Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la qualità funzionale delle cellule T CD8 positive in risposta a un particolare antigene, analizzando la loro capacità di uccidere cellule bersaglio in vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto inducendo cellule T effettrici CD8 positive specifiche per l'antigene attraverso l'immunizzazione di topi riceventi. Come secondo passaggio, le cellule bersaglio primarie vengono rese specifiche o altrimenti trattate, completando così la creazione del sistema effettore-bersaglio specifico.

Successivamente, le cellule bersaglio vengono somministrate ai topi riceventi mediante trasferimento adottivo retroorbitale. Per osservare l'effetto citotossico in vivo, sono stati ottenuti risultati che indicano se gli effettori hanno ucciso alcune delle cellule bersaglio, in base all'analisi citofluorimetrica delle cellule marcate con CFSE. Ciao, mi chiamo Marina Ward.

Sono uno studente laureato nel laboratorio di Gary Splitter presso l'Università del Wisconsin di Madison. Questo metodo fornirà informazioni sul processo di uccisione mediato dai linfociti T citotossici (CTL) e può essere applicato anche allo studio della proliferazione e della sopravvivenza cellulare. A dimostrare la procedura di trasferimento adottivo sarà il dottor Jerome Harms, un ricercatore del mio laboratorio. Iniziare strategicamente definendo un sistema specifico di effettori e bersagli.

Ad esempio, in un classico saggio CTL in vivo, utilizzare un'immunizzazione con peptide purificato per indurre linfociti T CD8 positivi specifici; usare lo stesso peptide per sensibilizzare le cellule bersaglio sinniche, creando così un sistema specifico effettore-bersaglio. Decontaminare la superficie di lavoro di una cappa a sicurezza biologica per garantire la sterilità delle iniezioni. Preparare l'immunizzazione con peptide posizionandola prima in un tubo da due millilitri.

50 microgrammi di peptide purificato in 100 microlitri di DMSO al 10% in PBS per topo. Successivamente, aggiungere una quantità uguale di unju incompleto e privo di additivi, molto freddo, con perle da un millimetro per favorire il mescolamento. Chiudere saldamente il tappo del tubo con parafilm e conservare l'immunogeno sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.

Utilizzare un agitatore a sferette impostato al massimo numero di giri al minuto per mescolare l'emulsione per tre minuti, riponendo immediatamente l'emulsione sul ghiaccio dopo il mescolamento. L'emulsione risultante dovrebbe avere una consistenza simile a quella della maionese. Lasciare riposare l'emulsione a quattro gradi Celsius durante la notte o fino a una settimana, mescolando ulteriormente se si nota una separazione al momento della immunizzazione.

Identificare i topi per questa parte dell'esperimento. Utilizzare una siringa da un millilitro e un ago da 20 gauge per aspirare l'emulsione. Avere cura di non aspirare alcun granello al fine di preparare le cellule bersaglio.

Si utilizzano topi siringei naïve per eutanasizzare questi topi naïve. Secondo gli standard approvati da A-A-A-L-A-C. Spruzzare l'area interessata del topo con etanolo al 70% per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da pelo del topo o da altri contaminanti esterni; utilizzando forbici da dissezione, praticare un piccolo taglio attraverso la pelle sul lato sinistro del topo.

Tirare la lembo di pelle per esporre la sacca peritoneale e gli organi interni. Incidere il peritoneo avendo cura di non danneggiare nessuno degli organi sottostanti. Individuare la milza, che si trova vicino alla superficie ed è di colore rosso scuro.

Estrarre con attenzione la milza e posizionarla immediatamente in un tubo conico da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo RPMI preparato su ghiaccio. Procedere con i topi rimanenti. Trasferire la milza e il mezzo in un omogeneizzatore di tessuti in vetro.

Macinare la milza fino a quando tutti i tessuti hanno perso il loro colore. Far passare i prodotti omogeneizzati attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Risciacquare una volta l'omogeneizzatore con mezzo fresco e unire all'omogenato di milza versando attraverso il filtro. Centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius e 1.300 giri al minuto.

Per sette minuti, decantare e scartare il soprannatante. Ri-sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di lisato, aggiungere i reagenti e incubare a 37 gradi Celsius per sette minuti. Aggiungere fino a 50 millilitri di mezzo fresco e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Ripetere questo lavaggio. Contare le cellule e aliquotare 10 milioni di cellule per pozzetto in una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con fondo rotondo.

Incubare a quattro gradi Celsius per un'ora e mezza. Trasferire nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per gli ultimi 30 minuti. Preparare il reagente CFSE fresco secondo le indicazioni del produttore e diluirlo a una concentrazione di lavoro compresa tra 0,5 e 25 micromolari.

Preparare due soluzioni di CFSE che differiscano di dieci volte nella concentrazione. Portare le soluzioni di CFSE a bassa e alta concentrazione a 37 gradi Celsius prima dell'etichettatura. Rimuovere la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule bersaglio dall'incubatore e centrifugare per formare il pellet cellulare.

A temperatura ambiente, agitare delicatamente la piastra per rimuovere il sopranatante. Risospendere le cellule in 200 microlitri di soluzione CFSE a concentrazione bassa o alta e incubare per 15 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a temperatura ambiente, agitare delicatamente la piastra per rimuovere il sopranatante, risospendere le cellule in 200 microlitri di mezzo fresco e incubare per 30 minuti. Pellettare nuovamente le cellule mediante centrifugazione a 37 gradi Celsius, scartare il sopranatante e risospendere i pellet in 50 microlitri di PBS. Mettere da parte una parte delle cellule marcate per i controlli senza trasferimento durante l'analisi dei dati e per l'analisi nel citometro a flusso per il trasferimento adottivo.

Aggiungere un pozzetto di cellule marcate con CFSE a bassa concentrazione a un pozzetto di cellule marcate con CFSE ad alta concentrazione per ogni topo. Di conseguenza, l'iniezione risultante è composta dal 50% di cellule bersaglio specifiche e dal 50% di cellule irrilevanti in 0,1 millilitro. Per facilitare il trasferimento adottivo, anestetizzare i topi immunizzati con il peptide ed iniettare 0,1 millilitro di cellule bersaglio marcate per via retro-orbitale nel ricevente.

Dopo sei ore, eutanasia i topi riceventi per il prelievo cellulare, isolare la milza del topo e purificare la popolazione cellulare utilizzando lo stesso protocollo precedentemente impiegato. Quando si preparano le cellule spleniche bersaglio, piastrare le cellule a un milione per pozzetto in una piastra per colture cellulari rotonda a 96 pozzetti, fissare le cellule recuperate e non trasferite con paraformaldeide, analizzare i campioni mediante citometria a flusso ed elaborare i dati. La presentazione tipica dei risultati relativi alla lisi cellulare specifica è mostrata in due modi.

Un picco specifico per l'epitopo ridotto nell'istogramma FACS e il valore calcolato indicano la lisi cellulare specifica. I numeri indicano la percentuale di cellule con fenotipo CFSE alto o basso nelle cellule controllo marcate con CFSE non trasferite, recuperate da un topo ricevente immunizzato con PBS, e nelle cellule marcate con CFSE recuperate da due topi riceventi diversi specifici per peptidi. Si noti la riduzione dei picchi specifici per l'epitopo, indicativa della distruzione cellulare specifica.

In alternativa, i risultati possono essere presentati in forma grafica per indicare la lisi cellulare specifica per ciascun gruppo di topi. PBS, peptide A e peptide B. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare il tuo saggio in vivo di citotossicità linfocitaria T citotossica (CTL) utilizzando i topi.