Profilatura di metiltransferasi e altri S-Adenosil- _L-Omocisteina-binding proteine ​​mediante spettrometria di massa Compound Capture (CCMS)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è profilare le metiltransferasi provenienti da miscele proteiche complesse mediante spettrometria di massa con composti di cattura, o CCMS. Le metiltransferasi vengono isolate funzionalmente mediante composti di cattura trifunzionali che portano, come funzione di selettività, l'inibitore del prodotto generale delle metiltransferasi, S-adenosil-L-omocisteina (SAH), nel flusso di lavoro qui mostrato. L'isolamento funzionale viene ottenuto incubando un lisato cellulare con il composto di cattura per stabilire un equilibrio di legame reversibile tra la funzione di selettività del composto di cattura e le proteine bersaglio. Come secondo passaggio, la miscela viene irradiata con luce UV all'interno della capra box.

L'irradiazione luminosa attiva la funzione reattiva del composto di cattura. Questo induce la formazione di un legame crociato covalente irreversibile tra il composto di cattura e le proteine bersaglio. Successivamente, i coniugati proteici del composto di cattura vengono separati dal lisato, lavati accuratamente, rilasciati dal supporto solido e sottoposti a digestione con tripsina, al fine di identificare le proteine catturate mediante analisi spettrometrica di massa dei peptidi triptici. I risultati ottenuti dimostrano l'isolamento e l'identificazione diretta di metiltransferasi da un lisato cellulare di Escherichia coli basati sulla metodica del composto di cattura abbinata alla spettrometria di massa.

Ciao, sono Thomas Lentz del Laboratorio di CaTECH del Dipartimento di Biochimica. Sono Mathias Rega, anch'io del Laboratorio di Biochimica CapTech. Sono Mer Linsky del dipartimento di analisi.

Oggi vi mostreremo il procedimento per l'isolamento in tempo reale delle metiltransferasi da estratti cellulari equilibrati. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le interazioni tra proteine e piccole molecole. Il procedimento consente l'isolamento e l'identificazione di sottoproteomi funzionali come chinasi, metalloproteasi, gtpa, ais, per citarne alcuni.

Utilizziamo anche questo approccio per la scoperta di bersagli farmacologici. Cominciamo dunque. Per gli esperimenti di cattura, si utilizza il kit per lumaca L homocystine caper kit short SAH caper kit.

Questo kit include il composto di cattura SAH e SAH libero come competitore. Sono inoltre inclusi microsferette magnetiche rivestite con streptavidina di un micron di diametro, tampone di cattura concentrato cinque volte e tampone di lavaggio concentrato cinque volte. Utilizzando diversi tubi di una striscia PCR da 200 microlitri, preparare le microsferette magnetiche rivestite con streptavidina caricate con il composto di cattura SAH mescolando 50 microlitri di microsferette magnetiche rivestite con streptavidina a 10 milligrammi per millilitro con 25 microlitri di composto di cattura SAH a 100 micromolare per ogni Eloqua vigorosamente.

Agitare le sospensioni risultanti a temperatura ambiente per due minuti per consentire il legame della molecola di biotina del composto di cattura alla streptavidina sulla superficie delle microsfere magnetiche. Successivamente, raccogliere magneticamente le microsfere Capra nei tappi delle provette PCR utilizzando il Capra Mag, eliminare il soprannatante e risospendere le microsfere Capra ottenute in 200 microlitri di buffer di lavaggio 1x. Raccogliere nuovamente magneticamente le microsfere Capra nei tappi delle strisce di provette PCR ed eliminare il soprannatante.

Chiudere quindi i tubi per evitare l'essiccazione delle perle. Etichettare successivamente nuovi tubi per il saggio di cattura e i controlli necessari, inclusi il controllo di competizione. Prelievo del controllo di competizione per il prelievo e il saggio di cattura combinato più prelievo, posizionare i tubi etichettati nella scatola Capra per regolare la temperatura tra zero e quattro gradi Celsius.

Quindi pipettare il volume di acqua milli Q calcolato per un volume di reazione finale di 100 microlitri e 20 microlitri di buffer di cattura cinque volte concentrato. Per ogni reazione, aggiungere 0,26 milligrammi di lisato cellulare totale di *E. coli* DH5α in ogni provetta e mescolare delicatamente per inversione. Per il controllo della competizione e per il controllo della competizione del pull-down, aggiungere 20 microlitri di soluzione del competitore SAH 10 millimolare.

Per il saggio di cattura, per il saggio di precipitazione e per il saggio combinato di cattura più precipitazione, aggiungere 20 microlitri di acqua milli Q invece della soluzione SAH, mescolare delicatamente tutti i tubi per inversione e centrifugare brevemente. Successivamente, sospendere le perle Capra nel rispettivo lisato e incubare per tre ore a quattro gradi Celsius. Mantenere le perle in sospensione mediante rotazione per consentire il legame reversibile delle proteine leganti SAH alla funzione di selettività SAH del composto di cattura SAH.

Dopo l'incubazione, centrifugare brevemente e posizionare le sospensioni nella capra box. Separare le provette ed estrarre le sospensioni per il pull down e il controllo della competizione del pull down, mettendole sul ghiaccio. Lasciare le sospensioni rimanenti per il controllo della competizione del saggio di cattura e per il saggio di cattura combinato.

Tirare verso il basso il tasto nella scatola capra per irradiare i campioni con luce UV mentre vengono contemporaneamente raffreddati. Irradiare i campioni per un tempo totale di 30 minuti con intervalli di irradiazione di 2,5 minuti in provette chiuse tra zero e quattro gradi Celsius. Questo processo formerà un legame covalente di cross-linking tra la funzione reattiva del composto di cattura SAH e le proteine leganti SAH.

Rimuovere le sospensioni dal box Capra a intervalli di irradiazione di 2,5 minuti. Raffreddare in acqua ghiacciata per circa 15 secondi e mescolare più volte per inversione. Quindi centrifugare brevemente i campioni per rimuovere qualsiasi sospensione residua nei coperchi e riposizionarli nel box Capra per il successivo intervallo di irradiazione.

Successivamente, aggiungere le sospensioni per l'analisi di pull-down e il controllo di competizione del pull-down e aggiungere 20 microlitri di soluzione di SAH 10 millimolare al saggio di cattura per il controllo di competizione, ovvero il controllo di competizione del pull-down e il saggio di cattura combinato più pull-down, aggiungendo 20 microlitri di acqua milli Q. Incubare le sospensioni per 10 minuti a quattro gradi Celsius, mantenendo le perle e la sospensione in rotazione durante il saggio di cattura. Le proteine leganti SAH non cross-linkate al composto di cattura SAH verranno dislocate.

Dopo l'incubazione, raccogliere le perle capra dai sospensioni utilizzando il capra mag e scartare il soprannatante. Quindi lavare le perle mediante risospensione, sospendendole in 200 microlitri di buffer di lavaggio 1x e raccogliendo le perle mediante separazione magnetica. Ripetere questo lavaggio cinque volte, quindi risospendere le perle in 200 microlitri di acqua milli Q e raccoglierle mediante separazione magnetica.

Risospendere le perle in 200 microlitri di acetonitrile al 60% e raccogliere le perle utilizzando il capri mag. Ripetere questo lavaggio con acetonitrile due volte. Applicare ultrasuoni se le perle non possono essere facilmente risospese.

Successivamente, rilasciare le proteine legate alle perle aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile al 60%, acido trifluoroacetico 0,2%, appena preparato, seguito da un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione vigorosa. Applicare nuovamente ultrasuoni se le perle non si risospendono facilmente.

Infine, raccogliere magneticamente le perle e scartarle. Tagliare la striscia di provette in singole provette, perforare i coperchi ed evaporare il sopranatante fino a complete essiccazione. A questo punto, utilizzando un evaporatore centrifugo, le proteine catturate possono essere sottoposte ad elettroforesi SDS-PAGE oppure processate per spettrometria di massa come descritto nella sezione seguente; sciogliere le proteine rilasciate dalle perle magnetiche in 10 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare.

Posizionare i campioni in un bagno ad ultrasuoni, quindi vortexare i campioni. Successivamente, aggiungere un microlitro di tripsina 0,5 microgrammi per microlitro in HCl 1 millimolare, centrifugare brevemente e incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Dopo l'incubazione notturna, desalinare una soluzione contenente i peptidi triptici delle proteine catturate utilizzando materiale C18, come ad esempio puntine di stadio da 20 microlitri secondo le istruzioni del produttore da parte di Biosystems, ed eluire i peptidi due volte con 10 microlitri di metanolo al 50%, acido formico al 5%.

Quindi evaporare il solvente utilizzando un evaporatore centrifugo, lasciando i peptidi desalati asciutti; risospendere i peptidi in 5,5 microlitri di acido formico 0,1% applicando ultrasuoni in un bagno ad ultrasuoni e vortexando. Infine, analizzare il campione mediante cromatografia liquida in flusso nanometrico abbinata a spettrometria di massa in tandem, come descritto nel protocollo scritto. Per analizzare i dati MSM S, utilizzare un algoritmo di identificazione proteica come Seaquest implementato nel software Bioworks Browser versione 3.3 0.1, SP one e X!Tandem implementato nel software Scaffold 3.

La ricerca automatizzata nel database viene eseguita utilizzando la più recente base di conoscenze della risorsa universale di proteine. Database Swiss-Prot rilasciato da www.expasy.org dell'organismo studiato.

Il database utilizzato per il presente studio è un ceppo di coli. K12 release 57 dash 11 all'interno di Seaquest, configurato per la ricerca automatizzata nel database con una tolleranza del precursore di cinque parti per milione. Tolleranza agli ioni frammento di una unità di massa atomica e tripsina completa con specificità, consentendo fino a due scissioni mancate.

Impostare le modifiche variabili consentendo la fosforilazione della serina, della treonina e della tirosina, l'ossidazione della metionina, la deamidazione dell'asparagina e del glutammide, l'acetilazione della lisina, la formilazione della lisina e la metilazione dell'arginina, della lisina, della serina, della treonina e dell'asparagina. Non utilizzare modifiche fisse nella ricerca nel database; caricare i file DTA o SRF generati da Seaquest nel software Scaffold 3, che esegue la valutazione della probabilità degli assegnamenti dei peptidi e delle identificazioni proteiche combinando le ricerche nel database di Seaquest e X!Tandem. Scaffold è utile per confrontare, validare e visualizzare facilmente elenchi di proteine provenienti da diversi campioni.

Impostare i parametri nel software Scaffold Three in modo da accettare solo identificazioni proteiche e da riportare risultati distinti. Impostare i risultati in modo che contengano almeno un peptide discriminante che abbia superato la validazione probabilistica. Secondo l'analisi di Scaffold Three, considerare soltanto i peptidi con una probabilità maggiore o uguale al 95%, come specificato dall'algoritmo Peptide Prophet all'interno di Scaffold.

Tre software impostano le probabilità di identificazione proteica per assegnazioni multiple di peptidi a un valore maggiore o uguale al 95% secondo l'algoritmo protein prophet. Per le identificazioni proteiche basate su un singolo peptide, si imposta arbitrariamente una probabilità proteica maggiore o uguale al 50% e si ispeziona manualmente il peptide corrispondente. Le proteine i cui spettri MS/MS comprendono peptidi simili e che non possono essere differenziate sulla base dell'analisi MS/MS da sola vengono raggruppate dal software in conformità ai principi di parsimonia.

La percentuale stimata di falsi positivi nelle identificazioni dei peptidi può essere determinata utilizzando l'approccio del database proteico invertito e dovrebbe essere inferiore all'1%. Qui, l'analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE e colorazione argentica delle proteine intatte catturate è mostrata nel saggio di cattura. Dopo il passaggio di irradiazione UV, è stato aggiunto un eccesso di SAH libero per garantire che vengano isolate solo le proteine alle quali il composto di cattura è legato covalentemente tramite la funzione di fotoreattività.

Le proteine sono state identificate mediante spettrometria di massa (MS) da bande di gel proteico dopo la digestione con il Triptych Ingel. A scopo comparativo, la corsia più a sinistra mostra lo 0,25% del lisato totale di cellule intere di e coli DH five alpha da cui sono state isolate le proteine nel saggio di cattura. Questo confronto evidenzia la drastica riduzione della complessità del campione ottenuta grazie alla tecnologia dei composti di cattura.

I controlli sono stati eseguiti al centro del gel e includono il controllo di competizione del saggio. Questo controllo contiene un eccesso di SAH libero come competitore prima del passaggio di irradiazione UVI, al fine di impedire il legame delle proteine al composto di cattura SAH attraverso la funzione di selettività per SAH. Il controllo di competizione è essenziale per determinare le proteine catturate in modo non specifico che non si legano a SAH.

Pertanto, le proteine identificate nel saggio di cattura, ma non nel controllo di competizione, sono proteine leganti specifiche per SAH. È incluso anche un esperimento di pull-down senza irradiazione UV e senza aggiunta di SAH libera.

Il controllo di competizione del saggio di pull-down non viene irradiato, ma contiene SAH come competitore. Infine, il saggio combinato di cattura più pull-down viene irradiato con UV e durante il protocollo non viene aggiunto SAH libero. È evidente che la fotoincrocio aumenta il rendimento e la sensibilità dell'esperimento e che la specificità può essere facilmente verificata in esperimenti di competizione utilizzando un eccesso di SAH libero, invece di analizzare le proteine intatte catturate mediante elettroforesi SDS-PAGE.

L'intera miscela di proteine catturate può essere analizzata contemporaneamente mediante cromatografia liquida in flusso nanometrico abbinata a spettrometria di massa in tandem dopo la digestione Triptych. Questo è l'approccio reale di CCMS ed è molto più sensibile rispetto all'analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE. METILTRANSFERASI e altre proteine selezionate identificate mediante esperimenti CCMS sono riportate in questa tabella.

I numeri indicati rappresentano il conteggio spettrale peptidico non pesato per proteina; nell'assay di cattura vengono identificate molte più metiltransferasi e altre proteine leganti SAH rispetto al pull-down. La specificità per SAH è dimostrata dalla quasi completa assenza di queste proteine nel controllo di competizione. Il numero totale di proteine identificate nelle analisi CCMS e l'overlap proteico tra le analisi sono stati riportati in tabella.

Il numero di proteine identificate con almeno due peptidi è indicato tra parentesi. L'elevata riproducibilità del metodo può essere dedotta dall'alto sovrapposizione di proteine, principalmente aspecifiche, tra esperimenti confrontabili, in particolare per le proteine identificate in modo robusto con almeno due peptidi in questo caso. I diagrammi di Venn descrivono il sovrapposizione delle proteine identificate nel saggio di cattura, nel controllo di competizione e nel pull down, mentre a destra sono riportati i numeri di tutte le proteine identificate, con tra parentesi il numero di proteine identificate con almeno due peptidi; a sinistra sono indicati i numeri di metiltransferasi e della nucleasi SAH.

È stato appena mostrato come isolare e identificare metiltransferasi o altre subproteomi funzionali da lisati cellulari di e coli o da altri tessuti o lisati cellulari mediante spettrometria di massa con composti di cattura (CCMS). Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare un'esposizione prolungata del composto di cattura alla luce visibile, mantenere i campioni freddi, preparare fresca la soluzione di acetonitrile-TFA utilizzata per rilasciare le proteine catturate dalle microsferette magnetiche ed evitare contaminazioni dell'esperimento da fonti proteiche esterne, come la cheratina proveniente dalla polvere o dall'esperimentatore.

Inoltre, abbiamo scoperto che ciò dipende dalla configurazione specifica, se la configurazione fuori tempo, in cui il photo-crosslink avviene tra il composto di pre-recupero e le proteine in soluzione, oppure la configurazione attualmente descritta in tempo, dia prestazioni migliori. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.