Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Sono Lindsay Garver e sono una studentessa di dottorato nel laboratorio del Dott. George Dimopoulos presso la Johns Hopkins School of Public Health. Oggi vi mostrerò come eseguire il silenziamento mediato da RNAi di geni mediante una tecnica di iniezione. Il primo passo consiste nel raccogliere le zanzare che andremo a iniettare.

Questi sono semplici esemplari di Gabi, un ceppo misto di maschi e femmine. E questo è il nostro aspiratore alimentato a batteria.

Al suo interno è presente un ventilatore, che crea un'aspirazione, attirando le zanzare attraverso questa bocchetta fino al serbatoio. Quindi scollichiamo. Abbiamo una piccola porta di accesso, che di solito viene sigillata con del nastro per mantenere le zanzare all'interno, ma la apriamo, inseriamo la bocchetta, l'accendiamo e la utilizziamo per la raccolta.

Una volta che abbiamo le zanzare all'interno, tappiamo la parte superiore della cannula e osserviamo le zanzare nel serbatoio. A questo punto, dobbiamo anestetizzare queste zanzare. Perciò immergiamo il serbatoio in un secchiello pieno di ghiaccio, coperto di ghiaccio, e aspettiamo che le zanzare si abbattano.

Ok, il passo successivo consiste nell'iniettare le zanzare; a tale scopo utilizzeremo questo strumento, un nanojet due. È composto da una parte detta wand, che terrò in mano, e che contiene l'ago attraverso cui verrà erogato il liquido all'interno della zanzara.

Il pannello di controllo, che presenta i nostri pulsanti di riempimento e svuotamento ed è responsabile dell'aspirazione e della fuoriuscita del liquido dall'ago. E poi questo è il supporto con piedini. Verrà posizionato sul pavimento.

E spingendo questo con il mio piede verrà dispensata una goccia del volume appropriato nel morso. Mentre i moscerini sono sul ghiaccio, prepariamo la postazione di lavoro impostando un blocco refrigerato a zero gradi fino a due gradi Celsius. Questo blocco freddo ha un attacco piatto, sul quale è montato un vetrino.

E questo impedirà ai moscerini di muoversi mentre li stiamo manipolando. Prenderò anche uno di questi aghi capillari di vetro. Si tratta semplicemente di un comune tubo capillare di vetro che è stato riscaldato e allungato al centro per formare un ago.

E questo è ciò che conterrà il nostro liquido. Quindi, questo è ciò che useremo per iniettare la zanzara e rilasciare il liquido. La prossima operazione da eseguire consiste nel posizionare l'ago capillare sul nostro strumento per iniezioni.

Rimuoviamo il pezzo nasale. Assicurarsi che gli anelli interni siano posizionati secondo le istruzioni del produttore. Inserire lentamente l'ago di vetro nel pezzo nasale, facendo attenzione alla punta per non romperla.

Una volta assicurata la stabilità, inserire l'ago della bacchetta nell'ago capillare e avvitare saldamente il pezzo anteriore. Il passo successivo consiste nel verificare che l'ago del tubo capillare abbia un diametro adeguato per le iniezioni. Questo è un punto molto importante, poiché un ago troppo sottile non erogherà la quantità corretta di liquido, mentre un ago troppo spesso potrebbe danneggiare la zanzara e causarne eventualmente la morte.

Questo è qualcosa che richiede molta pratica, ma una larghezza adeguata è fondamentale per un'iniezione corretta e per la sopravvivenza delle zanzare. Quello che faccio è utilizzare pinzette fini per rompere la punta dell'ago in modo che rimanga flessibile ma stabile. Abbiamo bisogno del nostro campione di RNA a doppio filamento.

Questo campione è stato preparato utilizzando un kit. Sul mercato esistono diverse tipologie di kit in grado di generare RNA a doppio standard specifici per il gene di interesse. Utilizziamo i nostri RNA a una concentrazione di tre microgrammi per microlitro e abbiamo configurato il nostro sistema di nano-iniezione in modo che ogni iniezione eroghi 69 nanolitri di posizione.

Il tubo ha inserito il nostro ago nel liquido e utilizza il pulsante di riempimento su n eject per aspirare il liquido nell'ago. La quantità di liquido necessaria nell'ago è direttamente proporzionale al numero di zanzare che andrai a iniettare. Va bene? E ora dobbiamo preparare le zanzare.

Prendiamo quindi la nostra piastra di plastica P2 e la immergiamo nel secchio pieno di ghiaccio. Verifichiamo che le zanzare non si muovano e le disponiamo in un sottile strato sulla piastra Petri fredda. Questo garantisce che, durante il lavoro, le zanzare rimangano immobili e non volino via.

Posizioniamo quindi le zanzare sul nostro vetrino, che ora è a zero gradi Celsius. La disposizione delle zanzare è cruciale per il modo in cui le iniettiamo. È quindi necessario disporre le zanzare in modo ordinato, in modo da sapere quali sono state iniettate e quali non lo sono state.

E si desidera anche che vi sia uno spazio sufficiente tra le zanzare in modo da poterle raggiungere con l'iniettore. Pertanto trasferiamo singole zanzare dalla capsula di Petri al vetrino, avendo cura, avendo cura di manipolarle per le zampe. Ciò evita di schiacciare i corpi e porta a una maggiore sopravvivenza.

Ora siamo pronti per effettuare l'iniezione. Utilizziamo una pinzetta a punta fine per sostenere la zanzara da un lato; essendo destro, uso la pinzetta con la mano sinistra. Successivamente, effettuiamo l'iniezione dall'altro lato, inserendo la punta dell'ago nel fianco del torace, in modo che il torace della zanzara rimanga stretto tra le punte della pinzetta e la punta dell'ago, consentendo all'ago di penetrare.

Una volta che la punta dell'ago è all'interno del torace, premere il pedale: si sentirà un segnale acustico e del liquido verrà dispensato nel torace della zanzara. Successivamente, passare alla successiva e ripetere l'operazione. Di tanto in tanto, quando si ritira l'ago, si noterà una goccia di liquido che fuoriesce dal sito di ingresso.

E se ciò accade, allora si può attendere che il liquido venga riassorbito nel sito di ingresso. Se questo avviene, va bene. Se la goccia non viene riassorbita e rimane all'esterno del torace, allora quel morso deve essere scartato e se ne deve iniettare un altro al suo posto.

È inoltre importante assicurarsi che l'ago penetri nel torace solo fino alla profondità necessaria. Non si desidera perforare fino al lato opposto né far passare un'eccessiva larghezza dell'ago. In caso contrario, il torace o la sopravvivenza della zanzara potrebbero essere compromessi.

Pertanto, continuiamo tale procedura per tutte le zanzare secondo necessità. Per conservare le zanzare iniettate, abbiamo utilizzato un bicchiere di cartone rivestito in cera da un pinta, coperto con una sottile rete a maglie fini e chiuso con un elastico e un coperchio di cartone. Abbiamo aperto la porta di accesso, che è coperta con del nastro adesivo, e abbiamo aggiunto con attenzione le nostre zanzare per favorirne la sopravvivenza.

È necessario aggiungere una pallina di cotone imbevuta di una soluzione di saccarosio al 10% che funge da fonte alimentare per le zanzare mentre si trovano qui. E un tovagliolo di carta piegato e umido. Poiché le zanzare ferite tendono a disidratarsi, questo aiuterà a mantenere l'umidità e a favorire la sopravvivenza delle zanzare iniettate.

Aggiungiamo un coperchio di Petri per trattenere l'umidità, in modo che la carta da filtro e le palline di cotone rimangano bagnate. Quindi incubiamo il tutto in condizioni ambientali normalmente controllate. Le cinetiche molecolari della silenziamento genico mediato da RNAi variano notevolmente da gene a gene.

Pertanto, per alcuni geni, il silenziamento può avvenire entro un giorno, mentre per altri geni un silenziamento efficiente richiederà diversi giorni. Le differenze tra ciascun gene possono essere misurate mediante PCR quantitativa in tempo reale, che permetterà di monitorare i livelli di trascritto nei vostri zanzare e indicherà quando è stato raggiunto un silenziamento efficiente. Pertanto, consiglierei di mettere da parte alcune delle zanzare iniettate a tale scopo.

Questo ti aiuterà anche a determinare quanto siano efficienti in generale i tuoi RNA a doppio filamento, e se i tuoi specifici RNA a doppio filamento possono ottenere un silenziamento efficiente. E se in effetti stai interferendo con i livelli di trascritto, ti ho appena mostrato la procedura per il silenziamento genico mediato da RNAi nei moscerini Anopheles gambiae. Questa procedura prevede l'iniezione microscopica di RNA a doppio filamento nel torace dei moscerini Anopheles gambiae.

Questa procedura è importante perché è uno dei metodi più semplici ed efficaci per manipolare singoli geni nelle zanzare.