Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di monitorare in modo non invasivo le alterazioni metaboliche in tempo reale a livello dell'intero animale all'interno della glicolisi, del metabolismo del piruvato e del ciclo dell'acido tricarbossilico causate da singole vie metaboliche, alterazioni genetiche e/o trattamenti farmacologici. Ciò si ottiene somministrando isotopi stabili ai nematodi viventi per fornire un sufficiente arricchimento isotopico in più metaboliti per consentire la quantificazione delle alterazioni genetiche e/o farmacologiche nelle vie metaboliche intermedie. Come secondo passo, l'incorporazione isotopica nell'atmosfera e l'anidride carbonica disciolta sono misurate mediante spettrometria di massa del rapporto dei gas, che fornisce una valutazione più diretta del flusso metabolico intermedio in brevi periodi di tempo.

Successivamente, i campioni vengono processati per l'analisi di amminoacidi liberi da vermi interi mediante HPLC e mediante arricchimento isotopico in amminoacidi e acidi organici mediante GCMS al fine di quantificare l'alterazione del flusso metabolico nei nematodi. A seguito dell'esposizione agli isotopi stabili, si ottengono risultati che mostrano effetti di durata variabile dell'esposizione agli isotopi, eliminazione batterica e distruzione alternativa dei vermi nei vermi wild type per interrogare l'abbondanza isotopica nei metaboliti intermedi. La guerra con il metodo può fornire informazioni sulla vela contro il metabolismo intermedio.

Può anche essere applicato ai nostri sistemi come le linee cellulari e i tessuti dei mammiferi. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato anomalie costanti nell'analisi degli aminoacidi dei vermi liberi mediante HPLC che erano indicative di un flusso metabolico intermedio alterato nelle alterazioni respiratorie primarie. Per iniziare questa procedura.

I vermi che sono stati esposti a un isotopo stabile marcato come precursore metabolico durante lo sviluppo o in età adulta, vengono raccolti in una provetta da centrifuga di plastica da 1,5 millilitri. Di solito diluiamo i vermi a una concentrazione di 1000 vermi per millilitro. Aggiungere il 60% di acido clorico contenente acido epsilon aminocaproico come standard interno ai vermi fino a una concentrazione finale del 4% di acido clorico e 20 nanomolari di standard interno.

Lasciare che il verme si depositi per gravità per cinque minuti, quindi rimuovere e conservare il surnatante in un altro tubo. Il passaggio successivo è uno degli aspetti più critici di questa procedura. I vermi devono essere completamente distrutti mediante screening prima dell'analisi dei metaboliti liberi Utilizzando un omogeneizzatore di plastica e un trapano motorizzato, macinare i campioni di vermi per 15 secondi.

Confermare visivamente la disgregazione del verme mediante microscopia ottica e ripetere la macinazione se necessario. In questa immagine, i pannelli A e B mostrano le viti senza fine prima della molatura. A differenza dei pannelli C e D che mostrano i vermi dopo la macinazione, trasferire il surnatante precedentemente salvato nelle provette da centrifuga in plastica da 1,5 millilitri con la centrifuga omogenata a vite senza fine.

I campioni a 2, 250 giri/min 1300 Gs per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una provetta di vetro fresca da sette millilitri. Conservare il pellet per un uso successivo in un saggio di concentrazione proteica.

Aggiungere ora quattro normali idrossido di potassio al SUPERNAT fino a quando l'intervallo di pH dei campioni è compreso tra sette e otto centrifughe. I campioni neutralizzati nelle provette di vetro da sette millilitri a 2.250 giri/min 1300 Gs per cinque minuti Per rimuovere i sali, trasferire il surnatante da ciascun campione in una provetta di vetro fresca da sette millilitri. I campioni neutralizzati possono ora essere preparati per la quantificazione dei metaboliti mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC e gascromatografia, spettrometria di massa o GCMS per HPLC.

Separare 50 microlitri di ciascun campione neutralizzato per l'iniezione diretta nell'HPLC. La quantificazione degli amminoacidi liberi viene eseguita utilizzando la derivitizzazione precale con aldeide al e la rilevazione fluorescente. Come descritto in precedenza, i restanti campioni neutralizzati saranno sottoposti a estrazione utilizzando una resina a scambio ionico per GCMS per determinare l'arricchimento isotopico in amminoacidi e acidi organici, come mostrato nella sezione successiva.

Per preparare le perline, aggiungere separatamente un normale acido cloridrico a uno G e un G 50. In becher da un litro, mescolare ogni fiaschetta per 30 minuti con un'agitazione magnetica. Dopodiché, lavare le perle con acqua deionizzata 10 volte fino a quando il pH dei lavaggi è uguale al pH dell'acqua.

Successivamente, mostreremo il nostro metodo per preparare colonne a basso costo su misura utilizzando pipette di vetro. In commercio sono disponibili anche colonne prefabbricate. Per preparare una colonna, utilizzare una pinza per inserire un tappo di cotone appena sopra la parte più stretta del puntale di una pipetta da pascolo, utilizzare una perlina G one per l'estrazione di acidi organici e una perlina G 50.

Per l'estrazione degli amminoacidi, riempire ogni colonna fino a circa un terzo dell'altezza della colonna. Se un campione ha già un pH neutro, non viene aggiunto nulla al campione prima di applicarlo alla colonna AG one. Per estrarre gli acidi organici per estrarre gli amminoacidi, aggiungere un millilitro di acido cloridrico normale 0,1 al campione prima di applicarlo alla colonna AG 50.

Ora applica i campioni neutralizzati precedentemente preparati su ciascuna colonna. Lavare ogni colonna 10 volte con acqua fino a quando i lavaggi non sono neutri. Al termine del lavaggio, eluire ogni colonna in fiale di vetro da quattro millilitri appena etichettate Per l'estrazione degli acidi organici, aggiungere tre millilitri di acido cloridrico normale alla colonna AG one.

Ciò consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di atomi di carbonio marcati tra tre specie di carbonio, quattro specie di carbonio, cinque specie di carbonio e sei specie di carbonio. Per l'estrazione degli aminoacidi, aggiungere tre millilitri di idrossido di ammonio normale alla colonna a G 50. Ciò consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di atomi di carbonio marcati tra tre specie di carbonio e cinque specie di carbonio.

Al termine delle estrazioni degli acidi organici e degli amminoacidi, posizionare le fiale del campione in un evaporatore reattivo a tre particelle per una notte fino a quando non sono asciutte. I campioni vengono quindi analizzati da GCMS come dettagliato nel testo del protocollo. Inizia questa procedura trasferendo un migliaio di giovani vermi adulti su una piastra agricola NGM sperimentale da 35 millimetri contenente carbonio 13 glucosio ed ed e coli universalmente marcati.

Quindi posizionare la piastra NGM sperimentale senza il suo coperchio. In una camera di vetro personalizzata dotata di un rubinetto di arresto a tre vie ben sigillato per consentire un campionamento e una sostituzione precisi dell'atmosfera. Coprire la guarnizione nel punto in cui il disco di vetro otticamente trasparente si trova sulla piastra con grasso per alto vuoto.

Sigillare la camera con il disco di vetro. Registrare l'ora. Come tempo zero, 30 minuti dopo, utilizzare una siringa da 20 millilitri per campionare 10 millilitri di atmosfera dalla camera di vetro tramite il rubinetto di arresto a tre vie.

Chiudere il rubinetto di chiusura della camera Dopo il campionamento, trasferire il campione in una tuba di vetro sottovuoto contenente un millilitro di bicarbonato di sodio in idrossido di sodio 0,1 molare. Quindi, iniettare 10 millilitri di aria nella camera di vetro attraverso il rubinetto di arresto a tre vie. Utilizzando una siringa da 20 millilitri, chiudere il rubinetto di arresto della camera Dopo aver reiniettato l'atmosfera e prima di riprendere l'incubazione, ripetere il campionamento dell'atmosfera dalla camera di vetro a 60, 90 e 120 minuti.

Analizzare questi campioni di anidride carbonica atmosferica per l'arricchimento di carbonio marcato utilizzando uno spettrometro di massa a rapporto gas come descritto nel testo del protocollo, gli isotopi stabili sono ben incorporati dopo due ore nei giovani vermi adulti, come evidenziato qui dal carbonio etichettato misurato in anidride carbonica atmosferica e dall'anidride carbonica disciolta nei vermi alimentati con OP 50 e coli uccisi vivi o irradiati dai raggi UV. Il rapporto tra anidride carbonica 13 e anidride carbonica 12 era maggiore nella frazione di anidride carbonica del verme disciolta rispetto all'anidride carbonica atmosferica rilasciata. È stato osservato che l'esposizione prolungata a un isotopo stabile dal periodo larvale e la successiva eliminazione dei vermi su NGM Aate senza batteri aumentano l'arricchimento isotopico di glutammato libero nei giovani vermi adulti.

In questo grafico, L uno rappresenta i vermi alimentati con carbonio 13 glucosio e batteri OP 50 universalmente marcati dallo stadio larvale L uno fino allo stadio di giovane adulto di 959 cellule, YA rappresenta i vermi alimentati con carbonio 13 glucosio e batteri OP 50 per 48 ore a partire da quando hanno raggiunto il primo giorno di deposizione delle uova, stadio di giovane adulto. L'asse x indica il numero totale di atomi di carbonio marcati in ciascuna specie di glutammato e l'asse Y indica la percentuale di arricchimento. Tutti gli animali sono stati ripuliti dall'etichetta isotopica in eccesso prima della preparazione del campione a valle.

Per le analisi GCMS, le barre verdi indicano i vermi eliminati in seguito all'esposizione isotopica mediante somministrazione di OP 50 E coli su piastre NGM per due ore prima dell'estrazione del PCA. Le barre blu e grigie indicano i vermi eliminati in seguito all'esposizione isotopica su piastre NGM senza batteri, rispettivamente per due o sei ore prima dell'estrazione del PCA, indipendentemente dal corso del tempo di esposizione isotopica. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'arricchimento isotopico nei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati chiarificati su piastre per due o sei ore.

In entrambi i cicli di esposizione isotopica, è stato osservato un minore arricchimento isotopico nei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati eliminati somministrando batteri non marcati per due ore. Pertanto, è stato determinato che il protocollo di clearing ottimale per i vermi cresciuti su piastre N GM a diffusione batterica con isotopo è stato eliminato per due ore su piastre NGM non diffuse per ottimizzare l'arricchimento percentuale nei metaboliti intermedi. Dopo il trattamento per 24 ore in coltura liquida con un glucosio a sei atomi di carbonio 13 senza batteri.

È stato fatto un confronto tra campioni di vermi interrotti dalla sola sonicazione o dalla sonicazione più macinazione, come mostrato in questa figura. I vermi interrotti dalla sonicazione più macinazione avevano un arricchimento isotopico maggiore rispetto ai campioni interrotti solo dalla sonicazione che infine alimentavano i vermi viventi con un precursore isotopico stabile durante lo sviluppo da L uno stadio su piastre o a partire dal primo giorno di uova, deponendo come giovani adulti per 24 ore in coltura liquida. Permette un'analisi sensibile dell'arricchimento isotopico tra i metaboliti indicativi del flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato nel ciclo dell'acido tricarbossilico dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada alla malattia mitocondriale, le ricerche per esplorare il flusso metabolico intermedio nell'eleganza del mare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un isotopico stabile, la profilazione del metabolismo intermedio e del flusso metabolico nei nematodi, l'eleganza.