Name: Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri la farmacologia comportamentale nelle api mellifere per studiare apprendimento e memoria mediante condizionamento classico olfattivo. Questo metodo rivela i meccanismi molecolari della formazione della memoria.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della Ricerca (BMBF) nell&#39;ambito del Fuoco Bernstein: Base neuronale di apprendimento (BFNL) per DE Ringraziamo Randolf Menzel per preziosi commenti su una versione precedente del manoscritto.

1. Le api cattura dal Hive <ol><li> Un giorno prima l'esperimento comincia, tra 2 e 4 del pomeriggio, lasciando l'alveare api sono catturati. Per fare questo, una luce UV-permeabile piramide in plexiglass (altezza = 30 cm, apice 3,5 x 3, 5 cm, base 18 x 18 cm), che è richiudibile al vertice e la base, è tenuto ad un 20 - distanza di 30 cm di fronte all'ingresso dell'alveare con la base aperta e l'apice chiuso in modo che le api di lasciare l'alveare entrare nella base della piramide. La base è quindi chiuso e le api catturate vengono portati in laboratorio per ulteriori manipolazioni. </li></ol> 2. Trasferimento di api dalla Piramide in flaconi di vetro <ol><li> Nel laboratorio, la piramide è posato sulla sua base. Le pareti della piramide sono oscurati (per esempio con un asciugamano), ma l'apice è lasciato scoperto. A causa della loro fototassi positivo, api lascerà la piramide con l'apice quando aperto. Uno dopo l'altro, le api vengono trasferite dalla piramide in flaconi di vetro tenendo le fiale sopra l'apice aperto. Un flaconcino viene utilizzato per ape. Pertanto, l'apice è chiuso quando si un'ape entra nel flaconcino. </li></ol> 3. Le api, ricevano Tubi <ol><li> Le api sono immobilizzati da un raffreddamento in fiale di vetro in ghiaccio per 2,5-3,5 min. Si consiglia di guardare l'ape e rimuoverlo dal ghiaccio non appena si smette di muoversi. </li><li> Un'ape singolo immobilizzato è imbrigliato in un piccolo tubo di plastica con del nastro adesivo, in modo che sia in grado di muoversi liberamente la sua proboscide, ma non la sua testa, torace e gambe. E 'importante che il collo non è compresso. </li><li> Ogni ape fissato in un tubo di plastica viene messo in un pozzo numerati su una rastrelliera per una migliore maneggevolezza e l'identificazione. Dopo che è stata rimossa per il recupero di condizionamento o la memoria del tubo è sempre restituito al pozzo esattamente lo stesso. </li></ol> 4. Api di alimentazione <ol><li> La prima sera (4-6 pm), dopo la cattura, le api sono alimentati a sazietà con la soluzione di saccarosio (0,88 M, lo zucchero bianco raffinato casa sciolto in acqua di rubinetto). Per alimentare un ape, il suo PER è suscitato toccando le sue antenne con una soluzione di saccarosio e l'animale è consentito di consumare una goccia (4 mL) di soluzione di saccarosio. Le api sono alimentati uno dopo l'altro finché non hanno più mostrano una veloce e affidabile PER quando le loro antenne sono toccati con la soluzione di saccarosio. </li><li> Su ogni sera successiva (4-6 pm) delle api esperimento vengono alimentati uno dopo l'altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato risolto in acqua di rubinetto). E 'importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l'allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio. </li></ol> 5. Mantenere Api Sfruttati Pernottamento <ol><li> Le api sono tenuti durante la notte in una ciotola di plastica a temperatura ambiente. L'acqua del rubinetto è piena nella ciotola (circa 0,5-1 cm di altezza). Rack con le api sfruttata vengono inseriti nella ciotola sopra la linea di galleggiamento con le piastre ELISA come piattaforma. Infine, la tazza è ricoperto di cartone. </li></ol> 6. Condizionamento olfattivo La prima mattina (ore 10) l'esperimento di condizionamento olfattivo viene effettuata. Lo stimolo condizionato (CS) è un odore, lo stimolo incondizionato (US) è ​​la soluzione di saccarosio. <ol><li> 4 l di dell'odore (es. olio di chiodi di garofano) vengono aggiunti su un tondo di carta filtro (1,3 cm di diametro) che viene poi inserito in una siringa da 20 ml. L'odore è pipettato sotto una cappa filtrante e suggerimenti sono utilizzati per prevenire la contaminazione della pipetta. </li><li> Il rack con le api sfruttata è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima della procedura di condizionamento inizia, ma ad una distanza dal luogo di fronte a un tubo di scarico in cui le api sono condizionati singolo. </li><li> Condizionamento è composto da tre coppie di odore (lo stimolo condizionato, CS) e la soluzione di saccarosio (lo stimolo incondizionato, USA, 1,25 M) con un inter-trial intervallo (ITI) di 10 min. Un segnale acustico consegnato allo sperimentatore attraverso un lettore audio permette la tempistica precisa di insorgenza stimolo, stimolo offset, durata stimolo e di collocamento. Un processo di acquisizione inizia con un collocamento di 10 secondi l'animale di fronte a uno scarico. Poco prima della fine dei 10 sec la siringa contenente l'odore è posizionato 3 cm fronte delle api destinati a antenne dell'ape. Successivamente, l'odore è presentato per 5 secondi, premendo 20 ml d'aria attraverso la siringa. Dopo i primi 3 secondi i flagelli distale di entrambe le antenne sono toccati con una soluzione di saccarosio-stuzzicadenti inumidito e gli animali sono autorizzati a leccare lo stuzzicadenti moistend per 4 sec. 13 secondi dopo la stimolazione è finita CS, le api vengono prese fuori del contesto formativo e rimesso nel rack. Complessivamente una prova di formazione dura 28 secondi. E 'importante che né antenne delle api né la proboscide, sono ricoperte di saccarosio dopo il condizionamento. Quindi deve essere garantito che lo stuzzicadenti è solo inumidito con soluzione di saccarosio e che nessuna forma gocce di soluzione di saccarosio sul stuzzicadenti. </li><li> Dopo il condizionamento i rack sono posti di nuovo nella ciotola. </li><li> Comportamento degli animali 'durante l'esperimento, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e CS e presentazione degli Stati Uniti, è monitorato e annotato dallo sperimentatore. </li></ol> 7. Conservazione della memoria <ol><li> Test di ritenzione può essere eseguita in qualsiasi intervallo (min a giorni). Il rack con le api è posizionato in prossimità del sito di condizionamento 30 minuti prima del test di memoria inizia. </li><li> Un test della memoria è costituita da 5 sec presentazione CS senza presentazione degli Stati Uniti. La prova inizia con un collocamento di 10 secondi l'animale di fronte al gas di scarico. Successivamente, l'odore è presentato per 5 secondi come descritto sopra. Il comportamento dell'animale, ovvero il verificarsi del PER durante il posizionamento e la presentazione CS è annotato durante l'esperimento. </li><li> Alla fine dell'esperimento la risposta estensione proboscide è di nuovo suscitato toccando le antenne con una soluzione di saccarosio per garantire che l'animale è ancora in grado di estendere la sua proboscide. </li></ol> 8. Iniezione sistemica Il punto di tempo di iniezione sistemica dipende dal disegno sperimentale. <ol><li> Un piccolo foro è fatto nella cuticola della parte posteriore della scutum vicino alla fessura di sopra dei 17 scutal volo muscolare utilizzando un ago ipodermico monouso (21 G). </li><li> Utilizzando un tubo di vetro capillare, 1 ul di soluzione viene iniettata attraverso il foro nella cuticola nel muscolo volo. Sperimentatori addestrati sono in grado di iniettare un ape ogni 30 secondi, consentendo un momento preciso di iniezione e di condizionamento. </li></ol> 9. Le api di alimentazione durante l'esperimento <ol><li> La sera (4-6 pm) dopo il condizionamento, le api sono alimentati uno dopo l'altro quattro volte con 1 goccia di soluzione di saccarosio (4 microlitri, 0,88 M, lo zucchero bianco raffinato sciolto in acqua di rubinetto). E 'importante che la soluzione di saccarosio non è spalmato sulle antenne delle api o la proboscide durante l'allattamento e che i tubi non sono contaminati con soluzione di saccarosio. Le api non dovrebbero essere alimentati in corrispondenza o in prossimità del sito di condizionamento per escludere la possibilità di associare il contesto di formazione con lo stimolo di saccarosio. </li></ol> 10. Raccolta dati e analisi dei dati <ol><li> Comparsa di risposta estensione proboscide durante l'esperimento è monitorato. Un'ape risulti positivo se si estende la sua proboscide tra l'inizio del CS e la presentazione degli Stati Uniti (durante l'allenamento) o durante la presentazione CS (in fase di test), che attraversano una linea virtuale tra le mandibole aperte. </li><li> Per essere inclusi negli animali l'analisi deve soddisfare due criteri: devono sopravvivere l'intero esperimento e devono dimostrare l'incondizionato risposta estensione proboscide (PER) di soluzione di saccarosio al termine dell'esperimento. La percentuale di api che mostra il PER durante l'acquisizione e test di ritenzione è tracciata per ogni presentazione CS. </li></ol> 11. Rappresentante dei risultati: Due esperimenti sono presentati qui. Nel primo esperimento guardiamo l'impatto di iniezione sistemica di PBS (PBS; in mM: 137 NaCl, KCl 2,7, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) sull'apprendimento e lungo termine formazione della memoria. Tre gruppi di api sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti con un inter-trial intervallo di 10 minuti: un non-gruppo trattato, un gruppo che è stato iniettato con 1 ml di PBS 30 minuti prima dell'allenamento, e una farsa-iniettato il gruppo trattato allo stesso modo del PBS a iniezione di gruppo, ma senza l'iniezione di PBS. 24 ore dopo la formazione della memoria è stata testata con una presentazione CS in tutti e tre i gruppi. La percentuale di animali che presentano la risposta condizionata durante il condizionamento aumenta significativamente nelle tre prove di formazione (Fig.1, ANOVA per misure ripetute per il fattore tempo F 2378 = 340.456, p &lt;0,05). Nessuna differenza nella PER poteva essere osservata tra i tre gruppi durante il condizionamento (ANOVA per misure ripetute per il fattore F2 gruppi, 189 = 1.299, p&gt; 0,05). Questo vale per un test di 24 ore di ritenzione (F2, 187 = 0.752, p&gt; 0,05) nel confronto tra gli animali non trattati con PBS-iniettato animali e sham-iniettato. Nel secondo esperimento abbiamo dimostrato l'inibizione di ritenzione della memoria tre o quattro giorni dopo l'allenamento quando l'inibitore della sintesi proteica anisomycin (10 mM) è stata iniettata per via sistemica 30 min dopo tre CS-US abbinamenti. Confronto di un anisomycin iniezione gruppo con un PBS a iniezione gruppo rivela una differenza significativa tra i gruppi durante la ritenzione test (Fig.2, ANOVA per misure ripetute per il fattore di F1 del gruppo, 94 = 8,86, p &lt;0,05). Una delle principali differenze possono essere osservate al test della memoria il giorno 3 e giorno 4. Questo assomiglia i risultati di Wüstenberg et al. 18, che ha anche condizionato le api con tre CS-US abbinamenti, anche se con un protocollo diverso. <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Lesione cuticola o iniezione di PBS non altera acquisizione e il mantenimento della memoria. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione). Dopo 24 ore, la memoria è stata testata (ritenzione della memoria). Trenta minuti prima di formazione, un buco è stato fatto nella cuticola di due gruppi (lesione, PBS) e uno di questi gruppi è stato iniettato con 1 ml di PBS (PBS). Un terzo gruppo è stato lasciato intatto (nessun trattamento). Presentato è la percentuale di animali per ogni gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. Un'ANOVA non rivela differenze significative tra i gruppi nella fase di acquisizione (F2, 189 = 1,299, p&gt; 0,05) o nella conservazione memoria (F2, 187 = 0,752, p&gt; 0,05). <img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Iniezione di anisomycin 40 minuti dopo l'ultimo CS-USA accoppiamento riduce la ritenzione della memoria tre giorni e quattro giorni dopo l'allenamento. Gli animali sono stati addestrati con tre CS-US abbinamenti (acquisizione) e iniettato con 1 mM anisomycin microlitri 10 (formato ISO) o 1 ml di PBS 1 h dopo il processo di formazione prima. Memoria è stata testata (ritenzione della memoria) 24 ore, 48 ore, 72 ore e 96 ore più tardi. Presentato è la percentuale di animali per gruppo rispondendo alla presentazione con un odore PER. L'iniezione di anisomycin porta ad una riduzione significativa di memoria ritenzione 72 ore e 96 ore dopo l'allenamento (F1, 94 = 8.86, p &lt;0,05), come rivelato da un ANOVA.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<ol><li> Facendo api: Per raccogliere esperienza api bottinatrici, le api vengono catturati o al mattino o al pomeriggio, evitando il momento in cui le api giovani sui voli orientamento 19. Raccoglitori raccolga polline o nettare. Le differenze tra polline e nettare raccoglitori sono stati osservati in base alla loro reattività zucchero e la loro capacità di apprendimento 20. Per raggiungere raccoglitori nettare unico, una fonte di cibo artificiale riempito con una soluzione di saccarosio può essere installata vicino l&#39;alveare e gli animali possono essere raccolti lì. Raccoglitori polline ritorno all&#39;alveare possono essere identificati dai cesti polline sulle zampe posteriori 20. </li><li> Fissaggio e movimentazione: raffreddamento estesa delle api sul ghiaccio dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe incidere sulla loro capacità di apprendere e di sopravvivere fino alla fine dell&#39;esperimento. Tarsi devono essere fissati con cura all&#39;interno del tubo per evitare la stimolazione accidentale con una soluzione di saccarosio. Questo è importante, perché le api hanno dimostrato di imparare attraverso la stimolazione del tarso con una soluzione succrose 3,21. </li><li> Condizionamento olfattivo: Il numero di prove condizionata, l&#39;inter-trial intervallo, e il punto di tempo di prova può essere variata a seconda del focus dello studio 3,22. </li><li> Alimentazione: il livello di sazietà delle api è conosciuto per influenzare le prestazioni di apprendimento e la memorizzazione 3,23. Questo deve essere preso in considerazione durante la pianificazione degli esperimenti. </li><li> Iniezione: sacche d&#39;aria si trovano nei 17 torace api. Queste parti vitali del sistema respiratorio sono necessari per la sopravvivenza. Quindi si deve prestare attenzione a non danneggiare le sacche d&#39;aria durante l&#39;iniezione. Il rilascio di bolle d&#39;aria indica un danno per le sacche d&#39;aria. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Siringa Omnifix 20 ml</td><td>B. Braun Medical</td><td>4616200 V</td><td></td></tr><tr><td>Zucchero raffinato bianco per uso domestico</td><td>Kaisers Supermarket, Berlino, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio di chiodi di garofano</td><td>Bombastus, Freital, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipette plus</td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td></td></tr><tr><td>Portaprovette per 30 tubi per api</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi di plastica</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piramide in plexiglass permeabile alla luce UV</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td>altezza = 30 cm, apice 3,5 x 3,5 cm, base 18x18 cm</td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>Tesa, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bastoncini capillari 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte capillari 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro spessa 0,16-0,2 mm</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 616 o MN615</td><td>Ritagliata in dischetti circolari con diametro di 1,3 cm</td></tr><tr><td>Ago ipodermico monouso</td><td>B. Braun Medical</td><td>4657683</td><td>diametro 0,45 mm</td></tr></tbody></table>

farmacologia comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( apis mellifera)

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Le api (Apis mellifera) sono ben noti per la loro abilità di comunicazione e orientamento e per i loro 1,2 impressionante capacità di apprendimento. Perché la sopravvivenza di una colonia di api dipende sullo sfruttamento delle fonti di cibo, le api raccoglitore apprendere e memorizzare siti fiori variabile nonché la loro redditività. Forager api possono essere facilmente addestrati in ambienti naturali dove foraggio in un sito di alimentazione e imparare i segnali correlati, come l&#39;odore o colore. Appetitivo apprendimento associativo può anche essere studiato in condizioni controllate in laboratorio dal condizionamento della risposta estensione proboscide (PER) del individualmente imbrigliato api 3,4. Questo paradigma di apprendimento consente lo studio dei meccanismi neuronali e molecolari che sono alla base dell&#39;apprendimento e la formazione della memoria in modo semplice ed estremamente affidabile 5-12. Un approccio farmacologia comportamentale è usato per studiare i meccanismi molecolari. I farmaci vengono iniettati per via sistemica di interferire con la funzione di molecole specifiche, durante o dopo l&#39;apprendimento e la formazione della memoria 13-16. Qui mostriamo come addestrare le api sfruttate condizionata PER e come applicare i farmaci per via sistemica per iniezione nel muscolo di volo delle api.

Dimostriamo come implementare un metodo di farmacologia comportamentale in un paradigma di condizionamento appetitivo olfattivo nelle api (Apis mellifera) mediante l&#39;applicazione sistemica di farmaci. Questo metodo permette di indagine del processo di apprendimento dei meccanismi di base e formazione della memoria in modo semplice e affidabile.

Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

Le api mellifere (Apis mellifera) sono note per le loro capacità di comunicazione e orientamento e per la loro impressionante capacità di apprendimento1,2. Poiché le...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi molecolari alla base dell'apprendimento e della formazione della memoria. Nelle api mellifere, il primo passo consiste nel raccogliere api in volo libero dal loro alveare. Successivamente, le api vengono immobilizzate in tubi di plastica.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un condizionamento classico. È possibile iniettare farmaci in determinati momenti temporali intorno al condizionamento per studiarne l'effetto sull'apprendimento e sulla formazione della memoria. L'ultimo passaggio della procedura è testare il mantenimento della memoria.In definitiva, i cambiamenti nel comportamento dopo il trattamento farmacologico possono rivelare i meccanismi molecolari alla base della formazione dell'apprendimento e della memoria. Nelle api mellifere. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'apprendimento e della memoria, svelando i meccanismi molecolari della formazione della memoria.In generale, i ricercatori alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché il momento della presentazione degli stimoli durante il condizionamento e il recupero della memoria deve essere preciso. Inoltre, il regime alimentare è fondamentale. La procedura verrà dimostrata da cutting gearing e Johannes faberg a studenti laureandi del mio laboratorio. Il giorno precedente l'esperimento, raccogliere le api tra le 14:00 e le 16:00 utilizzando una piramide in plexiglass permeabile alla luce UV.Una volta rientrati in laboratorio, posizionare la piramide sulla sua base e oscurare le pareti con un asciugamano, lasciando scoperto l'apice. Aprire l'apice e tenere una provetta di vetro sopra l'apertura, permettendo a una singola ape di entrare nella provetta prima di richiuderla. Continuare questa procedura fino a quando tutte le api sono state trasferite in una provetta di vetro, in autunno e in inverno.Quando le api non stanno volando all'aperto, un alveare viene mantenuto all'interno di una serra racchiuso in una rete; singole api vengono catturate direttamente dalla rete. Utilizzando un provetta di vetro per ogni ape, immobilizzare l'ape raffreddando la provetta sul ghiaccio per due minuti e mezzo fino a tre minuti e mezzo. Controllare attentamente l'ape e rimuoverla dal ghiaccio non appena smette di muoversi.Immoblizzare l'ape in un piccolo tubo di plastica utilizzando del nastro adesivo. Assicurarsi che l'ape possa muovere liberamente l'addome, ma non la testa, il torace né le zampe. È inoltre importante non comprimere il collo.Una volta preparata un'ape, posizionare il tubo in un foro numerato su un supporto, per una migliore manipolazione e identificazione.I tubi vengono sempre reinseriti nel medesimo foro. Dopo la manipolazione, nutrire le api tra le 16:00 e le 18:00 in un luogo distinto dal sito di condizionamento. Elicire la risposta di protrusione della proboscide, o PER, toccando le api e le loro antenne.Con una soluzione di saccarosio, lasciare che l'ape ingerisca una goccia di circa quattro microlitri di soluzione SRAs. Assicurarsi di non sporcare le antenne dell'ape, il pro bois o il tubo di plastica. Nutrire ogni ape fino a quando non lo farà più.Mostrare una risposta elettroretinografica rapida e affidabile quando le loro antenne vengono toccate con la soluzione. Nelle sere successive dell'esperimento, somministrare a ciascuna ape quattro volte una goccia di soluzione di saccarosio. Riempire una ciotola di plastica con acqua del rubinetto fino a un'altezza compresa tra 0,5 e un centimetro.Posizionare il supporto con le api imbraggate nella ciotola utilizzando una piastra lysa come piattaforma. Coprire la ciotola con cartone e conservare a temperatura ambiente durante la notte. Le api subiscono un condizionamento olfattivo intorno alle 10:00 del mattino successivo al prelievo.30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento. Posizionare il supporto con le api imbragiate vicino al sito di condizionamento, ma lontano dall'apertura del tubo di scarico dove le api verranno addestrate. Successivamente, preparare lo stimolo condizionato lavorando sotto cappa.Utilizzare una punta filtrante per pipettare quattro microlitri di olio di chiodi di garofano su una carta filtro circolare. Posizionare la carta filtro profumata in una siringa da 20 millilitri e inserire lo stantuffo. Impostare il lettore audio che fornirà un segnale acustico all'operatore.Questo garantisce un temporizzazione precisa dello stimolo, dell'inizio dello stimolo, dell'interruzione dello stimolo, della durata e della posizione. Prepararsi a registrare il comportamento dell'ape durante tutto il condizionamento. Viene assegnato un punteggio positivo se l'ape estende il suo SSIS tra l'inizio dello stimolo condizionato e la presentazione dello stimolo incondizionato.Attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte Per iniziare una prova di acquisizione, selezionare l'ape da addestrare e posizionarla davanti all'uscita dell'aria per 10 secondi. Poco prima della fine di questo intervallo di dieci secondi, posizionare la siringa contenente l'odore a tre centimetri dalle api e dalle antenne. Presentare l'odore per cinque secondi spingendo 20 millilitri di aria attraverso la siringa.Dopo tre secondi, presentare lo stimolo incondizionato toccando la parte ventrale della flagella distale di entrambe le antenne con una soluzione di saccarosio, utilizzando uno stuzzicadenti umido. Avendo cura di non depositare la soluzione sulle api e sulle antenne, si permette all'ape di leccare lo stuzzicadenti. Questo stimolo composto dura quattro secondi, dopodiché le api vengono rimosse dal contesto di addestramento e riposizionate nel supporto.13 secondi dopo la presentazione dello stimolo condizionato, una prova di addestramento dura 28 secondi. Riportare l'ape sul sito di addestramento dopo un intervallo inter-trial di 10 minuti. Condurre la seconda delle tre prove come mostrato in precedenza e attendere ulteriori 10 minuti prima di eseguire l'abbinamento finale.Al termine dell'addestramento giornaliero, riposizionare i portapiatti all'interno della bacinella. Ricordare di nutrire ciascuna ape quattro volte con una goccia di soluzione di saccarosio da quattro microlitri tra le 16:00 e le 18:00. Come dimostrato in precedenza, i test di ritenzione possono essere eseguiti a intervalli che vanno da minuti a giorni dopo l'addestramento. Prepararsi al test della memoria posizionando il portapiatti con le api vicino al sito di condizionamento per 30 minuti.Iniziare il test posizionando un'ape davanti allo scarico per 10 secondi. Presentare lo stimolo condizionato per cinque secondi e annotare la comparsa di una PER. Al termine dei test della giornata, riposizionare i supporti all'interno della bacinella.Ricordarsi di nutrire ogni ape quattro volte con una goccia di soluzione di saccarosio da quattro microlitri tra le 16:00 e le 18:00, come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'intero esperimento, verificare che l'ape sia ancora in grado di estendere il proprio proboscide toccando un'antenna con la soluzione SRA per essere inclusa nell'analisi; le api devono sopravvivere all'intero esperimento e presentare una PER integra. In alcuni studi, vengono utilizzate iniezioni sistemiche per analizzare l'effetto di interventi farmacologici sulla memoria olfattiva. Tali iniezioni possono essere somministrate in diversi momenti a seconda del disegno sperimentale.Per iniziare, praticare un piccolo foro nella cuticola della parte posteriore dello scootin S, vicino alla fessura dello scootle S sopra il muscolo volante, utilizzando un ago ipodermico monouso. Successivamente, riempire un capillare di vetro con un microlitro della soluzione da testare. Inserire il capillare nel foro della cuticola e iniettare la soluzione nel muscolo volante.Sperimentatori esperti sono in grado di iniettare un B ogni 30 secondi, consentendo un temporizzazione precisa dell'iniezione e del condizionamento. In questo articolo vengono presentati due esperimenti. Il primo esperimento esamina l'impatto di un'iniezione sistemica di soluzione fisiologica somministrata prima dell'addestramento sull'apprendimento di una memoria.Ci sono tre gruppi in questo studio: un gruppo che non riceve alcun trattamento, un gruppo che riceve un'iniezione sistemica di un microlitro di soluzione salina fosfato tampone oppure un gruppo falso (sham). Questi trattamenti sono stati somministrati 30 minuti prima dell'addestramento, mostrato qui a sinistra. La percentuale di animali che mostrava la risposta condizionata durante l'acquisizione è aumentata nei tre tentativi di addestramento, senza differenze significative tra i gruppi.Gli istogrammi a destra mostrano che né l'iniezione di PBS né la lesione fittizia hanno influenzato il mantenimento della memoria. 24 ore dopo l'addestramento nel secondo esperimento, le iniezioni sono state somministrate 40 minuti dopo l'addestramento; le api sono state suddivise in un gruppo che ha ricevuto soluzione salina e un altro che ha ricevuto un microlitro dell'inibitore della sintesi proteica Anisomycin. Gli istogrammi a destra mostrano un chiaro declino nel mantenimento della memoria nelle api che hanno ricevuto Anisomycin. Questi risultati evidenziano l'importanza della sintesi proteica nella formazione della memoria olfattiva.Seguendo questa procedura, è possibile effettuare registrazioni elettrofisiologiche ed elettrofisiologiche al fine di rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio qual è la base neurofisiologica dell'apprendimento e della formazione della memoria dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio dell'apprendimento e della memoria per esplorare i meccanismi molecolari e neurofisiologici alla base della formazione della memoria nell'ape mellifera.

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