Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di verificare se una particolare variante del DNA, come quella associata alla malattia, ha un effetto sull'espressione di un particolare gene. Ciò si ottiene selezionando linee cellulari eterozigoti sia per questa variante che per uno snip codificante nel gene di interesse. In una seconda fase, il DNA e l'RNA vengono estratti dalle cellule e quindi utilizzati come modello per una reazione di estensione primaria specifica dell'allele.

Successivamente, i prodotti di estensione primaria vengono analizzati mediante spettrometria di massa al fine di quantificare l'abbondanza relativa dei due alleli. Si ottengono risultati che mostrano se la variante originale del DNA associata a una malattia è anche associata a una differenza nell'espressione genica basata su misurazioni quantitative specifiche dell'allele mediante spettrometria di massa. I principali vantaggi di questa tecnica sono che, a differenza di un test genico riportato con luciferasi, non richiede manipolazione molecolare e misura i livelli endogeni di espressione genica.

Inoltre, siamo in grado di confrontare i livelli di espressione tra i due alleli in modo controllato internamente, il che rimuove parte della variabilità sperimentale. Questo metodo ci aiuta a rispondere a domande chiave nel campo della genetica umana, come i meccanismi molecolari alla base delle associazioni genetiche. Abbiamo impostato per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo identificato l'associazione genetica che abbraccia tre geni e non siamo riusciti a perfezionare un segnale per uno solo.

Da un'ulteriore mappatura genetica. Le cellule utilizzate per questo test devono esprimere il gene di interesse e soddisfare due requisiti genotipici fondamentali. Devono essere eterozigoti sia per le sequenze di DNA associate alla malattia che per i marcatori del DNA, che possono distinguere i trascritti in base alla loro origine cromosomica Nella strategia di selezione della linea cellulare mostrata qui, le linee cellulari A e B, A eterozigoti per un marcatore codificante trascritto rappresentato da triangoli.

Tuttavia, la linea A di Omnicell è eterozigote per la sequenza di DNA associata alla malattia chiamata variante del DNA di rischio rappresentata dai cerchi. L'allele blu della variante di rischio è associato a un livello inferiore di trascrizione Dopo aver selezionato la coltura della linea cellulare, le cellule in un pallone secondo le specifiche del fornitore, utilizzeremo i fibroblasti in questa dimostrazione. Sebbene questo test sia ugualmente applicabile ad altri tipi di cellule, comprese le cellule primarie, preparare due piastre di Petri da 10 centimetri rispettivamente per l'estrazione di DNA e RNA.

Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, possono essere raccolte per l'estrazione di DNA e RNA utilizzando metodi standard, inclusi kit disponibili in commercio appropriati al tipo di cellula selezionato. Prima di eseguire questo test, ho progettato due coppie di primer PCR per ciascun marcatore di DNA, una coppia per l'amplificazione del DNA genomico e l'altra per l'amplificazione del CDNA, posiziona i primer in avanti e all'indietro per l'amplificazione del CDNA in diversi esoni per evitare la contaminazione genomica, progetta i primer per ottenere un prodotto PCR nell'intervallo da 100 a 500 paia di basi di lunghezza per ciascuna linea cellulare, prepara reazioni PCR da otto microlitri. Quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del DNA genomico e quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del CDNA ogni volta.

Il micro correlato alla reazione PCR contiene il tack dn di MLA, i primer NTP, il cloruro di magnesio e il DNA genomico o il CD NA. Eseguire le reazioni PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer, mantenendo il numero di ciclo nella fase lineare di amplificazione. Una volta completate le reazioni della PCR. Rimuovere i primer PCR e l'eccesso di DN TPS aggiungendo esonucleasi uno e fosfatasi alcalina SAP di gamberetti a ciascun prodotto PCR e incubando a 37 gradi Celsius per 20 minuti, seguiti da 15 minuti a 85 gradi Celsius.

Posizionare ogni prodotto PCR due volte su una piastra da 384 pozzetti, in modo da avere a disposizione otto misurazioni per ogni campione. 16 punti in totale per il test di estensione primaria. Progettare il primer di estensione con il software di progettazione del saggio in modo che lo stesso primer possa essere utilizzato sia per i prodotti genomici che per i prodotti C-D-N-A-P-C-R.

Specificare la lunghezza dell'innesco nell'intervallo da 14 a 18 coppie di basi. Eseguire la reazione di estensione primaria con la miscela appropriata di tre terminatori desossinucleotidici e un desossinucleotide. Una tipica reazione di estensione primaria include un passaggio iniziale a 94 gradi Celsius per due minuti, seguito da 40 cicli di 94 gradi Celsius per cinque secondi, 52 gradi Celsius per cinque secondi e 72 gradi Celsius per cinque secondi.

Infine, gli oligonucleotidi estesi vengono quantificati mediante spettrometria di massa a tempo di volo a ionizzazione con desorbimento laser assistito da matrice utilizzando uno spettrometro di massa con lettore di spettrometri. Un punto chiave di questo protocollo è l'utilizzo di diverse strategie per controllare il rumore sperimentale per l'implementazione di artefatti. È davvero importante ripetere l'esperimento almeno tre volte.

Il miglior controllo per l'esperimento consiste nell'utilizzare una linea cellulare eterozigote per il saggio di taglio del rivestimento per l'estensione primaria, ma che non porta l'allele associato alla malattia. Inoltre, progetta saggi per marcatori codificanti trascritti di DNA alternativi. Se questi non sono disponibili, un ulteriore controllo può essere fornito da coppie di primer PCR alternativi che mirano a diversi esoni per il test di estensione primaria.

Un controllo interno può essere fornito dalla progettazione di primer di estensione e dall'inginocchiamento sia in avanti che all'indietro. Un esempio di analisi dell'espressione allelica specifica è mostrato qui con esempi di tracce di spettrometria di massa. Questa figura mostra i risultati dell'analisi di quattro prodotti di estensione primaria specifici per l'allele effettuata su quattro diversi modelli.

I primi due grafici rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del DNA genomico di due diverse linee cellulari, entrambe eterozigoti per un polimorfismo codificante trascritto. Tuttavia, solo la linea cellulare A è eterozigote per il rischio di varianza del DNA. Questi due grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del CDNA generato dalle stesse linee cellulari a seguito di artefatti sperimentali.

Il primo picco è sempre superiore al secondo, anche nell'analisi genomica. Pertanto, i risultati dell'analisi genomica vengono utilizzati per normalizzare i dati del CDNA. L'analisi statistica viene condotta estraendo tutti i rapporti di tipizzazione ELO all'interno del software di tipo mass array.

Questo rapporto fornisce dati sull'area del picco e mostriamo qui un esempio relativo a due linee cellulari, la cellula A e la cellula B eterozigoti per uno snip codificante, ma dove solo la cellula A è eterozigote per un marcatore associato alla malattia. Le colonne di legno di posa in grigio sono generate direttamente dal software mentre le colonne di legno di posa in verde sono derivate manualmente per ogni cella. Ci sono otto misurazioni sia per il CDNA che per il DNA genomico.

Il software calcolerà l'area sotto ogni picco dello spettro, che rappresenta l'abbondanza di ciascuno dei due alleli. Il rapporto allele viene calcolato dividendo l'area dell'allele uno per l'area dell'allele due per ciascun campione CDNA e genomico. Un errore medio e standard vengono calcolati tra le otto misurazioni.

Un errore standard elevato superiore a 0,1 indica che le misurazioni non sono coerenti e devono essere ignorate. Infine, il rapporto medio del CDNA viene normalizzato utilizzando il rapporto medio del DNA genomico per stimare la deviazione da un rapporto di uno, che è prevista quando non vi è alcuna differenza nell'espressione specifica dell'allele. Il rapporto normalizzato è diverso da quello della cellula A, ma vicino a quello della cellula B, i dati suggeriscono che la linea cellulare A porta una variante del DNA in fase con l'allele misurato dal secondo picco, che riduce l'espressione del gene in analisi.

La linea cellulare B fornisce un controllo negativo molto conveniente. Durante il tentativo di questa procedura è molto importante definire varianti genetiche informative e definire controlli sperimentali appropriati Seguendo questa procedura. Altri metodi possono essere utilizzati come l'aplotipo, l'immunoprecipitazione specifica della cromatina, che ti aiutano a rispondere a domande come dove ci sono varianti genetiche per le quali non ci sono marcatori trascritti da utilizzare per analizzare l'espressione genica specifica dell'allele.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'RNA in un modo specifico per l'allele e come usarlo per comprendere varianti funzionali geneticamente importanti.