Name: Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Impara il silenziamento genico mediato da RNAi nelle zanzare Anopheles gambiae mediante microiniezione di dsRNA nel torace. Questo metodo consente di studiare la funzione genica e la resistenza ai patogeni della malaria.

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RNAi mediato silenziamento genico nelle zanzare richiede una preparazione preventiva e la purificazione della dsRNAs specifici che colpiscono il gene di interesse. Per la sintesi di dsRNA, si consiglia il kit Megascript Ambion che si avvale di un RNA polimerasi T7-mediata reazione di trascrizione in vitro. Per la purificazione dsRNA, si consiglia il kit Qiagen RNeasy. Campioni di dsRNA devono essere quantificati e regolata a 3 g / mL in acqua. Altri materiali è necessario includere: punta fine pinze, vetrino, aghi di vetro microcapillare, microinjector (usiamo Drummond Nanoject II), un microscopio ottico montato sopra un blocco freddo, una coperta piatto di vetro Petri, asciugamani di carta e un secchio di ghiaccio . Sarà inoltre necessario un modo per raccogliere le zanzare e un contenitore adeguato per loro insieme a una fonte di cibo come il batuffolo di cotone imbevuto di 10% di saccarosio. <ol><li> Raccogliere i vostri zanzare. Usando una batteria aspiratore, raccogliere le zanzare si vuole iniettare. Inserire l&#39;ugello con un tovagliolo di carta o cotone per cui non può sfuggire zanzare e rimuovere il serbatoio. Dal momento che temperature fredde anestetizzare le zanzare, seppellire il serbatoio in un secchio di ghiaccio e aspettare 5-10 minuti per le zanzare a smettere di muoversi. Anestesia può essere ottenuto anche mettendo il serbatoio in una stanza fredda o frigorifero o utilizzando CO 2. Durante questi 5-10 minuti, passare alla fase successiva. </li><li> Preparare l&#39;area di lavoro. Impostare un blocco piatta superficie fredda a 2 ° C e mettere un vetrino su di esso. Questo è dove le zanzare si riposerà come li iniettare. Inserire un ago di vetro sul microinjector e utilizzare il forcipe per rompere la punta dell&#39;ago alla larghezza desiderata. E &#39;importante che la larghezza è abbastanza grande per lasciare spazio sufficiente per liquido di fluire attraverso a un tasso ragionevole, ma è abbastanza stretto per infliggere una ferita minima durante l&#39;iniezione. Una punta dell&#39;ago bene sarà abbastanza stretto da piegare leggermente ma non si rompe. Impostare la vostra attrezzatura di iniezione per il volume di uscita desiderato (per RNAi, usiamo 69 nL). Immergere la punta del ago nella campione e disegnare il campione liquido nel ago utilizzando le istruzioni del produttore. Il campione di liquido può essere una soluzione dsRNA, sospensione batterica, o altro, il processo di iniezione è lo stesso per tutti. Incorpora un piatto di vetro Petri nel secchiello del ghiaccio in modo che il fondo del piatto è completamente contatto con il ghiaccio. Questo è dove si metteranno le zanzare finché non si è pronti a iniettare loro. </li><li> Preparare il zanzare. Transfer 50-100 zanzare dal serbatoio al piatto di vetro Petri. Usa la tua pinza sottile per loro di un unico strato, assicurandosi la maggior parte hanno contatto con il fondo del piatto freddo per tenerli anestetizzati. Coprire queste zanzare con il piatto coperchio quando non in uso. Riportare il serbatoio per il contenitore del ghiaccio per mantenere il resto delle zanzare anestetizzato. </li><li> Montare le zanzare sul blocco freddo. Usa la tua punta fine pinze per trasferire le zanzare uno alla volta dal piatto al vetrino montato sul blocco freddo sotto il microscopio ottico. Gestire le zanzare con delicatezza, preferibilmente entro le gambe. Line up fino a 30 zanzare fianco a fianco sul vetrino, facendo attenzione si può arrivare a ognuno con la microinjector e assicurandosi che ognuno entra in contatto con la diapositiva freddo. Assicurati che il tuo zanzare sono allineate in modo ordinato, che come si va avanti si sa che hanno e che non sono state iniettate. Lascia altre zanzare coperto il piatto freddo Petri. </li><li> Iniettare il primo gruppo di zanzare. Tenere il forcipe punta a punta fine in una mano e tenere la microinjector nell&#39;altra mano come una matita. Utilizzare le pinze per spostare la zanzara di cui hai bisogno (gestirli per le gambe per evitare ferite) e di mantenere la zanzara costante durante l&#39;iniezione. Questo funziona meglio se si utilizza il forcipe per supportare un lato della zanzara durante l&#39;iniezione dalla parte opposta. Inserire con attenzione solo la punta ago nel torace zanzara. E &#39;meglio per iniettare in una parte ancora tesa sottile della cuticola per minimizzare il danno. Inoltre, evitare di iniettare troppo profondamente, si vuole solo la punta di essere all&#39;interno del torace; più iniezioni di causa maggiore ferite che compromette la sopravvivenza. Una volta che la punta dell&#39;ago è in posizione, premere e rilasciare il pedale dell&#39;apparato microinjector che consegnerà il vostro volume preimpostato di dsRNA. Aspetta un secondo o due e togliere l&#39;ago dalla zanzara. Se una goccia di liquido appare al di fuori della ferita, attendere qualche secondo per essere assorbiti nella ferita. Se non assorbe in pochi secondi, scartare tale zanzara e riprovare. Continua il processo di iniezione per tutti zanzare sul vetrino. </li><li> Memorizzare le zanzare. Quando hai finito, inserire il vostro zanzare iniettato all&#39;interno di contenitori etichettati (noi preferiamo 1 pinta di cera alberato bicchieri di carta coperta damaglia metallica e fissato con elastici e un coperchio di cartone). </li><li> Continuare le iniezioni fino al termine. Continuare a posto le zanzare sul vetrino, iniettare e trasferimento in tazze fino ad avere la dimensione del campione che si desidera. Conto di alcune morti per principianti avrà molte zanzare muoiono per il trauma della iniezione. Ciò permetterà di migliorare con la pratica fino a quasi il 100% della vostra zanzare sopravvivono iniezione. </li><li> Al termine, mettere un piegata, asciugamano bagnato di carta sopra la coppa insieme a una fonte di cibo e coprire le tazze con qualcosa per trattenere l&#39;umidità, come involucro di plastica o un coperchio di plastica Petri. Zanzare iniettato sono inclini a seccarsi così l&#39;umidità fornita dal asciugamano bagnato e mantenuto dalla plastica contribuisce a prevenire questo. </li><li> Inserire il vostro zanzare in una camera ambiente controllato per l&#39;incubazione. </li></ol> Nota: L&#39;efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine ​​tassi di turn-over, e l&#39;efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dal 1 ° giorno dopo l&#39;iniezione, e può durare fino a 6 giorni dopo l&#39;iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere. Nota: Ci sono parecchie variazioni su diverse fasi di iniezione zanzara e RNAi mediato tecnica di silenziamento genico. Alcune varianti sono descritti da: Boisson, et al (2006) e Blandin, et al (2002)...

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

Efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine ​​turn-over tassi ed efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dopo 1 iniezione al giorno e può durare fino a 6 giorni dopo l&#39;iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere.

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td></td><td>per la sintesi di RNA a doppio filamento; reazione di trascrizione in vitro mediata da RNA polimerasi T7</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>Per la purificazione di RNA a doppio filamento</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>deve essere quantificato e aggiustato a 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L in acqua</td></tr><tr><td>pinzette con punta fine</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vetrino in vetro</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ago capillare in vetro</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microiniettore</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>microscopio ottico</td><td></td><td></td><td></td><td>montato sopra un blocco freddo</td></tr><tr><td>piastra di Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>coperta, in vetro</td></tr><tr><td>carta assorbente</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>saccarosio al 10%</td><td>alimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>Animale</td><td></td><td></td><td>zanzare</td></tr></tbody></table>

protocollo per saggi rnai in zanzare adulte (a. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Gli approcci di genetica inversa si sono rivelati estremamente utili per determinare quali geni siano alla base della resistenza ai patogeni trasmessi da vettori nelle zanzare. Questo video...

Sono Lindsay Garver e sono una studentessa di dottorato nel laboratorio del Dott. George Dimopoulos presso la Johns Hopkins School of Public Health. Oggi vi mostrerò come eseguire il silenziamento mediato da RNAi di geni mediante una tecnica di iniezione. Il primo passo consiste nel raccogliere le zanzare che andremo a iniettare.Questi sono semplici esemplari di Gabi, un ceppo misto di maschi e femmine. E questo è il nostro aspiratore alimentato a batteria.Al suo interno è presente un ventilatore, che crea un'aspirazione, attirando le zanzare attraverso questa bocchetta fino al serbatoio. Quindi scollichiamo. Abbiamo una piccola porta di accesso, che di solito viene sigillata con del nastro per mantenere le zanzare all'interno, ma la apriamo, inseriamo la bocchetta, l'accendiamo e la utilizziamo per la raccolta.Una volta che abbiamo le zanzare all'interno, tappiamo la parte superiore della cannula e osserviamo le zanzare nel serbatoio. A questo punto, dobbiamo anestetizzare queste zanzare. Perciò immergiamo il serbatoio in un secchiello pieno di ghiaccio, coperto di ghiaccio, e aspettiamo che le zanzare si abbattano.Ok, il passo successivo consiste nell'iniettare le zanzare; a tale

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Questo video illustra le tecniche generali utilizzate per posteriore Anopheles gambiae in laboratorio. I metodi per la cura per le zanzare di laboratorio sono dimostrati in tutte le fasi del ciclo di vita dell'organismo da larve di pupe al sangue al seno adulti.

Protocollo per la cura dei Mosquito (A. gambiae)

In questo protocollo si combinano RNAi-mediato silenziamento genico con...

RNAi-mediato Knockdown Gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio La diuresi in femmina adulta<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Le zanzare

Le analisi dell'RNA-Seq stanno diventando sempre più importanti per identificare le basi molecolari dei tratti adattativi negli organismi non modello. Qui, viene descritto un protocollo per identificare i geni differenzialmente espressi tra zanzare Aedes albopictus in diapausa e non in diapausa, dall'allevamento delle zanzare, al sequenziamento dell'RNA e alle analisi bioinformatiche dei dati RNA-Seq.

Un Sperimentale e Bioinformatica Protocollo per analisi di RNA-Seq di photoperiodic diapausa nella zanzara tigre, Aedes albopictus

Le zanzare che trasmettono la malaria hanno una serie di caratteristiche epidemiologicamente importanti che possono essere rilevate solo utilizzando tecniche molecolari. Utilizzando una piattaforma di genotipizzazione SNP basata su MALDI-TOF, abbiamo sviluppato un test per rilevare simultaneamente più tratti chiave (specie, resistenza agli insetticidi, infezione da parassiti e scelta dell'ospite) dei vettori della malaria.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Questo protocollo descrive una metodologia di microiniezione che abbiamo standardizzato e usati per diversi anni per fornire determinate quantità di acidi nucleici direttamente all'emolinfa di zanzare e mosche di casa. Questo protocollo risulta in una iniezione minima mortalità e consente di effettuare misure di dose correlato della fecondità.

Riproducibile dsRNA Microinjection e analisi biologica di deposizione delle uova di zanzare e mosche domestiche

Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile per la modifica dell'espressione genica in modo spaziotemporale controllato che consente l'analisi genetica funzionale in Anopheles gambiae. Le procedure descritte per l'utilizzo di questo sistema sono una strategia di clonazione semi-standardizzata, sexing e screening delle pupe per marcatori proteici fluorescenti e fissazione dell'embrione.

Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

Questo protocollo fornisce le fasi dall'estrazione del DNA al set-up sperimentale per la PCR a goccia digitale (ddPCR), compresa l'analisi per l'identificazione e la quantificazione di eventi di giunzione finale non omologa (NHEJ) nei siti bersaglio a seguito di scissione Cas9 indotta da gRNA e riparazione del DNA. Altri usi di questo metodo includono applicazioni come il rilevamento del polimorfismo e la verifica delle varianti di modifica genetica.

Digital-Droplet PCR per rilevare mutazioni di Indels in popolazioni di zanzare anofeline geneticamente modificate

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.

Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

Impara il silenziamento genico mediato da RNAi nelle zanzare Anopheles gambiae mediante microiniezione di dsRNA nel torace. Questo metodo consente di studiare la funzione genica e la resistenza ai patogeni della malaria.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

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