Farmacologia Comportamentale nel condizionamento classico della risposta estensione proboscide in api ( Apis mellifera)

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare i meccanismi molecolari alla base dell'apprendimento e della formazione della memoria. Nelle api mellifere, il primo passo consiste nel raccogliere api in volo libero dal loro alveare. Successivamente, le api vengono immobilizzate in tubi di plastica.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un condizionamento classico. È possibile iniettare farmaci in determinati momenti temporali intorno al condizionamento per studiarne l'effetto sull'apprendimento e sulla formazione della memoria. L'ultimo passaggio della procedura è testare il mantenimento della memoria.

In definitiva, i cambiamenti nel comportamento dopo il trattamento farmacologico possono rivelare i meccanismi molecolari alla base della formazione dell'apprendimento e della memoria. Nelle api mellifere. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'apprendimento e della memoria, svelando i meccanismi molecolari della formazione della memoria.

In generale, i ricercatori alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà poiché il momento della presentazione degli stimoli durante il condizionamento e il recupero della memoria deve essere preciso. Inoltre, il regime alimentare è fondamentale. La procedura verrà dimostrata da Cutting Gearing e Johannes Faberg a studenti laureandi del mio laboratorio. Il giorno precedente l'esperimento, raccogliere le api tra le 14:00 e le 16:00 utilizzando una piramide in plexiglass permeabile alla luce UV.

Una volta rientrati in laboratorio, posizionare la piramide sulla sua base e oscurare le pareti con un asciugamano, lasciando scoperto l'apice. Aprire l'apice e tenere una provetta di vetro sopra l'apertura, permettendo a una singola ape di entrare nella provetta prima di richiuderla. Proseguire con questa procedura fino a quando tutte le api saranno state trasferite in una provetta di vetro, in autunno e in inverno.

Quando le api non stanno volando all'esterno, un alveare viene mantenuto all'interno di una serra in una rete; singole api vengono catturate direttamente dalla rete. Utilizzando un flacone di vetro per ogni ape, immobilizzare l'ape raffreddando il flacone sul ghiaccio per due minuti e mezzo fino a tre minuti e mezzo. Monitorare attentamente l'ape e rimuoverla dal ghiaccio non appena smette di muoversi.

Immoblizzare l'ape in un piccolo tubo di plastica utilizzando del nastro adesivo. Assicurarsi che l'ape possa muovere liberamente l'ovisca, ma non la testa, il torace o le zampe. È inoltre importante non comprimere il collo.

Una volta preparata un'ape, posizionare il tubo in un foro numerato su un supporto. Per una migliore manipolazione e identificazione.

I tubi vengono sempre reinseriti nel medesimo foro. Dopo il trattamento, nutrire le api tra le 16:00 e le 18:00 in un luogo distinto dal sito di condizionamento. Elicire la risposta all'estensione del probo o PER toccando le api e le loro antenne.

Con una soluzione di saccarosio, lasciare che l'ape ingerisca una goccia di circa quattro microlitri di soluzione SRAs. Assicurarsi di non sporcare le antenne dell'ape, il pro bois o il tubo di plastica. Nutrire ogni ape fino a quando non lo farà più.

Mostrare una risposta elettroretinografica rapida e affidabile quando le loro antenne vengono toccate con la soluzione. Nelle sere successive dell'esperimento, somministrare a ciascuna ape quattro volte una goccia di soluzione di saccarosio. Riempire una ciotola di plastica con acqua del rubinetto fino a un'altezza compresa tra 0,5 e un centimetro.

Posizionare il supporto con le api imbraggate nella ciotola utilizzando piastre lysa come piattaforma. Coprire la ciotola con cartone e conservare a temperatura ambiente durante la notte. Le api subiscono un condizionamento olfattivo intorno alle 10:00 del mattino successivo al prelievo.

30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento, posizionare il supporto con le api imbracchiate vicino al sito di condizionamento, ma lontano dall'apertura del tubo di scarico dove le api verranno addestrate. Successivamente, preparare lo stimolo condizionato lavorando sotto cappa.

Utilizzare una punta filtrante per pipettare quattro microlitri di olio di chiodi di garofano su una carta filtro circolare. Posizionare la carta filtro profumata in una siringa da 20 millilitri e inserire lo stantuffo. Impostare il lettore audio che fornirà un segnale acustico all'operatore.

Questo garantisce il temporizzazione precisa dello stimolo, dell'inizio dello stimolo, della cessazione dello stimolo, della durata e della posizione. Prepararsi a registrare il comportamento dell'ape durante tutto il condizionamento. Viene assegnato un punteggio positivo se l'ape estende il suo SSIS tra l'inizio dello stimolo condizionato e la presentazione dello stimolo incondizionato.

Attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte Per iniziare una prova di acquisizione, selezionare l'ape da addestrare e posizionarla davanti all'uscita dell'aria per 10 secondi. Poco prima della fine di questo intervallo di dieci secondi, posizionare la siringa contenente l'odore a tre centimetri dalle api e dalle antenne. Presentare l'odore per cinque secondi spingendo 20 millilitri di aria attraverso la siringa.

Dopo tre secondi, presentare lo stimolo incondizionato toccando la parte ventrale della flagella distale di entrambe le antenne con una soluzione di saccarosio, utilizzando un bastoncino di legno umido. Avendo cura di non depositare la soluzione sulle api e sulle antenne, si permette all'ape di leccare il bastoncino. Questo stimolo composto dura quattro secondi, dopodiché le api vengono rimosse dal contesto di addestramento e riposizionate nel supporto.

13 secondi dopo la presentazione dello stimolo condizionato, una prova di addestramento dura 28 secondi. Riportare l'ape sul sito di addestramento dopo un intervallo inter-trial di 10 minuti. Eseguire la seconda delle tre prove come mostrato in precedenza e attendere altri 10 minuti prima di effettuare l'abbinamento finale.

Al termine dell'addestramento giornaliero, riposizionare i portapiastre all'interno della bacinella. Ricordare di nutrire ciascuna ape quattro volte con una goccia di soluzione di saccarosio da quattro microlitri tra le 16:00 e le 18:00. Come dimostrato in precedenza, i test di ritenzione possono essere eseguiti a intervalli che vanno da minuti a giorni dopo l'addestramento. Prepararsi al test della memoria posizionando il portapiastre con le api vicino al sito di condizionamento per 30 minuti.

Iniziare il test posizionando un'ape davanti allo scarico per 10 secondi. Presentare lo stimolo condizionato per cinque secondi e annotare la comparsa di una PER. Al termine dei test della giornata, riposizionare i supporti all'interno della bacinella.

Ricordarsi di nutrire ogni ape quattro volte con una goccia di soluzione di saccarosio da quattro microlitri tra le 16:00 e le 18:00, come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'intero esperimento, verificare che l'ape sia ancora in grado di estendere il proprio proboscide toccando le antenne con la soluzione SRA per essere inclusa nell'analisi; le api devono sopravvivere all'intero esperimento e presentare una PER intatta. In alcuni studi, vengono utilizzate iniezioni sistemiche per analizzare l'effetto di interventi farmacologici sulla memoria olfattiva. Tali iniezioni possono essere somministrate in diversi momenti a seconda del disegno sperimentale.

Per iniziare, praticare un piccolo foro nella cuticola della parte posteriore dello S scootin, vicino alla fessura dello S scootle sopra il muscolo del volo, utilizzando un ago ipodermico monouso. Successivamente, riempire un capillare di vetro con un microlitro della soluzione da testare. Inserire il capillare nel foro della cuticola e iniettare la soluzione nel muscolo del volo.

Sperimentatori esperti sono in grado di iniettare un B ogni 30 secondi, consentendo un temporizzazione precisa dell'iniezione e del condizionamento. In questo articolo vengono presentati due esperimenti. Il primo esperimento esamina l'impatto di un'iniezione sistemica di soluzione salina somministrata prima dell'addestramento sull'apprendimento di una memoria.

Ci sono tre gruppi in questo studio: un gruppo che non riceve alcun trattamento, un gruppo che riceve un'iniezione sistemica di un microlitro di soluzione salina fosfato tampone oppure un gruppo falso (sham). Questi trattamenti sono stati somministrati 30 minuti prima dell'addestramento, mostrato qui a sinistra. La percentuale di animali che mostrava la risposta condizionata durante l'acquisizione è aumentata nei tre tentativi di addestramento, senza differenze significative tra i gruppi.

Gli istogrammi a destra mostrano che né l'iniezione di PBS né la lesione fittizia hanno influenzato il mantenimento della memoria. 24 ore dopo l'addestramento nel secondo esperimento, le iniezioni sono state somministrate 40 minuti dopo l'addestramento; le api sono state quindi divise in due gruppi: uno ha ricevuto soluzione salina e l'altro un microlitro dell'inibitore della sintesi proteica e ESO micina. Gli istogrammi a destra mostrano un chiaro calo nel mantenimento della memoria nelle api che hanno ricevuto Anisa micina. Questi risultati evidenziano l'importanza della sintesi proteica nella formazione della memoria olfattiva.

Seguendo questa procedura, è possibile effettuare registrazioni elettrofisiologiche ed elettrofisiologiche per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio qual è la base neurofisiologica dell'apprendimento e della formazione della memoria dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio dell'apprendimento e della memoria, permettendo di esplorare i meccanismi molecolari e neurofisiologici alla base della formazione della memoria nell'ape mellifera.