Name: Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara a valutare la citotossicità in vivo delle cellule CD8+ T specifiche per l'antigene utilizzando un saggio basato su CFSE e citometria a flusso. Questo metodo misura la capacità funzionale delle cellule T di uccidere bersagli specifici nel sistema immunitario.

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Vorrei ringraziare Bianca Mothe, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio per avermi fatto conoscere saggi immunologici e gestione del mouse. Il lavoro nel laboratorio di GA Splitter è finanziato dal NIH concedere 1-RO1-AI-073558, GLRCE concedere 1-U54-AI-057153, e BARD USA-3829-06.

1. Suscitando CTL effettori target specifici di Immunizzazione (giorno 0) <ol><li> Prima di iniziare, decidere un effettore specifico: sistema di destinazione. In questo esempio di un classico test in vivo CTL, useremo una immunizzazione peptide purificato per suscitare specifiche cellule T CD8 +. Il peptide stesso sarà utilizzato per impulso delle cellule bersaglio singenici, creando un effettore specifico: sistema di destinazione. In alternativa, si può scegliere di utilizzare patogeno intero o proteine ​​per ottenere il effettori e gli obiettivi specifici. </li><li> Decontaminare il piano di lavoro all'interno di una cappa di biosicurezza per garantire la sterilità delle iniezioni. Preparare l'immunizzazione peptide di prima immissione 50 mg di peptide purificato in 100 microlitri di DMSO 10% in PBS / mouse contenuta in una provetta da 2 ml. Successivamente, aggiungere una quantità uguale di molto freddo adiuvante incompleto di Freund e fino alla tacca 0,2 ml con 1 perle mm per la miscelazione. Da questo punto, tenere immunogeno in ghiaccio fino ad iniezione. Coperchio sicuro con Parafilm. </li><li> Utilizzare un battitore tallone impostato RPM massimo di mescolare l'emulsione per 3 minuti, prontamente ponendo l'emulsione di nuovo sul ghiaccio dopo la miscelazione. L'emulsione risultante dovrebbe essere simile nella consistenza alla maionese. Lasciare emulsione per sedersi a 4 ° C per una notte, se il tempo lo permette (fino ad una settimana), mescolando altri eventuali separazione è notato. </li><li> Utilizzare una siringa da 1 ml e 20 o 20,5 gauge a tirare su emulsione facendo attenzione a non tirare a qualsiasi perline (perline dovrebbe essere maggiore di calibro di ago, ma ancora essere a conoscenza). </li><li> Del mouse sicuro per iniezione sottocutanea alla base della coda. Usiamo un modificata plastica tubo da 50 ml conica in modo sicuro e delicatamente immobilizzare il mouse per l'iniezione. Iniettare il mouse con 0,2 ml di emulsione. </li></ol> 2. Cellule bersaglio raccolta (giorno 8) <ol><li> Avrete bisogno ingenuo singenici topi per le vostre cellule bersaglio. Euthanize topi ingenuo secondo gli standard AAALAC. </li><li> Disinfettare il mouse a spruzzo 70% etanolo per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da capelli mouse o altri contaminanti esterni. </li><li> Dissezione con forbici fare snip piccoli attraverso la pelle sul lato sinistro del mouse. Tirare lembo cutaneo oltre a scoprire sacco peritoneale e gli organi interni. </li><li> Snip attraverso il peritoneo, facendo attenzione a non compromettere uno degli organi sottostanti. La milza è vicino alla superficie ed è simile a colori per il fegato (rosso scuro), ma più piccoli e fagiolo più in forma. Topi infettati mostrano generalmente milza in particolare maggiore rispetto ai controlli non infetti. </li><li> Estrarre delicatamente la milza, avendo cura di essere gentile per non rompere la milza in più parti al fine di recuperare il massimo numero di cellule. Collocare immediatamente la milza in un 15 ml conica contenente 10 ml di supporti preparati sul ghiaccio. Continuare con i topi rimanenti. </li><li> Versare il contenuto della provetta 15 ml conica (media e milza) in un macinino fibra di vetro. Macinare la milza con un sacco di potenza superiore del braccio. Quando tutto il tessuto ha perso il suo colore che si può supporre che avete recuperato tutte le cellule dal tessuto connettivo. </li><li> Versare il contenuto della smerigliatrice attraverso un filtro a 70 micron di cellule in una provetta da 50 ml. Sciacquare smerigliatrice con mezzi freschi e versare attraverso un colino cellula. </li><li> Centrifugare a 4 ° C, a 1300 RPM per 7 minuti. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere in 10 ml di reagente di lisi preparata e incubare a 37 ° per 7 minuti. </li><li> Aggiungere fino a 50 ml con mezzi freschi e centrifuga, come sopra. </li><li> Risospendere in 50 ml mezzi freschi e centrifuga, come prima (fase di lavaggio). * Nota: In questo momento è possibile eseguire una separazione magnetica cella per un tipo specifico di cellule (macrofagi esempio) se una pura popolazione di cellule bersaglio è desiderato per il trasferimento in topi riceventi. Inoltre, in questo momento si potrebbe introdurre un trattamento sperimentale nella cultura al fine di studiare gli effetti di tale trattamento sulla morte delle cellule specifiche. </li><li> Contare le celle e la piastra di 1 x 10 7 per bene in 100μL in 96 pozzetti rotonda coltura tissutale piastra inferiore trattati. * Si tratta di un'alta concentrazione di cellule / pozzetto, ma perché il saggio è una veloce, abbiamo visto alcuna perdita di vitalità delle cellule a questa concentrazione. </li></ol> 3. Trattamento e etichettatura delle cellule bersaglio <ol><li> Cellule impulsi appropriati e replica con peptide specifico agente patogeno o di controllo peptide irrilevante: Aggiungere 1 mg / ml peptide. Incubare a 4 ° C per 1,5 ore. Passare a 37 ° C incubatore negli ultimi 30 minuti. Durante questo tempo preparare il reagente CFSE. </li><li> Preparare CFSE secondo le specifiche del produttore e diluire ad una concentrazione di lavoro tra 0,5 e 25 micron. Fai la concentrazione "basso" 10 volte inferiore a quello CFSE "alta" concentrazione. Ad esempio, per [basso] CFSE aggiungere 0,5 microlitri a 10 ml PBS e per [alto], aggiungere 5 CFSE microlitri a 10 ml PBS. Caldo CFSE preparati a 37 ° C prima di etichettatura. </li><li> Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e pEllet in una centrifuga ad alta velocità a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante. </li><li> Risospendere le cellule in entrambi [basso] o [alto] CFSE con l'aggiunta di 200 ml di reagente appropriato ai pozzetti corrispondenti e incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e di nuovo pellet a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante. </li><li> Risospendere le cellule in 200 l / pozzetto di scaldato mezzi freschi e incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Rimuovere la piastra di cellule da incubatore e pellet a temperatura ambiente, 1300 RPM per 7 minuti. Flick per rimuovere supernatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 l / pozzetto PBS. </li><li> Per il trasferimento adottivo, aggiungere un bene [basso] cellule marcate ad un pozzetto [alto] etichettati cellule per topo. Conseguente iniezione deve essere del 50% obiettivi specifici e il 50% di cellule irrilevante in 0,2 ml. </li><li> Non dimenticare di mettere da parte alcune cellule etichettati in modo da agire come i controlli non trasferiti durante l'analisi dei dati e per l'esecuzione del citofluorimetro (vedi figura 1). </li></ol> 4. Trasferimento adottivo <ol><li> Anestetizzare topi immunizzati precedentemente peptide (Da parte # 1 di questo protocollo) secondo gli standard AAALAC. </li><li> Iniettare 0,2 ml di cellule bersaglio marcato via retro-orbitale percorso in topi riceventi. </li><li> Attendere 6 ore o altro tempo predeterminato ottimale prima di eutanasia i topi destinatario. </li></ol> 5. La raccolta cellule marcate * Nota: I punti 5.1 e 5,11 sono gli stessi passi da 2.1 a 2,11 <ol start="12"><li> Contare le celle e la piastra presso 1 x 10 6 per bene in 100 ul in 96 cultura fondo piatto e tondo tessuti trattati. </li><li> Fissare le cellule recuperate e non trasferiti aggiungendo 100 microlitri paraformaldeide al 2% ad una concentrazione finale di 1% paraformaldeide a tutti i pozzetti. </li></ol> 6. Citometria a flusso e analisi dei dati <ol><li> Esegui campioni su un citofluorimetro e analizzare i dati. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati Un picco epitopo diminuendo specifiche sul istogramma risultante è un indicatore di uccidere cellule specifiche (Figura 1). Usare le seguenti equazioni (applicato nella tabella 1) per determinare il valore reale di lisi delle cellule specifiche: = Rapporto Irrilevante Percentuale: percentuale epitopi specifici (di picco [basso]: [alto] di picco), Percentuale Lysis specifica = [1 - (no trasferiti rapporto di controllo / rapporto Sperimentale)] x 100 <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. CFSE profilo dei numeri recuperato BALB / c splenociti mouse. Indicare la percentuale di cellule del fenotipo CFSE alto o basso. A) non ha trasferito il controllo. Tutti [alto] CFSE picchi rappresentano epitopo cellule bersaglio specifico, mentre [basso] picchi CFSE costituiscono un obiettivo di impulsi con peptide irrilevante. B) le cellule CFSE etichettati recuperato dal destinatario del mouse immunizzati PBS (controllo). C) le cellule CFSE etichettati recuperato da due differenti topi riceventi peptide specifico, notare i picchi epitopo diminuita specifici. <img src="/files/ftp_upload/2250/2250fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Rappresentazione grafica dei dati analizzati. Tre punti dati mostrati per ogni gruppo di topi, PBS, peptide A e B. Peptide <table border="1"><tbody><tr><td> Campione </td><td> Epitopo% CFSE pulsata ad alta </td><td> CFSE% BASSO Irrilevante </td><td> Rapporto di Basso: Alta </td><td> Uccidere per cento epitopi specifici </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 42,8 </td><td> 57,2 </td><td> 1,34 </td><td> 16,97 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 43,1 </td><td> 56,9 </td><td> 1,32 </td><td> 15,94 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 44,3 </td><td> 55,7 </td><td> 1,26 </td><td> 11,74 </td></tr><tr><td> Un peptide </td><td> 39,7 </td><td> 60,3 </td><td> 1,52 </td><td> 32,56 </td></tr><tr><td> Un peptide </td><td> 38,6 </td><td> 61,4 </td><td> 1,59 </td><td> 35,61 </td></tr><tr><td> Un peptide </td><td> 40,6 </td><td> 59,4 </td><td> 1,46 </td><td> 29,99 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 38,7 </td><td> 61,3 </td><td> 1,58 </td><td> 24,68 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 38,5 </td><td> 61,5 </td><td> 1,60 </td><td> 25,32 </td></tr><tr><td> Peptide B </td><td> 39,3 </td><td> 60,7 </td><td> 1,54 </td><td> 22,76 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS NT controllo </td><td> 47,4 </td><td> 52,6 </td> 1,11 <td></td></tr><tr><td> Pep Un Controllo NT </td><td> 49,4 </td><td> 50,6 </td><td> 1,02 </td><td></td></tr><tr><td> Pep B NT controllo </td><td> 45,6 </td><td> 54,4 </td><td> 1,19 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Analisi dei dati rappresentativi. "NT" non è trasferito.

<ol><li>Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+epitope+escape+on+PD-1+expression+and+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection.</a> J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).</li>
<li>Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strength+of+T+cell+receptor+signal+controls+the+polarization+of+cytotoxic+machinery+to+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The strength of T cell receptor signal controls the polarization of cytotoxic machinery to the immunological synapse.</a> Immunity. 31 (4), 621-631 (2009).</li>
<li>Ingulli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+tolerance+and+immunity+in+vivo+by+CFSE-labeling+of+administered+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing tolerance and immunity in vivo by CFSE-labeling of administered cells.</a> Methods Mol Biol. 380, 365-376 (2007).</li>
<li>Durward, M. A., Harms, J., Magnani, D. M., Eskra, L., Splitter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discordant+Brucella+melitensis+antigens+yield+cognate+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Discordant Brucella melitensis antigens yield cognate CD8+ T cells in vivo.</a> Infect Immun. 78 (1), 168-176 (2010).</li>
<li>Lyons, A. B., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lymphocyte+division+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of lymphocyte division by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 171 (1), 131-137 (1994).</li>
<li>Weston, S. A., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+studies.+Analysis+by+flow+cytometry+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy.</a> J Immunol Methods. 133 (1), 87-97 (1990).</li>
<li>Akondy, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yellow+fever+virus+vaccine+induces+a+broad+and+polyfunctional+human+memory+CD8%2B+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yellow fever virus vaccine induces a broad and polyfunctional human memory CD8+ T cell response.</a> J Immunol. 183 (12), 7919-7930 (2009).</li>
<li>Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+antigen-driven+responses+by+flow+cytometry%3A+monitoring+proliferation+by+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Tracking antigen-driven responses by flow cytometry: monitoring proliferation by dye dilution.</a> Cytometry A. 73 (11), 1019-1034 (2008).</li>
<li>Labadi, A., Balogh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+preferences+in+serosal+homing+and+distribution+of+peritoneal+B-cell+subsets+revealed+by+in+situ+CFSE+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential preferences in serosal homing and distribution of peritoneal B-cell subsets revealed by in situ CFSE labeling.</a> Int Immunol. 21 (9), 1047-1056 (2009).</li>
<li>Suffner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+support+homeostatic+expansion+of+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+in+Foxp3.LuciDTR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells support homeostatic expansion of Foxp3+ regulatory T cells in Foxp3.LuciDTR mice.</a> J Immunol. 184 (4), 1810-1820 Forthcoming.</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l&#39;Università del Wisconsin-Madison.

Questo test può essere modificato per indagare la capacità proliferativa delle cellule, tra cui l&#39;espansione clonale, perché CFSE divide equamente tra progenie relativamente 10,11. E &#39;anche possibile utilizzare l&#39;etichettatura CFSE per studiare la migrazione delle cellule 6,12, anche se ci sono altre cellule tracciamento metodi che possono essere più appropriato a seconda delle ipotesi, per esempio tetrameri e bioluminescenza 13, che può anche essere combinato con l&#39;etich...

<table><tbody><tr><td>perle di vetro da 1 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;filtro per cellule m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>piatto a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Adiuvante di Freund incompleto&amp;rsquo;s Adiuvante</td><td>Pacific Immunology</td><td>n/d</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5879</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>16000-077</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso FC 500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>n/d</td><td></td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti in vetro Kontes</td><td>Kontes Corp</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Mini Beadbeater</td><td>Biospec Products</td><td>n/d</td><td></td></tr><tr><td>Ago</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reagente lisante PharmLyse</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, di Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFSE Kit</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

antigene specifico in vivo analisi uccidere utilizzando cellule bersaglio cfse etichetta

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetato succinimidile estere (CFSE) può essere utilizzato per etichettare facilmente e rapidamente una popolazione di cellule per un esame più vivo. L&#39;etichettatura è stata classicamente utilizzato per studiare la proliferazione e la migrazione. Nel metodo presentato qui, abbiamo accorciato la timeline dopo il trasferimento adottivo di guardare la sopravvivenza e l&#39;uccisione di epitopo specifiche cellule bersaglio CFSE etichettato 4-6. Il livello di uccidere specifiche di una T CD8 + clone di cellule in grado di indicare la qualità della risposta, in quanto la loro quantità può essere fuorviante. Specifiche cellule T CD8 + può diventare funzionale esaurito nel tempo con un calo della produzione di citochine e uccidendo 7,8. Inoltre, alcuni cloni di cellule CD8 + T non può uccidere così come gli altri con diverse specificità TCR 9. Efficace per l&#39;immunità cellulo-mediata (CMI), devono essere identificati antigeni che producono non solo un numero adeguato di risposta delle cellule T, ma anche funzionale, robusto cellule T risponde. Qui valutare l&#39;uccisione delle cellule specifiche per cento dei due cloni T peptide specifico delle cellule in topi BALB / c.

Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno<sup&gt; 1</sup&gt;. Una misura della qualità CTL è la loro capacità di uccidere specificamente<sup&gt; 2</sup&gt;. Etichettatura CFSE di cellule bersaglio può essere utilizzato per indagare questa qualità CTL risposta<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

L'estere succinimidilico del diacetato di carbossifluoresceina (CFSE) può essere utilizzato per marcare in modo semplice e rapido una popolazione cellulare di interesse per l'indagine in vivo. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare la qualità funzionale delle cellule T CD8 positive in risposta a un particolare antigene, analizzando la loro capacità di uccidere cellule bersaglio in vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto inducendo cellule T effettrici CD8 positive specifiche per l'antigene attraverso l'immunizzazione di topi riceventi. Come secondo passaggio, le cellule bersaglio primarie vengono rese specifiche o altrimenti trattate, completando così la creazione del sistema effettore-bersaglio specifico.Successivamente, le cellule bersaglio vengono somministrate ai topi riceventi mediante trasferimento adottivo retroorbitale. Per osservare l'effetto citotossico in vivo, sono stati ottenuti risultati che indicano se gli effettori hanno ucciso alcune delle cellule bersaglio, in base all'analisi citofluorimetrica delle cellule marcate con CFSE. Ciao, mi chiamo Marina Ward.Sono uno studente laureato nel laboratorio di Gary Splitter presso l'Università del Wisconsin di Madison. Questo metodo fornirà informazioni sul processo di uccisione mediato dai linfociti T citotossici (CTL) e può essere applicato anche allo studio della proliferazione e della sopravvi

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Immunologia e Infezioni

CFSE etichette covalentemente molecole intracellulari di lunga durata con il colorante fluorescente, carboxyfluorescein. Come tale, quando una cellula si divide CFSE marcato, la sua progenie sono la metà della quantità di fluorescenza, che può così essere utilizzato per valutare la divisione cellulare. In questo articolo vengono descritte le procedure normalmente utilizzate per l'etichettatura dei linfociti mouse con CFSE.

L&#39;uso di diacetato Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) per monitorare la proliferazione dei linfociti

Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Un semplice protocollo per la preparazione di estratti di tessuto umano da utilizzare come fonte di antigeni a cellule T funzionali saggi è descritto. Questo metodo consente risposte delle cellule T al tessuto-antigeni derivati ​​da...

Estrazione di antigeni dei tessuti per test funzionali

Il video mostra un test basato sulla citometria a flusso per analizzare l'immunodominanza nei linfociti T citotossici o le risposte CTL. Le cellule bersaglio fluorescenti iniettate mostrano una fluorescenza variabile corrispondente agli epitopi immunogenici. La raccolta e lo smistamento post-milza rivelano una riduzione delle cellule fluorescenti ad alta intensità, confermando l'immunodominanza nelle risposte CTL.

Un test per valutare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

La capacità di monitorare le risposte delle cellule T in dettaglio in vivo è importante per lo sviluppo della nostra comprensione della risposta immunitaria. Qui si descrive l'uso di array di destinazione fluorescenti (ALS) in un test in vivo di cellule T in che valuta&gt; 250 parametri contemporaneamente mediante citometria a flusso.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Descriviamo qui un saggio di uccisione a base di citometria in vivo che consente di esaminare l'immunodominanza nelle risposte citotossiche dei linfociti T (CTL) a un antigene tumorale modello. Forniamo esempi di come questo saggio elegante può essere impiegato per gli studi meccanicistici e per i test di efficacia dei farmaci.

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

Presentato qui è un protocollo per la misurazione delle cellule CD4 - T proliferanti in risposta a proteine antigeniche o peptidi utilizzando la diluizione del tinri. Questo analisi è particolarmente sensibile alle rare cellule T specifiche dell'antigene e può essere modificato per facilitare la clonazione delle cellule specifiche dell'antigene.

Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Impara a valutare la citotossicità in vivo delle cellule CD8+ T specifiche per l'antigene utilizzando un saggio basato su CFSE e citometria a flusso. Questo metodo misura la capacità funzionale delle cellule T di uccidere bersagli specifici nel sistema immunitario.

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

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