Name: Lapplicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Impara la tecnica del dynamic clamp per applicare conduttanze NMDA in neuroni dopaminergici di ratto. Questo metodo elettrofisiologico permette di controllare con precisione l'attività neuronale in tempo reale.

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1. Fetta di preparazione <ol><li> Tagliare fettine di cervello utilizzando un microtomo vibrante. Abbiamo preparato 240 micron fette mesencefalo orizzontale da un isoflurano-anethetized ratto Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) utilizzando un microtomo vibrante (Microm HM 650V) in conformità con l'Università del Texas a cura San Antonio degli animali e del Comitato Istituzionale Usa. </li><li> Tenere le fette in una camera di incubazione fino al momento di registrare. Utilizziamo un contenitore di incubazione riscaldata a 32 ° C e riempito con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; in mm): 126 NaCl, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 destrosio, 25 NaHCO 3, 1,3 acido ascorbico, 2.4 piruvato di sodio e 0,05 glutatione. </li></ol> 2. Registrazione elettrofisiologiche <ol><li> Trasferire la sezione per l'impianto di registrazione intracellulare in cui un fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) a 35 ° C viene perfuso. Usiamo il aCSF stesso punto 1.2 eccetto che 2mM MgCl 2 è stato utilizzato e glutatione è stato omesso. Per fette orizzontalmente preparato, di solito dividono in due la fetta lungo la linea mediana. </li><li> Visualizza il neurone bersaglio. Noi visualizzati i singoli neuroni dopaminergici della substantia nigra con un sistema di imaging gradiente di contrasto. </li><li> Tirare un elettrodo con un estrattore elettronico elettrodo. Tiriamo elettrodi con una resistenza punta di 4-10 MΩ con una P97 Micropipetta estrattore (Instrument Company Sutter). </li><li> Riempire un elettrodo con la soluzione desiderata interno. Noi utilizziamo una soluzione contenente (in mm): 138 K-gluconato, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. La soluzione interna è stata regolata a pH 7,3 con KOH 1M e osmolarità di 270-275 mOsms. </li><li> Fare un sigillo gigaohm sul neurone desiderato. Rottura del sigillo con aspirazione. Si tratta di una registrazione a cellula intera. Un amplificatore Multiclamp 700B è stato utilizzato nella nostra configurazione. L'amplificatore dovrebbe poi essere posto in modalità morsetto corrente 'I = 0'. </li></ol> 3. Applicazione della conduttanza con morsetto dinamica <ol><li> RTXI (www.rtxi.org) è stato eseguito sul computer morsetto dinamico. Un modello personalizzato scritta contenente un recettore NMDA è stato caricato in memoria. La corrente da iniettare nella cella in tempo reale è calcolato dalla seguente equazione: I NMDA =-g NMDA * [1 / (1 ​​+ ([Mg] / 3.57) * e (-V m * 0,062))] * (V m - E NMDA) dove g è la conduttanza NMDA desiderata (in nS; di default impostato a 0 nS), [Mg] è la concentrazione di magnesio (impostata a 1,5 mm nel nostro esempio qui sotto), E NMDA è il potenziale di inversione per il recettore NMDA (impostato a 0 mV), e V m è il potenziale di membrana della cellula misurata dall'amplificatore (in millivolt). </li><li> L'uscita dal computer pinza dinamico è stato collegato all'ingresso di comando dell'amplificatore tramite un convertitore analogico-digitale convertitore. </li><li> L'amplificatore è stato posto in modalità morsetto corrente del 'IC'. </li><li> Inserisci il tuo conduttanza desiderato recettore NMDA in RTXI (ad esempio 40ns). Si dovrebbe vedere una raffica fasica di potenziali d'azione. In alternativa, una conduttanza può essere somministrato a RTXI tramite un'uscita analogica (Figura 1A, 'g (t)'). Un fattore di scala appropriato deve essere utilizzato entro RTXI per convertire il segnale da volt a Siemens. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Una configurazione di successo per l'applicazione di una conduttanza utilizzando il morsetto dinamica è mostrata in Figura 1A. Questa impostazione, abbiamo fatto un intero registrazione cellula somatica di un neurone dopaminergico nella substantia nigra pars compacta. Cellule dopaminergiche tipicamente fuoco spontaneamente a prezzi convenienti con un pacemaker-come il modello. Una raffica di potenziali d'azione può essere evocato mediante l'applicazione di una conduttanza fasica del recettore NMDA con morsetto dinamico (Figura 1B). <img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: applicazione di una conduttanza recettore NMDA con la tecnica della dinamica morsetto. Configurazione hardware A. illustra le connessioni tra l'impianto di registrazione intracellulare e computer morsetto dinamico. B. Una raffica di potenziali d'azione è evocata dalla applicazione di una conduttanza 40ns recettore NMDA in una registrazione da una cellula intera substantia nigra pars compacta neurone dopaminergico.

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La tecnica di bloccaggio dinamico dimostrato qui migliora la tecnica tradizionale di iniezione diretta in corso, consentendo lo sperimentatore di imitare gli effetti elettrici della attivazione di un recettore. In questo video, abbiamo dimostrato che si possono aggiungere gli effetti di attivazione di un recettore NMDA per l&#39;attività spontanea dei neuroni dopaminergici, cioè una raffica di potenziali d&#39;azione sono evocati. Grazie alla flessibilità di hardware / software di implementazione, una varietà di estensioni possono essere utilizzati. Il segno della corrente iniettata può essere commutato da negativo a positivo, che rappresenta uno scenario in cui viene rimosso gli effetti del recettore attivato da un neurone. Neuroni modello, rappresentato sotto forma di una serie di equazioni differenziali, può anche essere risolto numericamente e consentire lo sperimentatore di indagare le reti di piccole dimensioni.

<table><tbody><tr><td>K-gluconato anidro</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo-bis(B-ammino&amp;#8211;etere dietilico-N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;tetraacido acetico</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Reagente</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Reagente</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, anidro</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutatione</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX51WI (con obiettivo 40x)</td><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 convertitori A/D</td><td>Attrezzatura</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B con testa CV-7B</td><td>Attrezzatura</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipettatrice</td><td>Attrezzatura</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aghi per siringhe Microfil</td><td>Attrezzatura</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Attrezzature</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitorare</td><td>Attrezzatura</td><td>Trivista</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;applicazione di una conduttanza recettore nmda nei neuroni dopaminergici mesencefalo rat utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscienziati studiare la funzione del cervello, indagando come i neuroni nel cervello comunicano. Molti ricercatori guardare i cambiamenti nell&#39;attività elettrica di uno o più neuroni in risposta ad un ingresso controllato sperimentalmente. L&#39;attività elettrica dei neuroni possono essere registrati in fettine di cervello isolato utilizzando tecniche di patch clamp con micropipette di vetro. Tradizionalmente, gli sperimentatori possono mimare ingresso neuronale con iniezione diretta di corrente attraverso la stimolazione pipetta, elettrica delle cellule o altri collegamenti assonale nella sezione o manipolazione farmacologica di recettori situati sulla membrana della cellula neuronale registrata. Iniezione diretta di corrente ha il vantaggio di passare una forma d&#39;onda predeterminata corrente con elevata precisione temporale presso il sito della registrazione (di solito il soma). Tuttavia, non cambia la resistenza della membrana neuronale come canali ionici non sono fisicamente aperte. Iniezione di corrente impiega di solito impulsi rettangolari e quindi non modello la cinetica dei canali ionici. Infine, l&#39;iniezione di corrente non può simulare i cambiamenti chimici nella cella che si verifica con l&#39;apertura dei canali ionici. Recettori possono essere fisicamente attivata dalla stimolazione elettrica o farmacologica. Lo sperimentatore ha una buona precisione temporale di attivazione del recettore con la stimolazione elettrica della fetta. Tuttavia, vi è limitata precisione spaziale di attivazione del recettore e la natura esatta di ciò che viene attivata su stimolazione è sconosciuta. Quest&#39;ultimo problema può essere parzialmente alleviati da specifici agenti farmacologici. Purtroppo, il decorso temporale di attivazione di agenti farmacologici è di solito lenta e la precisione spaziale degli ingressi sul cellulare registrato è sconosciuta. La tecnica del clamp dinamica consente uno sperimentatore di modificare l&#39;attuale passato direttamente nella cella in base feedback in tempo reale del potenziale di membrana della cellula (Robinson e Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. Per la revisione, si veda Prinz et al. 2004). Questo permette uno sperimentatore di imitare i cambiamenti elettrici che si verificano nel sito della registrazione in risposta all&#39;attivazione di un recettore. Tempo reale i cambiamenti della corrente applicata sono determinati da una equazione matematica implementato in hardware. Abbiamo recentemente utilizzato la tecnica dinamica morsetto per indagare la generazione di raffiche di potenziali d&#39;azione per l&#39;attivazione fasica dei recettori NMDA nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010).. In questo video, dimostriamo le procedure necessarie per applicare una conduttanza recettore NMDA in un neurone dopaminergico.

In questo video ci dimostra come applicare una conduttanza in un neurone dopaminergico registrato nella configurazione cellule intere fette di cervello di ratto. Questa tecnica è chiamata la pinza dinamica.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

I neuroscienziati studiano la funzione del cervello indagando come comunicano i neuroni cerebrali. Molti ricercatori analizzano le variazioni nei...

Gli neuroscienziati studiano la funzione del cervello analizzando il modo in cui i neuroni comunicano tra loro. Qui, variazioni nell'attività elettrica di un singolo neurone vengono indotte applicando una conduttanza controllata sperimentalmente mediante la tecnica del "dynamic clamp". Inizialmente, vengono tagliate e conservate in una camera di incubazione riempita con liquido cerebrospinale artificiale delle sottili fette di cervello.Una sezione viene quindi trasferita su un apparato per la registrazione con tecnica del patch clamp. Viene selezionato un neurone e successivamente si esegue il patch con un elettrodo di registrazione utilizzando un computer con clamp dinamico collegato all'amplificatore di registrazione. Viene applicata una conduttanza dei recettori NMDA all'interno della cellula.Le registrazioni ottenute mostrano un burst di potenziali d'azione, suggerendo che l'attivazione dei recettori NMDA rappresenta un meccanismo cellulare attraverso cui i neuroni dopaminergici possono generare burst. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi attuali, come l'iniezione di corrente continua o il trattamento farmacologico, è che siamo in grado di determinare con precisione gli effetti dell'attivazione di un recettore definito sperimentalmente sull'attività elettrica di un neurone vivente. Dopo aver rapidamente estratto il cervello da un ratto Bragg dolly anestetizzato, si tagliano sezioni cerebrali orizzontali di 240 micrometri utilizzando un microtomo a vibrazione.Mentre si tagliano le sezioni, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionarle in una camera di incubazione a 32 gradi Celsius riempita con liquido cerebrospinale artificiale, fino al momento in cui si eseguiranno gli esperimenti di registrazione. L'apparato per la registrazione intracellulare è composto da un microscopio con obiettivi predisposti per l'immagine a contrasto di gradiente, un monitor, un sistema di perfusione, un amplificatore Multi Clamp 700B, un convertitore analogico-digitale, un micromanipolatore e uno stadio testa. Un computer Mac Pro esegue il software di acquisizione dati, Axo Graph X e il software Multi Clamp Commander. Accanto all'apparato per la registrazione intracellulare e al computer Mac Pro è presente un computer Sun Microsystems che esegue un sistema operativo Linux in tempo reale, insieme al suo convertitore analogico-digitale, che verrà utilizzato con la tecnica del clamp dinamico.L'apparato per la registrazione intracellulare deve perfondere un liquido cerebrospinale artificiale a circa 35 gradi Celsius. Se la sezione da registrare è stata preparata in senso orizzontale, utilizzare una pipetta per trasferirla in una capsula di Petri contenente liquido cerebrospinale artificiale e, con uno strumento da taglio, dividerla in due lungo la linea mediana. Successivamente, per effettuare le registrazioni elettrofisiologiche, utilizzare una pipetta per trasferire la sezione nell'apparato di registrazione intracellulare.Utilizzando l'obiettivo 40x, visualizzare il neurone bersaglio qui; si osserva un singolo neurone dopaminergico della substantia nigra. Notare il soma di forma ellittica con due dendriti estesi. Utilizzando un micropipettatore elettronico P 97, tirare elettrodi con una resistenza alla punta compresa tra quattro e dieci megaohm.Successivamente, utilizzando un ago per siringa microfill, riempire un elettrodo con la soluzione interna. Inserire l'elettrodo riempito nella semicella, collegata allo stadio principale dell'amplificatore, usando una siringa collegata alla semicella mediante un breve tratto di tubo. Applicare una piccola quantità di pressione positiva sull'elettrodo di registrazione.Sotto guida visiva, abbassare l'elettrodo sul neurone bersaglio. Si osserverà una piccola depressione sulla superficie della cellula. Applicare una leggera pressione negativa per formare un sigillo giga sul neurone desiderato.Applicare aspirazione con la bocca per rompere il sigillo. Questo costituisce una registrazione in modalità whole cell. Dopo che il sigillo è stato rotto, utilizzare l'interfaccia software del multi clamp commander per impostare l'amplificatore in modalità current clamp, nella quale non può essere iniettata alcuna corrente.Per applicare una conduttanza NMDA a questa cellula, iniziare eseguendo il software RTXI sul computer del clamp dinamico. Quindi caricare in memoria un modello appositamente scritto contenente un recettore NMDA. Una volta che il modello è stato caricato in memoria da RTXI, calcolerò in tempo reale la corrente da iniettare nella cellula utilizzando l'equazione mostrata qui, in cui G-N-M-D-A è la conduttanza desiderata in nanosiemens, impostata a zero nanosiemens.Per impostazione predefinita, MG indica la concentrazione di magnesio. E-N-M-D-A è il potenziale di inversione per il recettore NMDA, impostato a zero millivolt, e VM è il potenziale di membrana della cellula misurato dall'amplificatore in millivolt. Ora, utilizzando un cavo BNC standard, collegare l'uscita del computer del clampaggio dinamico all'ingresso di comando dell'amplificatore mediante un convertitore da analogico a digitale.Posizionare l'amplificatore in modalità standard di clampaggio della corrente ic utilizzando l'interfaccia software Multi Clamp Commander. RTXI è stato configurato per ricevere la conduttanza desiderata GFT sotto forma di segnale di tensione proveniente dal software di acquisizione dati Axo Graph X. Qui eseguiamo un semplice protocollo AXO Graph X in cui viene applicata alla cellula una variazione di conduttanza di 40 nano Siemens della durata di un secondo.Un burst di potenziali d'azione viene evocato in risposta al passo di conduttanza utilizzando il setup descritto in questo video; è stata effettuata una registrazione somatica in intera cellula da un neurone dopaminergico nella substantia nigra pars compacta. Le cellule dopaminergiche tipicamente si attivano spontaneamente a basse frequenze con un pattern simile a un pacemaker. Un burst di potenziali d'azione può essere evocato mediante applicazione fasica di una conduttanza del recettore NMDA tramite clamp dinamico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare una conduttanza NMDA in un neurone dopaminergico vivente all'interno di una sezione cerebrale isolata. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula che possa essere registrata mediante tecniche elettrofisiologiche standard. Analogamente, il dynamic clamp può essere esteso per imitare gli effetti elettrici di un'ampia gamma di tipi recettoriali.Speriamo che questo video si sia rivelato utile per illustrare in cosa consiste la tecnica del "dynamic clamp" e come la utilizziamo nel nostro laboratorio. Grazie per averlo guardato.

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