Una allele-specifica espressione genica saggio per testare la base funzionale delle Associazioni di genetica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare se una particolare variante del DNA, come ad esempio una associata a una malattia, influisce sull'espressione di un determinato gene. Questo viene ottenuto selezionando linee cellulari eterozigoti sia per questa variante sia per una mutazione puntiforme nel gene di interesse. Come secondo passaggio, il DNA e l'RNA vengono estratti dalle cellule e successivamente utilizzati come stampo per una reazione di estensione primaria specifica per allele.

I prodotti principali dell'estensione vengono analizzati mediante spettrometria di massa al fine di quantificare l'abbondanza relativa dei due alleli. I risultati ottenuti mostrano se la variante del DNA originale associata a una malattia è anche associata a una differenza nell'espressione genica, basata su misurazioni quantitative specifiche per alleli effettuate mediante spettrometria di massa. I principali vantaggi di questa tecnica sono che, a differenza del saggio genico con reporter luciferasi, non richiede manipolazioni molecolari e misura i livelli endogeni di espressione genica.

Inoltre, siamo in grado di confrontare i livelli di espressione tra i due alleli in modo internamente controllato, eliminando così parte della variabilità sperimentale. Questo metodo ci aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica umana, come i meccanismi molecolari alla base delle associazioni genetiche. Abbiamo concepito per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo identificato un'associazione genetica che interessava tre geni, senza riuscire a precisare il segnale su uno singolo.

Mediante un'ulteriore mappatura genetica. Le cellule utilizzate per questo saggio devono esprimere il gene di interesse e soddisfare due requisiti genotipici fondamentali. Devono essere eterozigoti sia per le sequenze di DNA associate alla malattia sia per i marcatori del DNA, che possono distinguere i trascritti in base alla loro origine cromosomica. Nella strategia di selezione delle linee cellulari qui mostrata, le linee cellulari A e B sono eterozigoti per un marcatore codificante trascritto, rappresentato dai triangoli.

Tuttavia, la linea Omnicell A è eterozigote per la sequenza di DNA associata a una malattia, chiamata variante di rischio rappresentata dai cerchi. L'allele blu della variante di rischio è associato a un livello inferiore di trascrizione. Dopo aver selezionato la coltura della linea cellulare, coltivando le cellule in un flacone secondo le specifiche del fornitore, utilizzeremo fibroblasti in questa dimostrazione. Sebbene questo saggio sia ugualmente applicabile ad altri tipi cellulari, inclusi le cellule primarie, preparare due piastre di Petri da 10 centimetri rispettivamente per le estrazioni di DNA e RNA.

Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80%, possono essere raccolte per estrazioni di DNA e RNA utilizzando metodi standard, inclusi kit disponibili in commercio, appropriati per il tipo di cellula selezionato. Prima di eseguire questo saggio, progettare due coppie di primer PCR per ogni marcatore di DNA: una coppia per l'amplificazione del DNA genomico e l'altra per l'amplificazione del cDNA; posizionare i primer forward e reverse per l'amplificazione del cDNA in esoni diversi per evitare contaminazioni genomiche; progettare i primer in modo da ottenere un prodotto PCR compreso tra 100 e 500 paia di basi per ogni linea cellulare; preparare otto reazioni PCR da microlitro. Quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del DNA genomico e quattro reazioni indipendenti per l'amplificazione del cDNA ogni volta.

La miscela relativa alla reazione PCR contiene il tampone MLA, dNTP, primer, cloruro di magnesio e, in alternativa, DNA genomico o cDNA. Eseguire le reazioni PCR nelle condizioni ottimizzate per ogni coppia di primer, mantenendo il numero di cicli nella fase lineare dell'amplificazione. Al termine delle reazioni PCR, rimuovere i primer e i dNTP in eccesso aggiungendo esonucleasi I e fosfatasi alcalina da gambero (SAP) a ciascun prodotto PCR e incubando a 37 gradi Celsius per 20 minuti, seguiti da 15 minuti a 85 gradi Celsius.

Applicare ciascun prodotto PCR due volte su una piastra a 384 pozzetti, in modo da ottenere otto misurazioni per ogni campione. In totale 16 applicazioni per il saggio di estensione primario. Progettare il primer di estensione mediante il software di progettazione del saggio, in modo che lo stesso primer possa essere utilizzato sia per i prodotti genomici che per quelli C-D-N-A-P-C-R.

Specificare una lunghezza dei primer compresa tra 14 e 18 paia di basi. Eseguire la reazione di estensione primaria con una miscela appropriata di tre terminatori deossinucleotidici e un deossinucleotide. Una tipica reazione di estensione primaria include una fase iniziale a 94 gradi Celsius per due minuti, seguita da 40 cicli di 94 gradi Celsius per cinque secondi, 52 gradi Celsius per cinque secondi e 72 gradi Celsius per cinque secondi.

Infine, gli oligonucleotidi estesi vengono quantificati mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice e tempo di volo, utilizzando uno spettrometro di massa spectro reader. Un punto chiave di questo protocollo è l'uso di diverse strategie per controllare il rumore sperimentale ed eliminare gli artefatti. È davvero importante ripetere l'esperimento almeno tre volte.

Il miglior controllo per l'esperimento consiste nell'utilizzare una linea cellulare eterozigote per il saggio di rivestimento snip per l'estensione primaria, ma che non porti l'allele associato alla malattia. Inoltre, progettare saggi per marcatori codificanti alternativi trascritti dal DNA. Se questi non sono disponibili, un controllo aggiuntivo può essere fornito da coppie alternative di primer PCR che bersagliano esoni diversi per il saggio di estensione primaria.

Un controllo interno può essere ottenuto progettando primer di allungamento in grado di ibridarsi sia al filamento diretto che a quello inverso. Qui viene mostrato un esempio di analisi dell'espressione allele-specifica con esempi di tracce di spettrometria di massa. Questa figura mostra i risultati dell'analisi di quattro prodotti primari di estensione allele-specifici eseguiti su quattro diversi template.

I due grafici superiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del DNA genomico di due linee cellulari diverse, entrambe eterozigoti per un polimorfismo codificante trascritto. Tuttavia, solo la linea cellulare A è eterozigote per la varianza del DNA a rischio. Questi due grafici inferiori rappresentano i risultati ottenuti dall'analisi del cDNA generato dalle stesse linee cellulari a causa di un artefatto sperimentale.

Il primo picco è sempre più alto del secondo picco, anche nell'analisi genomica. Pertanto, i risultati dell'analisi genomica vengono utilizzati per normalizzare i dati del CDNA. L'analisi statistica viene condotta estraendo il rapporto completo di tipizzazione ELO all'interno del software di tipo mass array.

Questo rapporto fornisce dati relativi all'area del picco, e qui mostriamo un esempio relativo a due linee cellulari, la cellula A e la cellula B eterozigoti per una snip codificante, ma in cui solo la cellula A è eterozigote per un marcatore associato a una malattia. Le colonne in grigio sono generate direttamente dal software, mentre le colonne in verde sono calcolate manualmente per ogni cellula. Sono presenti otto misurazioni sia per il cDNA che per il DNA genomico.

Il software calcolerà l'area sottostante ciascun picco dello spettro, che rappresenta l'abbondanza di ciascuno dei due alleli. Il rapporto tra gli alleli viene calcolato dividendo l'area del primo allele per l'area del secondo allele per ciascun campione di cDNA e genoma. Viene calcolata una media e l'errore standard su tutte e otto le misurazioni.

Un elevato errore standard superiore a 0,1 indica che le misurazioni non sono coerenti e devono essere scartate. Infine, il rapporto medio del cDNA viene normalizzato utilizzando il rapporto medio del DNA genomico per stimare la deviazione da un rapporto pari a uno, valore atteso in assenza di differenze nell'espressione allele-specifica. Il rapporto normalizzato è diverso da uno nella cellula A, ma vicino a uno nella cellula B; questi dati suggeriscono che la linea cellulare A possiede una variante del DNA in fase con l'allele misurato dal secondo picco, la quale riduce l'espressione del gene in analisi.

La linea cellulare B fornisce un controllo negativo molto pratico. È estremamente importante definire varianti genetiche informative e stabilire controlli sperimentali appropriati quando si tenta questa procedura. A seguito di questo protocollo, possono essere utilizzati altri metodi come l'immunoprecipitazione della cromatina specifica per aplotipo, che aiutano a rispondere a domande quali la presenza di varianti genetiche per le quali non esistono marcatori trascritti da utilizzare per analizzare l'espressione genica specifica per allele.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare l'RNA in modo specifico per allele e di come utilizzare questa analisi per comprendere varianti funzionali geneticamente importanti.