural+function+in+transgenic+rodents%3A+towards+a+comprehensive+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Boutin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Walantus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

Methoden der Gentransfer in lebende Nagetier Gehirn sind gut für die in utero Elektroporation 7,8,11,12 gegründet und seit kurzem auch für die postnatale Elektroporation 6. Allerdings sind diese Methoden auf intraventrikuläre Injektion der Plasmid-DNA, die für mehrere Anwendungen kann die Begrenzung basiert. Zum Beispiel, haben diese Methoden nicht zulassen, dass Targeting-Zellen in bestimmten Bereichen des Gehirns wie Hippocampus, noch die Transfektion von solchen nicht-wandernde Zelltype...

<table><tbody><tr><td>2A-sa Dumme Pinzette, 115 mm</td><td>Gerät</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Biologischer Temperaturregler mit Heizplatte aus Edelstahl</td><td>Gerät</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat-Röhrchen mit Filament</td><td>Material</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>Glasnadel</td></tr><tr><td>Einwegbohrer</td><td>Material</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco&amp;rsquo;s PBS 10X</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette, 110 mm</td><td>Gerät</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Ealing Mikro&amp;#8211;Elektrodenzieher</td><td>Gerät</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Vertikaler Glas-Elektrodenzieher</td></tr><tr><td>Ethilon Monofil-Polyamid 6-0 FS-3 16 mm 3/8c</td><td>Material</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>EH7177H</td><td>Chirurgische Fäden</td></tr><tr><td>Exmire Mikrospritze 10,0 ml</td><td>Gerät</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>Gasdichte Spritze</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten-Elektroden</td><td>Gerät</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>Vor der Verwendung zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Foredom Bohrsteuerung</td><td>Gerät</td><td>Foredom</td><td>FM3545</td><td>Stromversorgung und Steuerung für chirurgischen Bohrer. Aktuell verfügbares Analogmodell ist das Mikromotor-Kit K.1070 (Foredom)</td></tr><tr><td>Foredom Mikromotor-Handstück</td><td>Gerät</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>Aktuell verfügbares Analogmodell ist das Mikromotor-Kit K.1070 (Foredom)</td></tr><tr><td>Gasanästhesieplattform für Mäuse</td><td>Gerät</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>Auf stereotaktischem Instrument montiert</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Reagenz</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Hautpinzette, 105 mm</td><td>Gerät</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>Material</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>Kapillaren zur Befüllung von Mikrospritzen</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil-Spritze 10 Mikroliter</td><td>Gerät</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton-Spritze</td></tr><tr><td>Plasmid CAG-EGFP</td><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td>Mit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) extrahiert und gereinigt, in nukleasefreiem Wasser auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml gelöst</td></tr><tr><td>Puls-Generator CUY21Vivo-SQ</td><td>Gerät</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Schiller Elektroden-Gel</td><td>Reagenz</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>Leitfähiges Gel</td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument für Kleintiere</td><td>Gerät</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;lting Maus- und Neugeboren-Ratten-Adapter</td><td>Gerät</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>Auf stereotaktischem Instrument montiert. Ohrstifte vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Schüler-Iris-Scheren, gerade 11,5 cm</td><td>Gerät</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>Vor Verwendung bei chirurgischen Eingriffen zur Desinfektion mit 70%igem Ethanol behandeln</td></tr><tr><td>Sugi Saugtupfer 17 x 8 mm</td><td>Material</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>Chirurgische Tampons</td></tr><tr><td>UMP3 Mikrospritzpumpe und Micro 4 Mikrospritzpumpen-Regler</td><td>Gerät</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>Mikroinjektor und Regler</td></tr><tr><td>Univentor 400 Anästhesiegerät</td><td>Gerät</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

gene lieferung in postnatale rattengehirn von non-ventrikuläre plasmid injektion und elektroporation

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Erstellung von transgenen Tieren ist ein Standard-Ansatz bei der Untersuchung von Funktionen eines Gens von Interesse in vivo. Allerdings sind viele Knockout oder transgenen Tieren, die nicht in den Fällen, wo das modifizierte Gen exprimiert oder gelöscht wird in den gesamten Organismus lebensfähig. Darüber hinaus eine Vielzahl von Kompensationsmechanismen machen es oft schwierig, die Ergebnisse zu interpretieren. Die kompensatorische Effekte können entweder durch Timing der Genexpression oder die Begrenzung der Höhe von transfizierten Zellen vermindert werden. Die Methode der postnatalen nicht ventrikuläre Mikroinjektion und in vivo Elektroporation ermöglicht die gezielte Verabreichung von Genen, siRNA oder Farbstoffmoleküle direkt auf eine kleine Region des Interesses an der neugeborenen Nagern Gehirn. Im Gegensatz zu herkömmlichen ventrikuläre Injektionstechnik ermöglicht diese Methode die Transfektion von nicht-wandernde Zelltypen. Tiere mit Hilfe der hier beschriebenen Methode transfiziert kann, zum Beispiel für Zwei-Photonen werden in-vivo-Bildgebung oder in elektrophysiologischen Experimenten an akuten Hirnschnitten.

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-virale Methode der Lieferung von Gen-Konstrukte zu einem bestimmten Bereich des Gehirns lebende Nagetier. Die Methode besteht aus Plasmid-Präparation, Mikropipette Fertigung, neugeborenen Ratten pup Chirurgie, Mikroinjektion des Konstrukts und<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation.

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Die Erzeugung transgener Tiere ist ein Standardansatz zur Untersuchung der Funktionen eines Zielgens in vivo. Viele Knockout- oder transgene Tiere ...

Hallo, ich bin RI Ov. Und ich bin Alexia Ying. Wir sind Doktorandinnen der Cent University. In diesem Video stellen wir eine Methode der in-vivo-Elektroporation zur gezielten Genübertragung in einen bestimmten Bereich leitender Hirngewebe vor.Schauen wir uns das an. Die Methode der in-vivo-Elektroporation bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit, Gene von Interesse oder kleine interferierende RNA in lebendes Hirngewebe einzubringen.Es bietet eine kostengünstige Alternative zur Erzeugung transgener Tiere und zur viralen Genübertragung. In diesem Video werden wir ein detailliertes Verfahren zur postnatalen Genübertragung in den neonatalen Rindenbereich demonstrieren. Wir verwenden ein Plasmid, das für das verbesserte grün fluoreszierende Protein sowie für den Hühner-Beta-Aktin-Promotor mit einem CMV-Enhancer kodiert.Wir führen alle chirurgischen Eingriffe im laminar flow-Schrank durch, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und das Risiko einer bakteriellen oder fungalen Kontamination des Tieres zu minimieren. Zur Plasmidapplikation in die Großhirnrinde verwenden wir einen WPI-Mikroinjektor mit elektronischer Steuerung und eine 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze, die an einen stereo

gene-delivery-to-postnatal-rat-brain-non-ventricular-plasmid

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E16 Rattenembryonen

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Gene bei der Entwicklung des Kortex oder des Hippokampus von Ratten über in utero Elektroporation (IUE) an E16 manipuliert werden, um eine schnelle und gezielte Modifikationen der neuronalen Verbindungen für spätere Untersuchungen des Verhaltens oder der Neuropathologie in erwachsenen Tieren ermöglichen. Postnatale in-vivo-Bildgebung für die Kontrolle der IUE Erfolg durch Biolumineszenz der Aktivierung co-transfizierten Luciferase durchgeführt.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren...

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Die Pia-Oberfläche ist eine einzigartige Vorläuferzone im ZNS, die Aufnahme wird immer mehr Aufmerksamkeit. Hier erläutern wir ein Verfahren für schnelle genetische Manipulation dieser Vorläuferzone unter Verwendung einer modifizierten Methode der Elektroporation. Dieses Verfahren kann für zelluläre und molekulare Untersuchungen der Zelllinien und Signalwegen in der Zelldifferenzierung beteiligt sind, verwendet werden, um das Schicksal und die Eigenschaften von Tochterzellen zu erklären.

Neonatal Pial Oberflächen Elektroporation

Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Präsentiert wird hier eine Elektroporationsmethode für die Plasmid-DNA-Abgabe und ependymogliale Zellbeschriftung im erwachsenen Zebrafischtelencephalon. Dieses Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Visualisierung und Verfolgung einzelner ependymoglialer Zellen und eröffnet neue Möglichkeiten, Elektroporation auf eine breite Palette genetischer Manipulationen anzuwenden.

Elektroporationsmethode zur In-Vivo-Lieferung von Plasmid-DNA im erwachsenen Zebrafisch Telencephalon

Das vorliegende Protokoll beschreibt Schritt-für-Schritt-Anweisungen für die Durchführung intrathekaler Injektionen bei neugeborenen Mäusen zur Geneditierung und Medikamentenabgabe.

Intrathekale Injektion von neugeborenen Mäusen zur Genomeditierung und Medikamentenverabreichung

Erfahren Sie eine nicht-virale Methode zur Gentransfer in das postnatale Rattenhirn mittels In-vivo-Elektroporation. Diese effiziente Technik ermöglicht gezielte Genexpression in lebendem Hirngewebe.

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Weitere Videos entdecken