Name: Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Scopri il profilo isotopico stabile del flusso metabolico intermedio in Caenorhabditis elegans. Questo metodo permette di monitorare alterazioni metaboliche in tempo reale e quantificare variazioni genetiche e farmacologiche nei nematodi.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institutes of Health (K08-DK073545 e NICHD sponsorizzato intellettuale e dello sviluppo della ricerca disabilità Center di New Investigator Award), la Fondazione Filadelfia, e la University of Pennsylvania premio McCabe (MJF), così come il Tristano Mullen Fondo (MJF e MY). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
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<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;applicazione di spettrometria di massa per misurare l&#39;abbondanza isotopica in metaboliti intermediario offre un quadro meravigliosamente dettagliato dei critici cambiamenti biochimici 5. Qui, abbiamo predisposto protocolli dettagliati per sfruttare questa metodologia altamente sensibile e specifico per la valutazione del metabolismo flusso intermediario nel modello animale geneticamente versatile, C. elegans. Infatti, l&#39;alimentazione degli animali che vivono con isotopi stabili etichettati precursori metabolici (come il 13 C-glucosio) permette di comprendere romanzo in via di flusso intermediario metabolica quando si misura l&#39;arricchimento isotopico in metaboliti a valle. Abbiamo sviluppato una metodologia affidabile per ottenere un&#39;analisi robusta di flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Ciò può essere realizzato sia in animali nutriti con isotopo stabile dai primi stadi larvali di sviluppo o all&#39;inizio del periodo post-mitotico adulti. Arricchimento isotopico in diverse specie metabolita può essere studiato insieme a tutto il profilo di acidi verme aminoacidi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni, come descritto in precedenza 4, per determinare assoluto arricchimento isotopico in diverse specie di alanina verme libero, aspartato, glutammato e la glutammina. Infatti, i modelli coerenti di arricchimento isotopico si ottengono quando si misurano analiti di aminoacidi e acidi organici in aliquote da 1.000 a 2.000 giovani vermi adulti sincrono. Tale metodologia può discriminare sensibilmente il flusso anormale intermediario nucleare ceppi gene mitocondriale basato mutante rispetto al wild-type vermi. Questa tecnica ha un valore di indagare le alterazioni del flusso in specifiche vie biochimiche di rilevanza per comuni errori congeniti del metabolismo. In particolare, l&#39;utilizzazione del glucosio marcato con isotopi stabili informa flusso di carbonio attraverso vie metaboliche centrale di rilevanza per le malattie mitocondriali. Infatti, i nostri dati suggeriscono l&#39;applicazione di tale metodologia può sensibilmente discriminare flusso anomalo intermediario in un gene nucleare basato mitocondriale complesso subunità III ceppo mutante (isp-1 (qm150)) rispetto al wild-type vermi. E &#39;importante riconoscere che da quando l&#39;esposizione isotopiche è completato in un periodo di uno o più giorni, quantificati arricchimento isotopico rappresenta un &quot;steady state&quot; valore di arricchimento, piuttosto che il flusso quantificabile in un periodo di tempo definito come potrebbe essere determinato nella cella modelli basati su esposti a isotopo per un periodo di minuti per ore. Un altro potenziale limite di interrogare flusso percorso nel corso dello sviluppo dei nematodi si riferisce a diverse lunghezze di sviluppo larvale che si verificano in particolare i ceppi mutanti. Per esempio, molti gravi mutazioni mitocondriali sono noti per causare l&#39;arresto al terzo (L3) stadio larvale 6. Così, l&#39;analisi di incorporazione dell&#39;isotopo solo negli animali che sopravvivono fino all&#39;età adulta può non essere rappresentativo dell&#39;intera popolazione mutante. Tuttavia, questa metodologia potrebbe essere adattato per valutare l&#39;incorporazione isotopica in metaboliti intermediario in una fase specifica larvale (come L2) piuttosto che aspettare che gli animali per raggiungere lo stadio adulto. Allo stesso modo, gli animali che entrano stadio alternativo larvale conosciuto come dauer probabilmente hanno notevolmente modificato (probabilmente inferiore) rispetto al flusso metabolico animali che procedere direttamente attraverso i quattro stadi larvali. Studio futuro potrebbe essere effettuata anche per valutare direttamente l&#39;incorporazione isotopica negli animali fase dauer di differenti background genetico. Esponendo gli animali a isotopi stabili per un periodo di tempo fisso (qui, da 24 a 48 ore) inizio una volta raggiunto lo stadio animali giovani adulti (come specificato nel protocollo B) elimina l&#39;impatto della variabile periodi di sviluppo. Mentre 13 C-glucosio interroga solo la glicolisi, il metabolismo del piruvato e ciclo degli acidi tricarbossilici flusso, altri traccianti isotopici potrebbe essere valutata a interrogare flusso biochimico percorso attraverso altre vie di interesse nei nematodi. Per esempio, 15 N-glicina può essere utilizzato per valutare fatturato aminoacidi nei nematodi. Un&#39;altra potenziale limitazione di questo approccio è il livello di sensibilità di rilevazione metabolita. La nostra esperienza suggerisce un minimo di 500 nematodi giovani adulti hanno l&#39;obbligo di quantificare con successo incorporazione isotopica con i metodi HPLC e GC / MS impiegato qui. Uso di strumenti con maggiore sensibilità, come la cromatografia liquida ad ultra (UPLC), può permettere un&#39;ulteriore riduzione del numero di animali studiati, anche se prevediamo che questo è improbabile per consentire la quantificazione affidabile di metaboliti e incorporazione isotopica in specie metabolita da worm singolo. Abbiamo studiato le popolazioni verme di 1.000 animali per esperimento, che abbiamo trovato per rilevare in modo affidabile metaboliti abbondanza a basso contenuto di ogni ceppo. Tuttavia, alcuni metaboliti, come ad esempio GABA, non può che essere attendibilmente quantificati in popolazioni molto più grandi di nematodi, su ordine di1x10 6 animali 4. In sintesi, il profilo degli isotopi stabili fornisce un metodo non invasivo e sicuro (non radioattivo), approccio che è stato a lungo utilizzato per lo studio degli errori congeniti del metabolismo. L&#39;applicazione di questa metodologia a C. elegans romanzo fornisce la capacità di indagare in vivo e in tempo reale, alterazioni metaboliche che si verificano a livello di intero animale, che possono derivare da singole malattie genetiche e / o esposizioni agente farmacologico.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - pagina 59</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro di Genetica Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocolli A e C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Centro di Genetica Caenorhabditis</td><td></td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>agar NGM</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protocolli A, B e C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;glucosio C (marcato universalmente)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protocollo A e C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;glucosio C (1,6 marcato)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>Acido perclorico al 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>&amp;#949;acido ε-aminocaproico (standard interno)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protocollo E</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protocollo E</td></tr><tr><td>Resina AG 1-X8, 100-200, forma cloruro</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protocolli A e B (estrazione di acidi organici)</td></tr><tr><td>Resina in forma idrogeno AG 50W-X8, 100-200</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protocolli A e B (estrazione di aminoacidi)</td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocollo A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>Elio</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protocollo C2</td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico con zoom SMZ-800</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protocolli A, B e C</td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale termoregolato</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>Mini agitatore rotante LabRoller</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Pestelli</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Trapano</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Becher di vetro da 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1 beuta da 1 L</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi Erlenmeyer da 25 mL</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>Tubi di vetro rotondi da 7 ml + tappo di gomma</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protocolli A, B e C1, C2</td></tr><tr><td>Tubi di vetro rotondi da 10 ml + tappo di gomma</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protocollo C2</td></tr><tr><td>Tubi con tappo blu</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici di plastica da 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Tutti i protocolli</td></tr><tr><td>tubi microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protocolli A e B</td></tr><tr><td>Siringhe (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protocolli C1 e C2</td></tr><tr><td>Aghi da 25 gauge</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protocolli C1 e C2</td></tr><tr><td>Colonne cromatografiche Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>Pipette di Pasteur</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>Pietre di Petri da 60 mm</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>Camera di vetro (fondo tagliato di un matraccio da 1 L) dotata di rubinetto a tre vie sigillato con grasso</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>Piastra di vetro otticamente trasparente</td><td>Personalizzato</td><td></td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>Evaporatore Reacti-Vap III</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>Cotone</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>Grasso per vuoto elevato</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protocollo C1</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protocollo B</td></tr><tr><td>Timer</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protocollo C</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa per rapporti isotopici</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protocollo D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protocollo D</td></tr></tbody></table>

stabile profiling isotopica di flux intermediario metabolica in fase di sviluppo e per adulti caenorhabditis elegans</em

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Stabile profilazione isotopica è da tempo consentito indagini sensibile delle conseguenze metaboliche di mutazioni genetiche e / o terapie farmacologiche in modelli cellulari e mammiferi. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per eseguire stabile profilazione isotopica del metabolismo intermedio e flusso metabolico nel nematode, Caenorhabditis elegans. I metodi sono descritti per il profiling intero verme amminoacidi liberi, anidride carbonica marcata, etichettato acidi organici, aminoacidi ed etichettato in animali esposti a isotopi stabili sia dal primo sviluppo su piastre di agar nematode terreni di coltura o dall&#39;inizio come giovani adulti, mentre esposti a vari trattamenti farmacologici in coltura liquida. Aminoacidi liberi sono quantificati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in aliquote verme estratto in tutto 4% acido perclorico. Universalmente etichettati 13 C-glucosio o 1,6 - 13 C 2-glucosio è utilizzato come precursore stabile isotopica di carbonio la cui etichetta è tracciata mediante spettrometria di massa di biossido di carbonio (sia atmosferiche e disciolti) così come in metaboliti indicativi del flusso attraverso la glicolisi , metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Risultati rappresentativi sono inclusi per dimostrare gli effetti del tempo isotopo esposizione, diversi protocolli di compensazione batterica, e di metodi alternativi interruzione verme nel wild-type nematodi, come pure l&#39;estensione relativa incorporazione isotopica nel complesso mitocondriale III vermi mutanti (isp-1 (qm150) ) rispetto al wild-type vermi. Applicazione di isotopi stabili profiling nei nematodi vivono fornisce una capacità nuova di indagare a livello di intero animale in tempo reale, alterazioni metaboliche che sono causati da malattie genetiche individuali e / o terapie farmacologiche.

Stabile mediante l&#39;analisi isotopica profilazione di massa gas-cromatografia spettrometria di flusso intermediario metabolica è descritto nel nematode,<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. I metodi sono specifici per la valutazione di arricchimento isotopico nel biossido di carbonio, acidi organici, aminoacidi e dopo l&#39;esposizione isotopo sia durante lo sviluppo su piastre di agar o durante l&#39;età adulta in coltura liquida.

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

La profilazione isotopica stabile ha permesso da tempo l'analisi sensibile delle conseguenze metaboliche di mutazioni genetiche e/o terapie farmacologiche in...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare in modo non invasivo le alterazioni metaboliche in tempo reale a livello dell'intero organismo, nel contesto della glicolisi, del metabolismo del piruvato e del ciclo dell'acido tricarbossilico, causate da singole vie metaboliche, alterazioni genetiche e/o trattamenti farmacologici. Questo viene ottenuto somministrando isotopi stabili a nematodi viventi, al fine di garantire un arricchimento isotopico sufficiente in un numero maggiore di metaboliti, permettendo così la quantificazione delle alterazioni genetiche e/o farmacologiche nelle vie metaboliche intermedie. Come secondo passaggio, l'incorporazione isotopica nell'anidride carbonica atmosferica e disciolta viene misurata mediante spettrometria di massa con rapporto isotopico dei gas, fornendo una valutazione più diretta del flusso metabolico intermedio in brevi periodi di tempo.In seguito, i campioni vengono analizzati per determinare l'analisi degli amminoacidi liberi nell'intero verme mediante HPLC, nonché il loro arricchimento isotopico mediante GCMS per amminoacidi e acidi organici, al fine di quantificare le alterazioni del flusso metabolico nei nematodi. Dopo l'esposizione all'isotopo stabile, si ottengono risultati che mostrano gli effetti di diverse durate di esposizione all'isotopo, della rimozione batterica e di metodi alternativi di rottura del verme in ceppi selvatici, per analizzare l'abbondanza isotopica nei metaboliti intermedi. Questo metodo può fornire informazioni sul ruolo del metabolismo intermedio.È inoltre applicabile ai nostri sistemi come linee cellulari di mammifero e tessuti. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato anomalie costanti nell'analisi degli aminoacidi liberi nei vermi mediante HPLC, suggeritive di un flusso metabolico intermedio alterato in seguito a cambiamenti primari della funzione respiratoria. Per iniziare questa procedura.Verme esposti a un precursore metabolico marcato con isotopo stabile durante lo sviluppo o nell'età adulta vengono raccolti in un tubo centrifugo di plastica da 1,5 millilitri. Di solito diluiamo i vermi fino a una concentrazione di 1000 vermi per un millilitro. Aggiungere acido perclorico al 60% contenente acido epsilon-aminocaproico come standard interno ai vermi, fino a una concentrazione finale di acido perclorico al 4% e 20 nanomolar dello standard interno.Lasciare sedimentare il verme per gravità per cinque minuti, quindi rimuovere e conservare il soprannatante in un altro tubo. Il passaggio seguente è uno degli aspetti più critici di questa procedura. I vermi devono essere completamente disintegrati mediante setacciatura prima dell'analisi dei metaboliti liberi. Utilizzando un omogeneizzatore di plastica e un trapano motorizzato, macinare i campioni di vermi per 15 secondi.Verificare visivamente l'interrompimento dei vermi mediante microscopia ottica e ripetere la macinazione se necessario. In questa immagine, i pannelli A e B mostrano vermi prima della macinazione. In contrasto con i pannelli C e D che mostrano vermi dopo la macinazione, trasferire il soprannatante precedentemente conservato nei tubi centrifuga in plastica da 1,5 millilitri con l'omogenato di vermi e centrifugare.Campioni a 2.250 giri/min, 1300 G, per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo di vetro da sette millilitri. Conservare il pellet per un successivo utilizzo in un saggio di concentrazione proteica.Ora aggiungere quattro idrossido di potassio normale al soprannatante fino a quando il pH dei campioni è compreso tra sette e otto. Centrifugare i campioni neutralizzati nei tubi di vetro da sette millilitri a 2.250 giri al minuto (1.300 G) per cinque minuti. Per rimuovere i sali, trasferire il soprannatante di ogni campione in un nuovo tubo di vetro da sette millilitri. I campioni neutralizzati possono ora essere preparati per la quantificazione dei metaboliti mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC e cromatografia gassosa con spettrometria di massa o GCMS per HPLC.Separare 50 microlitri di ciascun campione neutralizzato per l'iniezione diretta nell'HPLC. La quantificazione degli amminoacidi liberi viene eseguita mediante derivatizzazione in prec colonna con aldeide e rilevamento fluorescente. Come descritto in precedenza, i campioni neutralizzati rimanenti saranno sottoposti ad estrazione utilizzando una resina a scambio ionico per GCMS al fine di determinare l'arricchimento isotopico in amminoacidi e acidi organici, come mostrato nella prossima sezione.Per preparare le perle, aggiungere un acido cloridrico normale rispettivamente a G una e a G 50 perle separatamente. In beker da un litro, agitare ciascun flacone per 30 minuti con un agitatore magnetico. Successivamente, lavare le perle con acqua deionizzata 10 volte fino a quando il pH dei lavaggi risulti uguale al pH dell'acqua.Successivamente, illustreremo il nostro metodo per preparare colonne personalizzate a basso costo utilizzando pipette di vetro. Colonnes preassemblate sono inoltre disponibili in commercio. Per preparare una colonna, utilizzare una pinzetta per inserire un tappo di cotone appena sopra la parte più stretta della punta di una pipetta Pasteur, usando perle G one per l'estrazione degli acidi organici e perle G 50.Per l'estrazione degli aminoacidi, riempire ogni colonna fino a circa un terzo dell'altezza della colonna. Se un campione è già a pH neutro, non si aggiunge nulla al campione prima di applicarlo sulla colonna AG 1. Per estrarre gli acidi organici ed estrarre gli aminoacidi, aggiungere un millilitro di acido cloridrico 0,1 N al campione prima di applicarlo sulla colonna AG 50.Ora applicare i campioni neutralizzati precedentemente preparati su ciascuna colonna. Lavare ogni colonna 10 volte con acqua fino a quando i lavaggi risultano neutri. Al termine del lavaggio, eluire ciascuna colonna in provette campione di vetro fresche e etichettate da quattro millilitri. Per l'estrazione degli acidi organici, aggiungere tre millilitri di acido cloridrico tre normale alla colonna AG una.Questo consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di carboni marcati tra specie a tre carboni, specie a quattro carboni, specie a cinque carboni e specie a sei carboni. Per l'estrazione degli aminoacidi, aggiungere tre millilitri di ammoniaca 4 N a una colonna G 50. Questo consente l'analisi dell'arricchimento isotopico nel numero totale di carboni marcati tra specie a tre carboni e specie a cinque carboni.Al termine delle estrazioni di acidi organici e aminoacidi, posizionare le provette campione in un evaporatore reattivo a tre posti per tutta la notte fino a completa essiccazione. I campioni vengono quindi derivatizzati e analizzati mediante GCMS come descritto nel testo del protocollo. Iniziare questa procedura trasferendo mille worm adulti giovani in una piastra sperimentale NGM agar da 35 millimetri contenente glucosio marcato universalmente con carbonio 13 ed E. coli.Posizionare successivamente la piastra NGM sperimentale senza il coperchio all'interno di una camera di vetro personalizzata, dotata di un rubinetto a tre vie ben sigillato, che permette un campionamento e una sostituzione precisi dell'atmosfera. Sigillare con grasso ad alto vuoto il punto in cui il disco di vetro otticamente trasparente poggia sulla piastra.Sigillare la camera con il disco di vetro. Registrare il tempo. Al tempo zero e 30 minuti dopo, utilizzare una siringa da 20 millilitri per prelevare 10 millilitri dell'atmosfera dalla camera di vetro attraverso il rubinetto a tre vie.Chiudere il rubinetto a chiusura verso la camera. Dopo il campionamento, trasferire il campione in un tubo di vetro sottovuoto rosso contenente un millilitro di bicarbonato di sodio in idrossido di sodio 0,1 molare. Successivamente, iniettare 10 millilitri di aria nella camera di vetro attraverso il rubinetto a tre vie. Utilizzando una siringa da 20 millilitri, chiudere il rubinetto verso la camera dopo aver re-iniettato l'atmosfera e, prima di riprendere l'incubazione, ripetere il campionamento dell'atmosfera dalla camera di vetro a 60, 90 e 120 minuti.Analizzare questi campioni di anidride carbonica atmosferica per valutare l'arricchimento in carbonio marcato utilizzando uno spettrometro di massa per rapporti isotopici gassosi, come descritto nel testo del protocollo. Gli isotopi stabili vengono efficacemente incorporati entro due ore nei vermi adulti giovani, come dimostrato qui dal carbonio marcato rilevato nell'anidride carbonica atmosferica e nell'anidride carbonica disciolta nei vermi, alimentati sia con OP50 E. coli vivo sia con OP50 E. coli ucciso mediante irraggiamento UV. Il rapporto tra anidride carbonica con carbonio 13 e anidride carbonica con carbonio 12 è risultato maggiore nella frazione di anidride carbonica disciolta nei vermi rispetto a quella rilasciata nell'atmosfera. È stato osservato che un'esposizione prolungata a un isotopo stabile a partire dal periodo larvale, seguita da un lavaggio dei vermi su agar NGM privo di batteri, aumenta l'arricchimento isotopico del glutammato libero nei vermi adulti giovani.In questo grafico, L1 rappresenta vermi alimentati con glucosio marcato universalmente al carbonio 13 e batteri OP50 dallo stadio larvale L1 fino allo stadio di adulto giovane a 959 cellule; YA rappresenta vermi alimentati con glucosio al carbonio 13 e batteri OP50 per 48 ore a partire dal primo giorno della deposizione delle uova, allo stadio di adulto giovane. L'asse X indica il numero totale di atomi di carbonio marcati in ciascuna specie di glutammato, e l'asse Y indica il percentuale di arricchimento. Tutti gli animali sono stati sottoposti a rimozione dell'eccesso di marcatura isotopica prima della preparazione del campione per le analisi successive.Per le analisi GCMS, le barre verdi indicano vermi depurati dopo l'esposizione isotopica mediante alimentazione con E. coli OP50 su piastre NGM per due ore prima dell'estrazione con PCA. Le barre blu e grigie indicano vermi depurati dopo l'esposizione isotopica su piastre NGM senza batteri per due o sei ore rispettivamente prima dell'estrazione con PCA, indipendentemente dal tempo di esposizione isotopica. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nell'arricchimento isotopico dei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati depurati sulle piastre per due o sei ore.In entrambi i percorsi di esposizione isotopica, si è osservato un minore arricchimento isotopico nei metaboliti intermedi quando gli animali sono stati depurati nutrendoli con batteri non marcati per due ore. Pertanto, il protocollo di depurazione ottimale per i vermi coltivati su piastre NGM con batteri e isotopo è stato determinato in due ore di depurazione su piastre NGM senza batteri, al fine di ottimizzare la percentuale di arricchimento nei metaboliti intermedi. Successivamente al trattamento per 24 ore in coltura liquida con un glucosio marcato al carbonio 13 a sei atomi di carbonio in assenza di batteri.È stato effettuato un confronto tra campioni di vermi sottoposti a rottura mediante sonicazione soltanto o sonica游戏副本Questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca sulle malattie mitocondriali, permettendo di esplorare il flusso metabolico intermedio in *Caenorhabditis elegans*. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il profilo isotopico stabile del metabolismo intermedio e del flusso metabolico nei nematodi, *C. elegans*.

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Per studiare la relazione tra omeostasi proteica, stress e invecchiamento, abbiamo monitorato i cambiamenti nel ripiegamento delle proteine seguendo la disfunzione proteica, la localizzazione delle proteine nella cellula e la stabilità delle proteine a livello di organismo, cellulare e proteico, utilizzando il metazoo geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans come sistema modello.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans come sistema modello per studiare l'omeostasi proteica in un organismo multicellulare

Qui viene mostrato come tracciare e quantificare i processi di sviluppo in C. elegans. I metodi presentati si basano su strumenti open source che possono essere facilmente implementati. Viene dimostrato come ricostruire modelli 3D di forma cellulare, come tracciare manualmente le strutture subcellulari e come analizzare il flusso contrattile corticale.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Qui dettagliamo i protocolli specificamente progettati per monitorare i difetti morfogenici che si verificano durante le fasi precoci e tardive dell'allungamento embrionale del nematode Caenorhabditis elegans. In definitiva, questi protocolli sono progettati per identificare i geni che regolano queste fasi e per caratterizzare i loro requisiti differenziali lungo l'asse antero-posteriore dell'embrione.

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

L'approccio di marcatore trofica dell'acido grasso, vale a dire, l'assimilazione degli acidi grassi come intera molecola e trasferimento nel tessuto dei consumatori con no o minori modifiche, è ostacolata da lacune nel metabolismo dell'acido grasso di invertebrati del suolo piccolo. Isotopologue profilatura viene fornito come un prezioso strumento per districarsi tra interazioni trofiche.

Acido grasso 13C Isotopologue profilatura fornisce approfondimenti trasferimento trofico carbonio e metabolismo dei lipidi dei consumatori invertebrati marini

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell'attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.

Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Scopri il profilo isotopico stabile del flusso metabolico intermedio in Caenorhabditis elegans. Questo metodo permette di monitorare alterazioni metaboliche in tempo reale e quantificare variazioni genetiche e farmacologiche nei nematodi.

Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans

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