L'applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Gli neuroscienziati studiano la funzione del cervello analizzando il modo in cui i neuroni comunicano tra loro. Qui, variazioni nell'attività elettrica di un singolo neurone vengono indotte applicando una conduttanza controllata sperimentalmente mediante la tecnica del "dynamic clamp". Inizialmente, vengono tagliate e conservate in una camera di incubazione riempita con liquido cerebrospinale artificiale delle sottili fette di cervello.

Una sezione viene quindi trasferita su un apparato per la registrazione con tecnica del patch clamp. Viene selezionato un neurone e successivamente si esegue il patch con un elettrodo di registrazione utilizzando un computer con clamp dinamico collegato all'amplificatore di registrazione. Viene applicata una conduttanza dei recettori NMDA all'interno della cellula.

Le registrazioni ottenute mostrano un burst di potenziali d'azione, suggerendo che l'attivazione dei recettori NMDA rappresenta un meccanismo cellulare attraverso cui i neuroni dopaminergici possono generare burst. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi attuali, come l'iniezione di corrente continua o il trattamento farmacologico, è che siamo in grado di determinare con precisione gli effetti dell'attivazione di un recettore definito sperimentalmente sull'attività elettrica di un neurone vivente. Dopo aver rapidamente estratto il cervello da un ratto Bragg dolly anestetizzato, si tagliano sezioni cerebrali orizzontali di 240 micrometri utilizzando un microtomo a vibrazione.

Mentre si tagliano le sezioni, utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionarle in una camera di incubazione a 32 gradi Celsius riempita con liquido cerebrospinale artificiale, fino al momento in cui si eseguiranno gli esperimenti di registrazione. L'apparato per la registrazione intracellulare è composto da un microscopio con obiettivi predisposti per l'immagine a contrasto di gradiente, un monitor, un sistema di perfusione, un amplificatore Multi Clamp 700B, un convertitore analogico-digitale, un micromanipolatore e uno stadio testa. Un computer Mac Pro esegue il software di acquisizione dati, Axo Graph X e il software Multi Clamp Commander. Accanto all'apparato per la registrazione intracellulare e al computer Mac Pro è presente un computer Sun Microsystems che esegue un sistema operativo Linux in tempo reale, insieme al suo convertitore analogico-digitale, che verrà utilizzato con la tecnica del clamp dinamico.

L'apparato per la registrazione intracellulare deve perfondere un liquido cerebrospinale artificiale a circa 35 gradi Celsius. Se la sezione da registrare è stata preparata in senso orizzontale, utilizzare una pipetta per trasferirla in una capsula di Petri contenente liquido cerebrospinale artificiale e, con uno strumento da taglio, dividerla in due lungo la linea mediana. Successivamente, per effettuare le registrazioni elettrofisiologiche, utilizzare una pipetta per trasferire la sezione nell'apparato di registrazione intracellulare.

Utilizzando l'obiettivo 40x, visualizzare il neurone bersaglio qui; si osserva un singolo neurone dopaminergico della substantia nigra. Notare il soma di forma ellittica con due dendriti estesi. Utilizzando un micropipettatore elettronico P 97, tirare elettrodi con una resistenza alla punta compresa tra quattro e dieci megaohm.

Successivamente, utilizzando un ago per siringa microfill, riempire un elettrodo con la soluzione interna. Inserire l'elettrodo riempito nella semicella, collegata allo stadio principale dell'amplificatore, usando una siringa collegata alla semicella mediante un breve tratto di tubo. Applicare una piccola quantità di pressione positiva sull'elettrodo di registrazione.

Sotto guida visiva, abbassare l'elettrodo sul neurone bersaglio. Si osserverà una piccola depressione sulla superficie della cellula. Applicare una leggera pressione negativa per formare un sigillo giga sul neurone desiderato.

Applicare aspirazione con la bocca per rompere il sigillo. Questo costituisce una registrazione in modalità whole cell. Dopo che il sigillo è stato rotto, utilizzare l'interfaccia software del multi clamp commander per impostare l'amplificatore in modalità current clamp, nella quale non può essere iniettata alcuna corrente.

Per applicare una conduttanza NMDA a questa cellula, iniziare eseguendo il software RTXI sul computer del clamp dinamico. Quindi caricare in memoria un modello appositamente scritto contenente un recettore NMDA. Una volta che il modello è stato caricato in memoria da RTXI, calcolerò in tempo reale la corrente da iniettare nella cellula utilizzando l'equazione mostrata qui, in cui G-N-M-D-A è la conduttanza desiderata in nanosiemens, impostata a zero nanosiemens.

Per impostazione predefinita, MG indica la concentrazione di magnesio. E-N-M-D-A è il potenziale di inversione per il recettore NMDA, impostato a zero millivolt, e VM è il potenziale di membrana della cellula misurato dall'amplificatore in millivolt. Ora, utilizzando un cavo BNC standard, collegare l'uscita del computer del clampaggio dinamico all'ingresso di comando dell'amplificatore mediante un convertitore da analogico a digitale.

Posizionare l'amplificatore in modalità standard di clampaggio della corrente ic utilizzando l'interfaccia software Multi Clamp Commander. RTXI è stato configurato per ricevere la conduttanza desiderata GFT sotto forma di segnale di tensione proveniente dal software di acquisizione dati Axo Graph X. Qui eseguiamo un semplice protocollo AXO Graph X in cui viene applicata alla cellula una variazione di conduttanza di 40 nano Siemens della durata di un secondo.

Un burst di potenziali d'azione viene evocato in risposta al passo di conduttanza utilizzando il setup descritto in questo video; è stata effettuata una registrazione somatica in intera cellula da un neurone dopaminergico nella substantia nigra pars compacta. Le cellule dopaminergiche tipicamente si attivano spontaneamente a basse frequenze con un pattern simile a un pacemaker. Un burst di potenziali d'azione può essere evocato mediante applicazione fasica di una conduttanza del recettore NMDA tramite clamp dinamico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare una conduttanza NMDA in un neurone dopaminergico vivente all'interno di una sezione cerebrale isolata. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula che possa essere registrata mediante tecniche elettrofisiologiche standard. Analogamente, il dynamic clamp può essere esteso per imitare gli effetti elettrici di un'ampia gamma di tipi recettoriali.

Speriamo che questo video si sia rivelato utile per illustrare in cosa consiste la tecnica del "dynamic clamp" e come la utilizziamo nel nostro laboratorio. Grazie per averlo guardato.