Name: Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Scopri un saggio di espressione genica allele-specifica per testare la base funzionale delle associazioni genetiche utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. Questo metodo quantifica con precisione i livelli di espressione endogena senza manipolazione molecolare.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust attraverso sovvenzioni a APM [076566/Z/05/Z], JCK [074318] e un premio di base per il Wellcome Trust Centre for Human Genetics [075491/Z/04].

1) Colture Cellulari <ol><li> Selezionare i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse. </li><li> Selezionare linee cellulari eterozigoti sia per le varianti di rischio e trascritto polimorfismo del DNA codifica all'interno del gene di interesse (Figura 1). </li><li> Cultura le linee cellulari selezionate in base alle specifiche del fornitore e preparare 2 x 10 cm capsule di Petri per l'estrazione del DNA e RNA, rispettivamente. </li><li> Quando le cellule raggiungono l'80% confluenza avviare la procedura per le cellule raccolti ed isolare il DNA e l'RNA sia seguendo la procedura descritta di seguito o con i kit disponibili in commercio. </li></ol> 2) Estrazione del DNA <ol><li> Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS e aggiungere al piatto 500 microlitri di una soluzione di lisi (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA e 50 mg / ml RNasi A). </li><li> Roccia delicatamente la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raschiare il lisato di cellule in una provetta ed incubare a 37 ° C durante la notte. </li><li> Aggiungi proteinasi K alla concentrazione finale di 100 mg / ml ed incubare a 37 ° C durante la notte. </li><li> Estrarre il DNA con un uguale volume di fenolo-cloroformio pH 8, ripeto, quindi estrarre con un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico. </li><li> Precipitare il DNA con 1 / 10 ° volume 3 M di NaCl e 2,5 volumi di etanolo 100%. </li><li> Lasciare in ghiaccio per 5 minuti e poi girare a 13.000 giri per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare il DNA con etanolo al 70%, permette di asciugare all'aria e risospendere in 200 ml di TE. </li><li> Incubare a 65 ° C per 10 min e poi lasciare per 2 giorni a temperatura ambiente. </li><li> Conservare a 4 ° C o lungo termine a -20 ° C. </li></ol> 3) estrazione RNA <ol><li> Rimuovere il supporto dal piatto, lavare con PBS, aggiungere 1 ml di TRIzol e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Raschiare le cellule, pipetta poche volte, trasferire in una provetta e incubare per 5 minuti. </li><li> Spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 200 ml di cloroformio. </li><li> Agitare e spin per 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere un uguale volume di etanolo al 70%. </li><li> Caricare la soluzione a 1 o 2 (a seconda del volume) colonna RNeasy e spin per 30 secondi alla massima velocità. </li><li> Da qui seguire le istruzioni del kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Nucleic Acid preparazione dei campioni <ol><li> Quantificare il DNA e la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Preparare cDNA da 500-1000 ng di RNA utilizzando decamers casuale e SuperScript III della trascrittasi inversa (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5) Estensione di analisi PCR e Primer <ol><li> Progettazione di due coppie di primers PCR per ogni marcatore del DNA, un paio per l'amplificazione del DNA genomico e l'altra coppia per l'amplificazione del DNA (Fig. 2). Luogo in avanti e indietro primer per l'amplificazione del DNA negli esoni diversi per evitare la contaminazione genomico. Progettazione primer per ottenere un prodotto di PCR nel range di 100-500 bp lunghezza. </li><li> Preparare una reazione da 10 microlitri di PCR compresi 0,5 U Immolase Taq (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M ogni primer e 20 ng di entrambi i cDNA o DNA. Amplificare ogni campione in quattro reazioni indipendenti. </li><li> Eseguire la reazione PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer tenendo numero di ciclo in fase lineare di amplificazione. </li><li> Togliere di PCR e dNTPs in eccesso tramite l'incubazione del prodotto di PCR con esonucleasi I e fosfatasi alcalina gamberetti (SAP) a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Spot ogni prodotto di PCR due volte su una piastra da 384 pozzetti, in modo che 8 misure saranno disponibili per ogni campione. </li><li> Progettare il fondo interno con il saggio Design (Sequenom) il software in modo che il fondo stesso può essere utilizzato per prodotti di PCR sia genomico e cDNA. Specificare la lunghezza fondo nel range di 14-18 bp e mescolare estensione anche combinazioni di 3ddNTPs (Fig. 2). </li><li> Effettuare la reazione di estensione primer e analisi MALDI-TOF/MS utilizzando il sistema MassARRAY (Sequenom) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Una tipica reazione di primer extension includono un passo a partire da 94 ° C per 2 minuti, seguita da 40 cicli di 94 ° C per 5 s, 52 ° C per 5 s e 72 ° C per 5 s. </li><li> I prodotti fondo estensione vengono puliti con resina SpectroCLEAN e trasferiti su microarray (chip) da dispenser SpectroPOINT nanolitre. </li><li> Gli oligonucleotidi estesi sono quantificati da MALDI-TOF SpectroREADER utilizzando uno spettrometro di massa. </li></ol> 6) Analisi Statistica <ol><li> Controllare i risultati MALDI-TOF/MS con il software Typer MassARRAY per la qualità generale di questo esperimento. </li><li> Estratto della relazione Allelotyping che include i dati dell'area di picco. </li><li> Per ogni singolo spettro calcolare ilrapporto tra l'area del picco di allele 1 e allele 2 (rapporto tra le aree di picco). </li><li> Per ogni campione di cDNA derivare un picco media il rapporto tra area e deviazione standard, utilizzando la funzione corrispondente in Excel, attraverso il 8 misure. </li><li> Ricavare la stessa media il rapporto tra area del picco in tutto l'8 per tranne del DNA genomico. </li><li> Dividere il rapporto cDNA intendo per il rapporto genomica significa per valutare la deviazione per l'atteso rapporto 1:1. </li></ol> 7) Controlli sperimentali <ol><li> Per escludere artefatti sperimentali, ripetere l'esperimento, almeno tre volte. </li><li> Quando possibile, i test per i marcatori del DNA di design aggiuntivi. </li><li> Progettazione più coppie di primer PCR e primers estensione ricottura di fili sia in avanti che in retromarcia. </li><li> Ogni volta che prova possibile in quanto negativo linee cellulari controlli che sono eterozigoti per i marcatori del DNA, ma non portano le varianti del DNA rischio associato al fenotipo (fig. 1 e fig. 3) </li></ol> 8) Risultati Rappresentante Un esempio di allele-specifica analisi di espressione è mostrata in Figura 3 con esempi di tracce di spettrometria di massa. La figura mostra i risultati delle analisi di 4 prodotti fondo allele-specifica estensione effettuato su 4 diversi modelli. I grafici in alto rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del DNA genomico di due diverse linee cellulari, che sono entrambi eterozigoti per un polimorfismo trascritto codifica. Tuttavia, solo una linea cellulare è eterozigote per la variante del DNA di rischio (Figura 1). I grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del cDNA generati dalle linee delle cellule stesse. Come risultato di artefatto sperimentale il primo picco è sempre superiore al secondo picco anche per l'analisi genomica. Pertanto, i risultati dall'analisi genomica sono utilizzati per normalizzare i dati cDNA. Dopo la normalizzazione, il rapporto allele è significativamente diverso da 1 nella linea cellulare A (dove il secondo picco appare più bassa rispetto alle altri spettri), mentre è molto vicino a 1 linea di cellule B. I dati suggeriscono che la linea cellulare A trasporta un variante del DNA, in fase con l'allele misurata dal secondo picco, che riduce l'espressione del gene in esame. Linea cellulare B offre un controllo molto comodo negativo. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Linea cellulare strategia di selezione. Linee cellulari A e B sono eterozigoti per un marker trascritto codifica (triangolo), ma solo una linea cellulare è eterozigote per la variante di rischio del DNA (cerchio). L'allele azzurro della variante di rischio è associato (o con un effetto diretto o perché in stretta correlazione con la variante attuale funzionale) con un livello inferiore di trascrizione. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Allele-specifici test primer extension. Questa figura mostrano il work-flow della procedura sperimentale effettuato per entrambi i DNA cDNA (a sinistra) e genomica (a destra) i modelli. Primer PCR (rettangoli grigi) sono progettati per amplificare un polimorfismo eterozigote codifica (triangolo). Per evitare la contaminazione genomica primer PCR temprare sequenze collocati in differenti esoni (luce barre blu) quando l'amplificazione è effettuata su modello di cDNA. Il prodotto PCR viene quindi utilizzato come modello per una reazione di primer extension realizzato con un primer di estensione, ricottura una base vicino al polimorfismo, e il mix appropriato di tre dideoxynucleotide (ddNTPs) terminatori (quadrati) e uno desossinucleotidi (cerchio) per estendere l'innesco di uno o due basi, rispettivamente. La risultante prodotti primer extension hanno masse diverse, che permettono la separazione e quantificazione mediante MALDI-TOF spettrometria di massa. La quantità di prodotto corrispondente alla allele azzurro del marcatore del DNA è relativamente più basso per l'allele rosso. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. I risultati di un allele-specifici test di espressione. La figura mostrano i risultati di spettrometria di massa dall'analisi effettuata sul DNA genomico e cDNA di linea cellulare delle cellule A e linea B (Figura 1).

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
<li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo consente di valutare l&#39;effetto della malattia associata a varianti del DNA sull&#39;espressione genica attraverso la valutazione in vivo allele-specifica differenza nel livello di trascrizione. In questo protocollo abbondanza relativa trascrizione si misura con MALDI-TOF, ma altre tecnologie consentono la quantificazione allele-specifici, come TaqMan 6,7, può essere utilizzato. Il limite maggiore di questo approccio è la disponibilità di marcatori trascritto codifica. Metodi basati sul principio descritto qui, ma approfittando di diverse classi di polimorfismi, sono stati descritti. Il test haploChip misure allele-specifica espressione utilizzando marcatori situati entro 1 kb di inizio della trascrizione o sito fine di un gene che sarebbe presente in una materia cromatina immunoprecipitato isolato con anticorpi specifici per l&#39;RNA polimerasi II 8. In alternativa, SNPs intronico può essere utilizzato quando il modello viene eteronucleari RNA 9. Il protocollo specifico qui descritto, in combinazione con il test haploChip, è stato utilizzato con successo per identificare un gene candidato per la dislessia (o difficoltà di lettura). Inizialmente uno studio di associazione genetica identificata una sequenza di DNA associata a dislessia e che si estendono su tre geni 10. L&#39;allele-specifici test di espressione genica ha dimostrato che in presenza di dislessia, di DNA associati espressione varianti variazione è stata osservata solo per uno dei tre geni, ma non gli altri due 11.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo: cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>Etilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>Esosonucleasi 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina di gambero</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>Resina SpectroCLEAN</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Miscela ddNTP/dNTP MassEXTEND</td><td>Sequenom</td><td></td><td>Varia in base alla progettazione del saggio</td></tr><tr><td>Termosequenasi MassEXTEND</td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispenser nanolitri SpectroPOINT</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa SpectroREADER</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle associazioni di genetica

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Il numero di importanti associazioni di genetica comune con tratti complessi è in costante aumento. Tuttavia, la maggior parte di queste associazioni non sono stati compresi a livello molecolare. Uno dei meccanismi che mediano l&#39;effetto di varianti del DNA sui fenotipi è l&#39;espressione genica, che ha dimostrato di essere particolarmente rilevante per i tratti complessi 1. Questo metodo verifica in un contesto cellulare l&#39;effetto di specifiche sequenze di DNA sull&#39;espressione genica. Il principio è quello di misurare l&#39;abbondanza relativa di trascrizioni derivanti dai due alleli di un gene, analizzando le cellule che portano una sola copia delle sequenze di DNA associate con la malattia (le varianti di rischio) 2,3. Pertanto, le cellule utilizzati per questo metodo dovrebbe rispondere a due requisiti fondamentali genotipica: devono essere eterozigote sia per le varianti del DNA e rischio di marcatori del DNA, polimorfismi di solito codifica, che possono distinguere trascrizioni base alla loro origine cromosomica (Figura 1). Varianti del DNA e rischio marcatori del DNA non c&#39;è bisogno di avere la stessa frequenza degli alleli, ma la fase (haplotypic) rapporto di marcatori genetici ha bisogno di essere compreso. E &#39;anche importante scegliere i tipi di cellule che esprimono il gene di interesse. Questo protocollo fa esplicito riferimento alla procedura adottata per l&#39;estrazione degli acidi nucleici da fibroblasti ma il metodo è ugualmente applicabile ad altri tipi di cellule, tra cui le cellule primarie. DNA e RNA sono estratti dalle linee cellulari selezionate e cDNA viene generato. DNA e cDNA vengono analizzati con un test primer extension, creato per identificare i marcatori del DNA codificante 4. Il test primer extension viene effettuata utilizzando la (Sequenom) MassARRAY 5 piattaforma secondo le specifiche del produttore. Prodotti primer extension vengono poi analizzati da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS). Perché gli indicatori selezionati sono eterozigoti che genererà due picchi sui profili MS. L&#39;area di ogni picco è proporzionale alla ricchezza trascrizione e può essere misurata con una funzione del software Typer MassARRAY per generare un rapporto allelica (allele 1: allele 2) calcolo. Il rapporto alleliche ottenute per cDNA è normalizzato con quello misurato dal DNA genomico, dove è atteso il rapporto allelica da 1:1 a correggere artefatti tecnici. Marcatori con un rapporto normalizzato alleliche significativamente diverso da 1 indicano che la quantità di trascrizione generato dai due cromosomi nella stessa cella è diversa, suggerendo che le varianti del DNA associate con il fenotipo hanno un effetto sull&#39;espressione genica. Controlli sperimentali dovrebbe essere usato per confermare i risultati.

Associazioni di genetica spesso rimangono inspiegabili a livello funzionale. Questo metodo si propone di valutare l&#39;effetto del fenotipo-marcatori genetici associati sull&#39;espressione genica analizzando cellule eterozigoti per SNP trascritte. La tecnologia permette la misura precisa di MALDI-TOF spettrometria di massa per quantificare allele-specifici prodotti primer extension.

Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

Il numero di associazioni genetiche significative con tratti complessi comuni è in costante aumento. Tuttavia, la maggior parte di queste associazioni non è stata...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare se una particolare variante del DNA, come ad esempio una associata a una malattia, ha un effetto sull'espressione di un particolare gene. Questo viene ottenuto selezionando linee cellulari eterozigoti sia per questa variante sia per una mutazione puntiforme nel gene di interesse. Come secondo passaggio, il DNA e l'RNA vengono estratti dalle cellule e successivamente utilizzati come stampo per una reazione di estensione primaria specifica per allele.I prodotti principali dell'estensione vengono analizzati mediante spettrometria di massa al fine di quantificare l'abbondanza relativa dei due alleli. I risultati ottenuti mostrano se la variante del DNA originale associata a una malattia è anche associata a una differenza nell'espressione genica, basata su misurazioni quantitative specifiche per alleli effettuate mediante spettrometria di massa. I principali vantaggi di questa tecnica sono che, a differenza del saggio genico con reporter luciferasi, non richiede manipolazioni molecolari e misura i livelli endogeni di espressione genica.Inoltre, siamo in grado di confrontare i livelli di espressione tra i due alleli in modo internamente controllato, eliminando così parte della variabilità sperimentale. Questo metodo ci aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica umana, come i meccanismi molecolari alla base delle associazioni genetiche. Abbiamo formulato per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo identificato un'associazione genetica che interessava tre geni, senza riuscire a precisare il segnale su uno singolo.Mediante un'ulteriore mappatura genetica. Le cellule utilizzate per questo saggio devono esprimere il gene di interesse e soddisfare due requisiti genotipici fondamentali. Devono essere eterozigoti sia per le sequenze di DNA associate alla malattia sia per i marcatori del DNA, che possono distinguere i trascritti in base alla loro origine cromosomica. Nella strategia di selezione delle linee cellulari qui mostrata, le linee cellulari A e B sono eterozigoti per un marcatore codificante trascritto, rappresentato dai triangoli.Tuttavia, la linea Omnicell A è eterozigote per la sequenza di DNA associata a una malattia, chiamata variante di rischio rappresentata dai cerchi. L'allele blu della variante di rischio è associato a un livello inferiore di trascrizione. Dopo aver selezionato la coltura della linea cellulare, coltivando le cellule in un flacone secondo le specifiche del fornitore, utilizzeremo fibroblasti in questa dimostrazione. Sebbene questo saggio sia ugualmente applicabile ad altri tipi cellulari, inclusi le cellule primarie, preparare due piastre di Petri da 10 centimetri rispettivamente per le estrazioni di DNA e RNA.Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%, possono essere raccolte per estrazioni di DNA e RNA utilizzando metodi standard, inclusi kit disponibili in commercio, appropriati per il tipo di cellula selezionato. Prima di eseguire questo saggio, progettare due coppie di primer PCR per ogni marcatore del DNA, una coppia per l'amplificazione del DNA genomico e l'altra per l'amplificazione del cDNA; posizionare i primer forward e reverse per l'amplificazione del cDNA in esoni diversi per evitare contaminazioni genomiche; progettare i primer in modo da ottenere un prodotto PCR compreso tra 100 e 500 paia di basi di lunghezza per ciascuna linea cellulare; preparare otto reazioni microlitro di PCR: quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del DNA genomico e quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del cDNA ogni volta.La miscela relativa alla reazione PCR contiene il tampone MLA, dNTP, primer, cloruro di magnesio e, in alternativa, DNA genomico o cDNA. Eseguire le reazioni PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer, mantenendo il numero di cicli nella fase lineare dell'amplificazione. Al termine delle reazioni PCR, rimuovere i primer e i dNTP in eccesso aggiungendo esonucleasi I e fosfatasi alcalina da gambero (SAP) a ciascun prodotto PCR e incubando a 37 gradi Celsius per 20 minuti, seguiti da 15 minuti a 85 gradi Celsius.Applicare ciascun prodotto PCR due volte su una piastra a 384 pozzetti, in modo da ottenere otto misurazioni per ogni campione. In totale 16 applicazioni per il saggio di estensione primario. Progettare il primer di estensione mediante il software di progettazione del saggio, in modo che lo stesso primer possa essere utilizzato sia per i prodotti genomici che per quelli di C-D-N-A-P-C-R.Specificare una lunghezza dei primer compresa tra 14 e 18 paia di basi. Eseguire la reazione di estensione primaria con una miscela appropriata di tre terminatori deossinucleotidici e un deossinucleotide. Una tipica reazione di estensione primaria include un passaggio iniziale a 94 gradi Celsius per due minuti, seguito da 40 cicli di 94 gradi Celsius per cinque secondi, 52 gradi Celsius per cinque secondi e 72 gradi Celsius per cinque secondi.Infine, gli oligonucleotidi estesi vengono quantificati mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice e tempo di volo, utilizzando uno spettrometro di massa spectro reader. Un punto chiave di questo protocollo è l'uso di diverse strategie per controllare il rumore sperimentale ed eliminare gli artefatti. È molto importante ripetere l'esperimento almeno tre volte.Il miglior controllo per l'esperimento consiste nell'utilizzare una linea cellulare eterozigote per il saggio di rivestimento snip per l'estensione primaria, ma che non porti l'allele associato alla malattia. Inoltre, progettare saggi per marcatori codificanti alternativi trascritti dal DNA. Se questi non sono disponibili, un controllo aggiuntivo può essere fornito da coppie alternative di primer PCR che bersagliano esoni diversi per il saggio di estensione primaria.Un controllo interno può essere ottenuto progettando primer di allungamento in grado di ibridarsi sia al filamento diretto che a quello inverso. Qui viene mostrato un esempio di analisi dell'espressione allele-specifica, insieme a esempi di tracce di spettrometria di massa. Questa figura illustra i risultati dell'analisi di quattro prodotti primari di estensione allele-specifici eseguiti su quattro template diversi.I due grafici superiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del DNA genomico di due linee cellulari diverse, entrambe eterozigoti per un polimorfismo codificante trascritto. Tuttavia, solo la linea cellulare A è eterozigote per la varianza del DNA a rischio. Questi due grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del cDNA generato dalle stesse linee cellulari a causa di un artefatto sperimentale.Il primo picco è sempre più alto del secondo picco, anche nell'analisi genomica. Pertanto, i risultati dell'analisi genomica vengono utilizzati per normalizzare i dati del CDNA. L'analisi statistica viene condotta estraendo il rapporto completo di tipizzazione ELO all'interno del software di tipo mass array.Questo rapporto fornisce dati relativi all'area del picco, e qui mostriamo un esempio relativo a due linee cellulari, la cellula A e la cellula B eterozigoti per una snip codificante, ma in cui solo la cellula A è eterozigote per un marcatore associato a una malattia. Le colonne in grigio sono generate direttamente dal software, mentre le colonne in verde sono calcolate manualmente per ogni cellula. Sono presenti otto misurazioni sia per il cDNA che per il DNA genomico.Il software calcolerà l'area sottostante ciascun picco dello spettro, che rappresenta l'abbondanza di ciascuno dei due alleli. Il rapporto tra gli alleli viene calcolato dividendo l'area del primo allele per l'area del secondo allele per ciascun campione di cDNA e genomico. Viene calcolata una media e un errore standard su tutte e otto le misurazioni.Un elevato errore standard superiore a 0,1 indica che le misurazioni non sono coerenti e devono essere scartate. Infine, il rapporto medio del cDNA viene normalizzato utilizzando il rapporto medio del DNA genomico per stimare la deviazione da un rapporto pari a uno, valore atteso in assenza di differenze nell'espressione allele-specifica. Il rapporto normalizzato è diverso da uno nella cellula A, ma vicino a uno nella cellula B; questi dati suggeriscono che la linea cellulare A presenta una variante del DNA in fase con l'allele misurato dal secondo picco, la quale riduce l'espressione del gene in analisi.La linea cellulare B fornisce un controllo negativo molto pratico. È davvero importante definire varianti genetiche informative e stabilire controlli sperimentali appropriati durante il tentativo di questa procedura. A seguito di questa procedura, possono essere utilizzati altri metodi come l'immunoprecipitazione della cromatina specifica per l'aplotipo, che aiutano a rispondere a domande quali la presenza di varianti genetiche per le quali non esistono marcatori trascritti da utilizzare per analizzare l'espressione genica specifica per allele.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come analizzare l'RNA in modo specifico per allele e su come utilizzare questa metodica per comprendere varianti funzionali geneticamente importanti.

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