Name: In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri l'imaging molecolare intravascolare NIRF per visualizzare la placca infiammatoria in vivo usando un catetere a fluorescenza nel coniglio. Questo metodo multimodale aiuta a studiare la biologia vascolare e l'aterosclerosi.

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Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health concedere R01 # 108229 HL, American Heart Association Scientist Development Grant # 0830352N, Howard Hughes Medical Institute Career Development Award, Ventures Broadview, Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013 in borsa accordo # 235689), e il MGH William Schreyer Fellowship.

Nel modello animale in vivo: Generazione di aterosclerosi aortoiliaco Sperimentale 1) L'angiografia basale e denudazione Balloon <ol><li> Prima di chiedere al basale angiografia e denudazione palloncino, un coniglio bianco neozelandese è nutriti con una colesterolo alto (1%) la dieta per 1 settimana. Questo animale è utilizzato per rilevanza traslazionale come 1) la aorto-iliache navi conigli sono dello stesso calibro come umano arterie coronarie (2,5-3.5mm) e 2) l', iperlipidemici pallone-infortunio modello genera aterosclerosi infiammato cuscinetto simili cellule infiammatorie (macrofagi ) e molecole (catepsine) come l'aterosclerosi umana. </li><li> A seguito di alimentazione colesterolo, l'animale viene anestetizzato con propofol e ketamina. Un one-inch linea mediana ventrale incisione del collo è realizzato con con una dimensione di 15-bisturi lama. Utilizzando tecniche di dissezione smussa, i muscoli sotto la fascia sul lato destro della trachea è esposto. Il muscolo sternocephalicus sinistra è divisa lungo il raccordo del tessuto connettivo, e il diritto arteria carotide comune è esposto. L'arteria è separato dal nervo vago. Anelli di sutura prossimale e distale sono immessi sul arteria per consentire retrazione e occlusione. A 1 a 2mm smussati arteriotomia è fatto attraverso il quale un 5 Francese (diametro esterno 1,67 millimetri) guaina vascolare è inserita ed eparina (1000μ/mL, ~ 150units/kg) viene somministrato intra-arteriosa attraverso la guaina. </li><li> Mezzo di contrasto (Ultravist) viene quindi iniettato (da 1 a 2 ml) per un periodo di 2 secondi per ottenere un angiogramma controllo dell'aorta distale ed entrambe le arterie iliache. </li><li> Le arterie e aorta ileofemorale vengono feriti da denudazione endoteliale. Utilizzando metodi di fluoroscopia standard, un catetere 3FR embolectomia di Fogarty è posizionato in arteria distale ileofemorale e gonfiato con 0,3-0,5 cc di contrasto (50% contrast/50% salina) o aria. Il catetere viene poi ritirato prossimalmente nel suo stato gonfiato a distanza lungo l'iliaca destra e l'aorta distale fino al decollo della arteria renale sinistra. Dopo la denudazione pallone, l'angiografia è ripetuto per documentare pervietà del vaso. A seguito di angiografia, guaine e tutti i cateteri vengono rimossi e il prossimale dell'arteria carotide comune è la legatura, il muscolo e fascia sono suturate con una sutura 4 / 0 riassorbibile, e l'incisione cutanea è chiuso con un 4 / 0 non riassorbibile sutura. </li><li> L'animale è poi permesso di recuperare con la somministrazione di una dose di antibiotico (cefazolina, 0,5 grammi IM). Farmaci per il dolore tra 0,01 mg / kg IM buprenorfina (due volte al giorno se necessario). Gli animali sono poi proseguito l'1% del colesterolo per 4 settimane post-palloncino denudazione. Alla 5 ° settimana, gli animali sono passati ad una dieta colesterolo 0,3%. </li></ol> Integrato multi-modale Imaging di Coniglio Atheromata 2) Etichettatura di proteoliticamente attivo placca infiammata con nanosensori iniettabili, angiografia, ecografia intravascolare (IVUS), e in vivo intravascolare NIRF immagini di Coniglio Ateroma <ol><li> Otto settimane dopo un trauma palloncino e 24 ore prima di imaging, il coniglio viene iniettato per via endovenosa con 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) tramite vena orecchio. </li><li> Ventiquattro ore dopo l'iniezione, gli animali sono anestetizzati e l'accesso arterioso è ottenuto tramite sinistra arteria carotide comune (vedi punto 1.2). Intra-arteriosa eparina viene somministrato (150 unità / kg). Baseline angiografia è ottenuto come sopra. </li><li> Un catetere IVUS è caricato su una clinica in grado coronarica 0,014 filo pollici e inserito nel fodero. Utilizzando guida fluoroscopica, la punta radiopaca del filo è posizionato distalmente in arteria iliaca destra. Il catetere IVUS è poi avanzato in arteria iliaca prossimale utilizzando una tecnica standard clinico monorotaia. </li><li> A 100 pullback mm è iniziato e le immagini vengono registrate. Ricostruzione longitudinale della nave si ottiene e placca luminale è identificato. </li><li> Il catetere NIRF 11,12 viene caricato sul filo di 0,014 pollici (monorotaia sistema) e il catetere viene accuratamente inserito nella guaina e la testa di imaging è posizionato distalmente in arteria iliaca destra. </li><li> Multipli pullbacks automatizzati (1 mm / sec pullback longitudinale, 30 colpi al minuto) sono eseguite e segnali di fluorescenza all'interno delle zone di aterosclerosi sono noti. Le immagini vengono registrate e il successivo trattamento con scala appropriata e finestre a seconda della distanza del segnale viene raggiunto. </li></ol> 3) L'eutanasia e l'isolamento di ex vivo aorto-iliaca del tessuto <ol><li> L'eutanasia è compiuta con 1cc di agente eutanasia (soluzione di 390mg di sodio fenitoina sodio pentobarbital e 50 mg), per via endovenosa, iniezione singola. </li><li> L'albero arterioso è perfuso con soluzione fisiologica 0,9% fino alla vena cava inferiore è chiaro di sangue. Aterosclerotica delle arterie aorta e iliache sono identificati e sezionati libero dai tessuti circostanti. Inoltre, piccoli pezzi di 2 x 2 cm di liver, rene, milza e cuore sono anche ottenuti. </li><li> Ex vivo NIRF imaging con il catetere intravascolare NIRF immagini può essere fatto in questa fase. La nave è allungata e il catetere NIRF è reinserito in aorta prossimale fino a quando la testa di imaging è posizionato a livello dell'arteria iliaca destra o di biforcazione. Multipli pullbacks automatici vengono eseguiti come sopra (vedi 2.6). </li></ol> 4) ex vivo fluorescenza Riflettanza Imaging (FRI) di aorta e le arterie iliache sezionato <ol><li> Tessuto sezionato viene inserito in 10-20 cc di soluzione fisiologica e trasportati per le analisi ven (Kodak Image Stazione 4000MM Pro, Carestream Health, Inc.). </li><li> Aorta, vasi iliaci sono allungate per approssimare in tempo reale lunghezze e le immagini sono ottenute a più lunghezze d'onda [luce bianca, canale verde fluorescente (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) e Cy7 (ex 650 nm, em 760 nm)] canali. Una serie di tempi di esposizione sono utilizzati per ogni lunghezza d'onda (0.1-30sec) e le immagini acquisite vengono esportati come DICOM o 16-bit TIFF i file non in scala per ulteriori analisi. Come controlli positivi e negativi, organi (fegato, milza, rene e cuore) sono esposte a canali simili e tempi di esposizione. </li><li> Aree di segnale aumentato nel vicino infrarosso canale (780nm +) sono noti aterosclerotiche nelle arterie. </li></ol> 5) Integrazione del tessuto per l'analisi Sezioni e immunoistochimica <ol><li> Aree di normale (non feriti tessuto, cioè l'arteria iliaca sinistra) e le aree di placca sono identificati e piccoli anelli di 5-10 mm di tessuto sono incorporati in ottobre (temperatura di taglio ottimale) dei media. I blocchi sono conservati a -80 C fino al sezionamento. </li><li> Le tecniche standard per le analisi immunoistochimiche e di sezionamento vengono eseguite. Ematossilina ed eosina, Ram-11 e catepsina B colorazione vengono eseguite. </li></ol> Analisi e integrazione di immagini multimodali (angiografia, IVUS, NIRF e ven.) 6) Elaborazione di immagini NIRF e VEN <ol><li> File DICOM contenenti dati di immagini da NIRF e VEN (prese al vicino canale dell'infrarosso da 780 nm) pullback sono trattati con MATLAB e software OsiriX, rispettivamente. Windowing corretto per visualizzare gamma completa di intensità del segnale è ottenuto. Immagini finali sono esportati come file TIFF. </li><li> I file vengono importati nel software standard di elaborazione delle immagini (Keynote può essere utilizzato). Le immagini sono allineati sulla base di punti di riferimento (cioè vertebre su angiogramma, biforcazione iliaca, e dell'arteria renale). Aree di nave normale e placca sono identificati. </li><li> Regioni di interesse (ROI) sono tracciate manualmente (per il tessuto normale e aree di placca) e media intensità di segnale sono acquisite con OsiriX e MATLAB, rispettivamente, sia per ven e immagini NIRF. Per guida appropriata tracciamento, l'immagine IVUS longitudinale della nave viene utilizzato e l'identificazione della nave normale e targa sono facilmente identificabili. </li><li> Obiettivo da sfondo (TBR) rapporti sono calcolati per le zone della placca. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Al termine del protocollo di cui sopra, siamo in grado di identificare e caratterizzare le aree di attività aumentata della proteasi catepsina nella placca infiammatoria all'interno della aorta e vasi iliaci. L'iniezione di un nanosensore attivabili (Prosense/VM110) ci permette di identificare la placca proteoliticamente attivo. Questi appaiono come segnali luminosi o zone di intensa quando ripreso utilizzando ven nel canale vicino infrarosso (750 nm). Il pullback NIRF correlazione con l'intensità del segnale è aumentato del venerdì e allineamenti con IVUS anatomiche che permettono di registrazione dei segnali NIRF. TBR targa calcolato è ottenuto da venerdì e NIRF erano simili (vedi Figura 3: media NIRF TBR 4.2, significa ven TBR 2,9). Analisi immunoistochimica della placca luminosa conferma la presenza intensa di RAM-11 e l'attività della catepsina B in aree di placca (dati non riportati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2257/2257fig1.jpg"> Figura 1. Schematica del catetere 2D NIRF Per estendere il potenziale clinico di un approccio 1D NIRF rilevamento 6, abbiamo costruito un romanzo in 2-D NIRF-catetere per l'imaging intravascolare. 11,12 La fuoriserie catetere è costituito da una fibra ottica (125 micron di diametro alloggiati in tubo di polietilene: 2.9F), che illumina con una sorgente laser a 750 nm di eccitazione. La luce laser è emessa ad un angolo di 90 gradi rispetto all'asse della fibra. Il sistema utilizza due motori automatici (rotazionale e traslazionale) per consentire la concomitante immagini a 360 gradi e pullback longitudinale per ottenere vere immagini 2D. Le immagini utilizzate con il permesso di riferimento 11. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2257/2257fig2.jpg"> Figura 2. Schematico dimostrando proteasi-mediata attivazione dei nanosensori, Prosense/VM110. Immagine usata con il permesso di riferimento 10. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/2257/2257table1.jpg" files> Figura 3. In vivo ed ex TBRs placca in vivo (target a rapporti di sfondo)

<ol><li>Andersson, J., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity and atherosclerosis.</a> Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).</li>
<li>Calfon, M. A., Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+near-infrared+fluorescence+molecular+imaging+of+atherosclerosis%3A+toward+coronary+arterial+visualization+of+biologically+high-risk+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques.</a> Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).</li>
<li>Chen, J., Tung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Proteolytic+Activity+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis.</a> Circulation. 105, 2766-2771 (2002).</li>
<li>Jaffer, F. A., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Cardiovascular Disease.</a> Circulation. 116, 1052-1061 (2007).</li>
<li>Jaffer, F. A., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+Multimodality+Molecular+Imaging%3A+Insights+Into+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).</li>
<li>Jaffer, F. A., Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Catheter+Molecular+Sensing+of+Inflammation+in+Proteolytically+Active+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis.</a> Circulation. 118, 1802-1809 (2008).</li>
<li>Kim, D. -E., Kim, J. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+Imaging+of+Human+Atheromata+Captures+Molecular+Information+of+Atherosclerosis%2C+Complementing+Anatomic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).</li>
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<li>Razansky, R. N., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescence+catheter+system+for+two-dimensional+intravascular+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo.</a> Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).</li>
<li>Jaffer, F. A., Calfon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Intravascular+Near-Infrared+Fluorescence+Molecular+Imaging+of+Inflammation+in+Atherosclerosis+and+Stent-Induced+Vascular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury.</a> Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).</li>
</ol>

FAJ - Consulente Ex, VisEn medica; onorari, Boston Scientific

Infiammata placche ad alto rischio o vulnerabili sono probabilmente responsabili della maggior parte degli infarti del miocardio. L&#39;identificazione delle targhe precedenti l&#39;inizio dei sintomi ha importanti implicazioni cliniche, sia nel predire gli esiti e guidare la terapia medica. Tradizionali modalità di imaging delle arterie coronariche, come l&#39;angiografia a raggi X in genere si concentrano sulla caratterizzazione dei restringimenti del lume, piuttosto che illumina i profili biologici sottostanti ad alt...

<table><tbody><tr><td>Prosense 750</td><td>Visen Medical</td><td>VM110</td><td>500 nmol/kg iniezione IV</td></tr><tr><td>Heparin Sodico</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>NovaPlus</td><td>46015683</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina HCL 2%</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Bedford Laboratories</td><td>NDC 55390-100-10</td><td></td></tr><tr><td>Chetamina</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Dieta ad alto contenuto di colesterolo 1%</td><td>Research Diets</td><td>C30293</td><td></td></tr><tr><td>Dieta ad alto contenuto di colesterolo 0,3%</td><td>Research Diets</td><td>C30255</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo near infrared fluorescenza (nirf) intravascolare imaging molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per imaging di aterosclerosi

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

La risposta vascolare all'infiammazione è una risposta infiammatoria ben coordinata, innescata dall'accumulo di macrofagi nella parete vascolare, che porta all'accumulo di placche intraluminali ricche di lipidi, alla proliferazione delle cellule muscolari lisce e al restringimento progressivo del lume vascolare. La formazione di tali placche vulnerabili, soggette a rottura, è alla base della maggior parte dei casi di infarto miocardico acuto. La complessa cascata infiammatoria molecolare e cellulare è regolata dal reclutamento di linfociti T e macrofagi e dai loro effetti paracrini sulle cellule endoteliali e sulle cellule muscolari lisce.1
L'imaging molecolare nell'aterosclerosi si è evoluto in uno strumento clinico e di ricerca fondamentale che permette la visualizzazione in vivo dell'infiammazione e di altri processi biologici. Diversi esempi recenti dimostrano la capacità di rilevare placche ad alto rischio nei pazienti e di valutare gli effetti dei farmaci nell'aterosclerosi.4 Sebbene diverse metodiche di imaging molecolare (in particolare risonanza magnetica e PET) possano visualizzare aspetti biologici di vasi di grandi dimensioni come le arterie carotidi, esistono poche opzioni per l'imaging delle arterie coronariche.2 L'avvento di strategie di imaging ottico ad alta risoluzione, in particolare la fluorescenza nell'infrarosso vicino (NIRF), abbinate a sonde fluorescenti attivabili, ha aumentato la sensibilità e ha portato allo sviluppo di nuove strategie intravascolari per migliorare l'imaging biologico dell'aterosclerosi coronarica umana.
L'imaging molecolare mediante fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) utilizza una luce di eccitazione con una larghezza di banda definita (650-900 nm) come fonte di fotoni che, quando viene indirizzata a un agente di contrasto ottico o a una sonda fluorescente, emette fluorescenza nella finestra del vicino infrarosso, rilevabile mediante un opportuno filtro di emissione e una telecamera CCD ad alta sensibilità. A differenza della luce visibile, la luce NIR penetra in profondità nei tessuti, è notevolmente meno attenuata da assorbitori fotonici endogeni come emoglobina, lipidi e acqua, e consente elevati rapporti segnale-rumore grazie alla ridotta autofluorescenza nella finestra del vicino infrarosso. L'imaging all'interno della finestra NIR può migliorare sostanzialmente le potenzialità dell'imaging in vivo.2,5
Le proteasi infiammatorie a cisteina sono state ampiamente studiate utilizzando sonde NIRF attivabili10 e svolgono ruoli importanti nell'aterogenesi. Mediante la degradazione della matrice extracellulare, le proteasi a cisteina contribuiscono in modo significativo alla progressione e alle complicanze dell'aterosclerosi8. In particolare, la proteasi a cisteina cathepsina B è fortemente espressa e colocalizza con i macrofagi negli ateromi sperimentali di topo, coniglio e umani3,6,7. Inoltre, l'attività della cathepsina B nelle placche può essere rilevata in vivo utilizzando una tecnologia precedentemente descritta di fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) intravascolare monodimensionale6, in combinazione con un agente nanosensore iniettabile costituito da un polimero di polilisina funzionalizzato con fluorocromi NIR multipli (VM110/Prosense750, ex/em 750/780 nm, VisEn Medical, Woburn, MA), che determina un forte quenching intramolecolare in condizioni basali10. Dopo il clivaggio enzimatico mirato da parte di proteasi a cisteina come la cathepsina B (nota per colocalizzare con i macrofagi della placca), i fluorocromi si separano, determinando un notevole ampliamento del segnale NIRF. Il rilevamento intravascolare del segnale di fluorescenza NIR mediante il nuovo catetere NIRF intravascolare bidimensionale utilizzato consente ora un rilevamento in vivo ad alta risoluzione e geometricamente accurato dell'attività della cathepsina B nella placca infiammata.
L'imaging molecolare in vivo dell'aterosclerosi mediante imaging NIRF 2D basato su catetere, in alternativa a un precedente approccio spettroscopico 1D,6 è uno strumento innovativo e promettente che sfrutta l'attività aumentata delle proteasi nelle placche ricche di macrofagi per rilevare l'infiammazione vascolare.11,12 Il seguente protocollo di ricerca descrive l'utilizzo di un catetere intravascolare NIRF bidimensionale per immagini e caratterizzare la struttura della placca sfruttando aspetti chiave della biologia della placca. Si tratta di una piattaforma trasferibile che, integrata con le attuali tecnologie cliniche di imaging, tra cui angiografia e ultrasonografia intravascolare (IVUS), offre una tecnica unica e innovativa di imaging molecolare multimodale integrato in grado di distinguere gli ateromi infiammatori e consentire il rilevamento di segnali NIRF intravascolari in arterie coronariche di dimensioni umane.

Noi dettaglio un nuovo fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) catetere per 2-dimensionale di imaging intravascolare molecolare della biologia della placca<em&gt; In vivo</em&gt;. Il catetere NIRF può visualizzare fondamentali processi biologici come l&#39;infiammazione segnalazione sulla presenza di fluorocromi attivabili e mirata placca avido NIR. Il catetere utilizza clinica requisiti di progettazione e di potere, ed è mirato per applicazioni in arterie coronarie umane. Lo studio di ricerca che segue descrive una strategia di imaging multimodale che utilizza un romanzo<em&gt; In vivo</em&gt; NIRF catetere intravascolare di immagine e quantificare placca infiammatoria nel proteoliticamente attivo atheromata coniglio infiammata.

In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi

La risposta vascolare alla lesione è una risposta infiammatoria ben orchestrata, innescata dall'accumulo di macrofagi all'interno della parete del vaso, che porta a...

In questa procedura, viene utilizzato un nuovo catetere fluorescente nel vicino infrarosso o catetere NIRF per ottenere immagini bidimensionali della biologia vascolare intrarteriosa e monitorare processi biologici quali aterosclerosi, infiammazione e angiogenesi. In primo luogo, si genera un modello sperimentale di aterosclerosi nell'aorta e nelle iliache di un coniglio bianco della Nuova Zelanda, al momento sperimentale appropriato. Viene quindi iniettato un Nanosensore Attivo NIRF per marcare la placca infiammata.24 ore dopo, è richiesta un'angiografia arteriosa coregistrata, un'ecografia intravascolare e una fluorescenza intravascolare nel vicino infrarosso in vivo ed ex vivo. Sono necessarie immagini di coniglio, a Roma. Successivamente, l'aorta e le arterie iliache vengono dissecate per eseguire imaging di riflettanza fluorescente ex vivo e analisi immunohistochimica della placca infiammata.I risultati finali mostrano segnali quantificabili che si correlano a una placca aterosclerotica infiammatoria. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'imaging molecolare, come il rilevamento in vivo e in tempo reale dell'infiammazione e delle placche, i marcatori chiave delle placche vulnerabili o i precursori dell'infarto miocardico acuto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'aterosclerosi poiché consentono il rilevamento in tempo reale in vivo dell'infiammazione, il che potrebbe tradursi in terapie mirate e personalizzate in grado di ridurre l'infiammazione nell'organismo umano.L'aterosclerosi coronarica umana è fondamentale per prevenire l'infarto miocardico acuto, una patologia temuta. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'aterosclerosi coronarica, può essere applicato anche ad altri sistemi, inclusa la malattia vascolare periferica, ad esempio per caratterizzare lesioni nell'aorta carotidea, nelle arterie iliache o femorali, responsabili della malattia vascolare periferica. Dopo la denudazione post-dilatazione con palloncino e l'instaurazione del modello di aterosclerosi, gli animali vengono mantenuti con una dieta contenente il 1% di colesterolo per quattro settimane e, alla quinta settimana, vengono passati a una dieta contenente lo 0,3% di colesterolo.Otto settimane dopo la lesione da palloncino e 24 ore prima dell'imaging, il coniglio viene iniettato per via endovenosa attraverso una vena dell'orecchio al fine di marcare le placche infiammate proliferative utilizzando il nanosensore iniettabile ProSense 750 VM 110 una volta trascorse 24 ore. Gli animali vengono preparati per l'intervento chirurgico raschiando l'area chirurgica e quindi disinfettandola accuratamente con iodopovidone al 10%. Successivamente, gli animali vengono anestetizzati e l'asse arterioso viene ottenuto attraverso l'arteria carotide comune destra. Per facilitare l'imaging del tessuto, viene somministrato eparina intra-arteriosa e viene eseguita un'angiografia basale.Un catetere IVUS viene montato su un filo guida clinico per arteria coronarica da 0,014 pollici e inserito nel catetere di introduzione con guida fluoroscopica. La punta del filo con radiomarcia viene posizionata in posizione distale nell'arteria iliaca destra. Viene avviato un retrocesso di 100 millimetri che comprende la biforcazione iliaca dell'AOR fino alle arterie renali e vengono registrate le immagini.Viene ottenuta la ricostruzione longitudinale del vaso e viene identificata la placca luminale. Successivamente si utilizza un retrocesso di 100 millimetri per coprire l'intera lunghezza dell'aorta. Le ricostruzioni longitudinali sono generate dalla serie di immagini assiali bidimensionali mediante il software di programmazione MATLAB.Il catetere NIRF viene caricato sul filo guida. Il catetere viene inserito con attenzione nel sheath e la testa di imaging viene posizionata in posizione distale nell'arteria iliaca sinistra, eseguendo contemporaneamente più retrocessioni automatiche del catetere NIRF. Vengono rilevati i segnali fluorescenti all'interno delle zone di aterosclerosi.Queste immagini vengono registrate ed elaborate ulteriormente utilizzando il software MATLAB, con opportune scalature e impostazioni di finestra in base all'intervallo di segnale ottenuto. Successivamente, l'animale viene soppresso e il tessuto aortoiliaco viene isolato ex vivo. L'aorta aterosclerotica e le arterie iliache vengono identificate ed isolate dai tessuti circostanti.Inoltre, vengono prelevati piccoli pezzi di fegato, rene, milza e cuore di due centimetri per due centimetri. Una volta isolato, l'albero arterioso viene perfuso con soluzione fisiologica fino a quando la vena cava inferiore non risulta priva di sangue. Al termine dell'NIRF ex vivo, il tessuto iliaco dell'AOR dissezionato viene posto in 10-20 centimetri cubici di soluzione fisiologica e trasportato per l'analisi mediante imaging di riflettanza fluorescente o FRI.Le aorta e i vasi iliache vengono allungati per approssimare le lunghezze in tempo reale e vengono acquisite immagini a diverse lunghezze d'onda mediante un sistema commerciale di imaging a fluorescenza riflessa dotato di filtri multicanale; per ciascuna lunghezza d'onda si utilizza una serie di tempi di esposizione. Le immagini vengono esportate come file DICOM per ulteriori analisi, impiegati come controlli positivi e negativi. Organi specifici come fegato, milza, rene e cuore vengono immaginati utilizzando canali e tempi di esposizione simili.Qualsiasi area con segnale fluorescente aumentato nel canale a infrarossi vicini viene notata nelle arterie aterosclerotiche. L'aumento del segnale si correla con aree di placca aumentata, segnale della catepsina B e macrofagi della placca, marcatori dell'infiammazione che delimitano placche vulnerabili ad alto rischio. Vengono identificate le aree di tessuto normale non danneggiato, come l'arteria iliaca sinistra, e le aree di placca; piccoli anelli di tessuto di cinque-dieci millimetri vengono inclusi in un mezzo OCT (optimal cutting temperature) fino al momento dell'utilizzo.Per la sezionatura, i blocchi vengono conservati a meno 80 gradi Celsius utilizzando tecniche standard per la sezionatura e l'analisi immunohistochimica. Vengono eseguite la colorazione con ematossilina ed eosina e la colorazione con RAM 11. I file DICOM vengono utilizzati per elaborare i dati di imaging provenienti da NIRF e FRI, acquisiti in luce infrarossa vicina.Il canale a 750 nanometri e i pullback vengono elaborati rispettivamente utilizzando il software MATLAB e OIC. Si ottiene una corretta impostazione della finestra per visualizzare l'intera gamma di intensità del segnale. Le immagini finali vengono esportate come file TIFF.I file vengono importati nel software standard di analisi delle immagini e le immagini vengono allineate sulla base di punti di riferimento come le vertebre, la biforcazione iliaca e l'arteria renale. Sull'angiogramma vengono identificate le aree di vaso normale e di placca.Le aree di interesse o ROI vengono delimitate manualmente per il tessuto normale e le zone di placca al fine di guidare un tracciamento appropriato. Viene utilizzata l'immagine IVUS longitudinale del vaso, in cui il vaso normale e la placca sono facilmente identificabili. Le intensità medie del segnale vengono acquisite mediante MATLAB e oix rispettivamente per le immagini FRI e NIRF.Infine, vengono calcolati i rapporti tra segnale mirato e fondo (TBR) per le zone della placca. Per calcolare il TBR, il segnale medio dell'area della placca (ROI) viene diviso per il segnale di fondo (ROI). Al termine del protocollo sopra descritto, è possibile identificare e caratterizzare le aree di aumentata attività della kassin o di proteasi di molecole infiammatorie in una placca infiammatoria localizzata nei vasi aortici e iliaci mediante iniezione di un nanosensore attivabile.Il sensore pro VM 110 ci permette di identificare la placca attiva proteoliticamente. Queste appaiono come zone luminose o ad alta intensità di segnale quando vengono visualizzate mediante FRI nel canale dell'infrarosso vicino. I pullback NIRF si correlano con un aumento dell'intensità del segnale rilevato da FRI e con l'allineamento all'IVUS, consentendo la registrazione anatomica dei segnali NIRF, dei tbr della placca calcolati tramite FRI e NIRF e delle analisi immunohistochimiche simili della placca luminosa, che confermano la marcata presenza di attività RAM 11 nelle aree della placca. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa due-quattro ore se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione a un'acquisizione temporale coerente e all'acquisizione delle immagini, nonché a un corretto allineamento con l'angiografia. L'ecografia intravascolare e la FRI sono fondamentali per l'interpretazione corretta dei dati dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging molecolare per esplorare l'aterosclerosi in vasi coronarici umanizzati.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare una strategia di imaging multimodale che impiega questo nuovo catetere intravascolare per nervi in vivo per visualizzare e quantificare la placca infiammatoria nell'ateroma rapido infiammato con attività proteolitica. Non dimenticare che lavorare con strumenti chirurgici e fluidi corporei, come il sangue, può essere pericoloso e che precauzioni, quali tecniche chirurgiche accurate e dispositivi di protezione individuale come guanti e mascherine, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi

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