Name: Un modello murino di Nellutero Trapianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri il trapianto in utero nel topo per studiare terapie con cellule staminali e terapia genica. Questo metodo consente di analizzare l'innesto cellulare e l'espressione genica nel feto, sfruttando il sistema immunitario immaturo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo riconoscere le nostre fonti di finanziamento: Il California Institute for Training rigenerativa di Grant Fellow Medicina Clinica (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association ( TCM), e il March of Dimes (TCM).

1. Preparazione del Pipette iniezione <ol><li> Calibrare l'estrattore pipetta in modo tale che la separazione della pipetta di vetro avviene entro 15 secondi (vedere le istruzioni del produttore per quanto riguarda la taratura). La pipetta avrà un cono in cui separa. </li><li> Tagliare l'estremità della pipetta in modo che la distanza dall'inizio del cono fino alla fine della pipetta è 1,04 centimetri a 1,05 centimetri. La lunghezza della pipetta è inversamente proporzionale al calibro dell'orifizio pipetta. Essere consapevoli del fatto che per fare una pipetta di più provoca anche una punta più debole che è più suscettibile alle rotture durante l'iniezione. </li><li> Il prossimo passo per rendere la pipetta è quello di creare uno smusso liscia da affilare la punta di diamante su una ruota affilatura. Al momento del taglio della pipetta alla dimensione del caso, la pipetta rompe spesso con uno smusso naturale sulla punta che deve essere usata quando si inserisce la pipetta sulla ruota. Durante questo processo, è importante riposare delicatamente la pipetta sulla ruota affilatura e rivalutare periodicamente per assicurarsi che la pipetta è ancora in contatto con la ruota (come la smussatura diventa più liscia, perderà il contatto con la ruota sharpening). </li><li> Una volta che la coppia conica è liscia, la punta della pipetta deve essere affilato (Figura 1). Elevare la pipetta in modo tale che non è più toccando la ruota affilatura, ruotare in senso orario con 10-50 gradi, e posto sul retro pipetta sulla ruota girevole affilatura per ~ 10 secondi. Ritirare la pipetta dalla ruota affilatura e ora esaminare il bordo. Questa fase di solito deve essere ripetuto con diversi piccoli aggiustamenti per creare un bordo tagliente. Se la pipetta è posizionato sul bordo per troppo tempo, è più probabilità di sviluppare una superficie irregolare (Figura 1). Dopo aver completato un lato, si può procedere per affinare il bordo opposto ripetendo i passaggi precedenti. </li><li> Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare una linea circonferenziale ogni quattro millimetri di partenza dove il cono della pipetta comincia. Tale delimitazione corrisponde a 5UL di volume. </li></ol> 2. Nell'utero trapianto <ol><li> Dopo aver preparato il materiale iniettabili (per esempio le cellule, virus, ecc) è possibile impostare per l'iniezione. Usiamo un microinjector collegato ad aria compressa con le seguenti impostazioni: (impostazioni di pressione: ingresso 60-80 psi, riempire 40 psi, iniettare 8-12 psi, equilibrio 0 psi, tenere premuto 0 psi, il tempo di iniezione 100 millisecondi). </li><li> Per sterilizzare la pipetta di iniezione, pulire due volte con EtOH 70% seguita da due volte con PBS 1X sterile. Come la punta della pipetta è molto fragile, si sconsiglia di sterilizzazione in autoclave le pipette di iniezione. </li><li> Le iniezioni possono essere fatto usando 2.5X-3.5X occhialini ingrandimento o un microscopio da dissezione. Preparare l'area di procedura con una coperta il riscaldamento, l'illuminazione e gli strumenti chirurgici necessari. </li><li> Anestetizzare il mouse in stato di gravidanza (che utilizziamo isofluorano e ossigeno forniti tramite una unità di anestesia continua di flusso). Posizionare il mouse su una piastra elettrica in posizione supina e apporre ogni arto con del nastro adesivo per fissare il mouse in posizione. </li><li> Agganciare il pelo. Poi, indossando guanti chirurgici sterili, preparazione l'addome con 10% di povidone-iodio seguito da alcol, e iniettare un analgesico come la buprenorfina. </li><li> Eseguire un'incisione 1 centimetro nel basso addome (l'aspetto più inferiore della incisione dovrebbe essere di circa 1 centimetro superiore alla introitus). Incidere la pelle e la fascia. Fare attenzione a non danneggiare gli organi addominali (intestino e vescica), che sono immediatamente sotto lo strato sottile di fascia. </li><li> Utilizzando tamponi di cotone, delicatamente allungare la fascia e fornire l'utero gravido attraverso l'incisione. Contare il numero totale di feti per prima cosa identificare le ovaie a destra ea sinistra per essere sicuri di visualizzare l'intero utero. Posto l'utero indietro nella cavità addominale prima di procedere in modo che i feti restano caldo mentre si prepara per le iniezioni. </li><li> Aspirare il volume appropriato di materiale per il numero di feti si prevede di iniettare. Mentre si riempie l'ago con il campione, è importante mantenere la punta della pipetta sommersa per evitare aspirare il campione nel tubo microinjector. Dato che le cellule sono generalmente in un piccolo volume, di solito loro posto in una microcentrifuga di piccole dimensioni (es: 0,5 ml), tubo o direttamente su un pezzo di Parafilm essere in grado di riempire l'ago senza rompere la punta della pipetta. </li><li> Premere delicatamente ogni feto e identificare la parte del feto si prevede di iniettare (ad esempio il fegato, cavità peritoneale, gamba, ecc.) Con il pollice e l'indice, è necessario stabilizzare il feto nella cavità amniotica in modo che non ruoti mentre si sta eseguendo l'iniezione. E 'importante tenere il feto con fermezza sufficiente a stabilizzarlo ancora abbastanza delicatamente per evitare di danneggiarlo. </li><li> Inserire con cautela la pipetta attraverso l'utero, amnios, e la pelle del feto, e in l'organo bersaglio. Se la pipetta è tagliente, dovrebbe passare facilmente attraverso questi tessuti. Se la punta della pipetta è noiosa, è wi ll tenting avviso di dell'utero e delle membrane amniotiche. Iniettare il volume desiderato in ogni feto. E 'imperativo che i vostri movimenti essere costante durante il periodo di inserimento, l'iniezione, e il ritiro della pipetta. </li><li> Una volta che il volume desiderato viene iniettato, ritirare la pipetta con attenzione. Se fatto correttamente, materiale non deve fuoriuscire dalla cavità amniotica o dell'utero. Se un grande buco viene creato nel sacco amniotico, che si può riconoscere dalla fuoriuscita di liquido amniotico, poi la sopravvivenza è messa a repentaglio. Infine, per gli studi che prevedono la raccolta post-natale, tutti i feti devono ricevere iniezioni tecnicamente perfetto in quanto non c'è modo di distinguere i feti iniettato e uninjected dopo la nascita. </li><li> Se si esegue iniezioni nel fegato fetale, si può occasionalmente vede del sangue nella punta della pipetta, dopo il ritiro, questo conferma che sono nella posizione corretta e non dovrebbe pregiudicare la sopravvivenza. Se si esegue iniezioni intra-peritoneale, hanno lo scopo leggermente al di sotto del fegato fetale. Per le iniezioni intramuscolari, è possibile posizionare il feto per identificare l'anca e femore e iniettare il muscolo gluteo. Infine, per preparazioni iniettabili intraventricolare, è facile vedere i punti di sutura coronale per dirigere la pipetta al bersaglio appropriato. Per queste iniezioni, pipette calibro leggermente più grandi sono necessari per penetrare il cranio senza rompere la pipetta. </li><li> Successivamente, con cura posto l'utero indietro nella cavità addominale. Assicurarsi che non sia attorcigliata su se stessa o attorno al suo apporto vascolare. Consegna 1 ml di PBS 1X sterile nella cavità peritoneale della madre per sostituire qualsiasi fluido che è stato perso durante la procedura. Chiudere l'incisione a 2 strati con una sutura assorbibile intrecciata 5-0 (es: Vicryl). Prima chiudere la fascia senza ferire l'intestino o vescica sottostante, e quindi chiudere la pelle. </li><li> A questo punto, dopo la procedura di farmaci possono essere somministrati per l'analgesia. Ritorno ogni femmina iniettato nella sua gabbia individuale e posizionare la gabbia in una coperta riscaldamento. Monitorare il mouse fino a quando non è in posizione verticale. Mettere biancheria da letto nella gabbia e posizionare il mouse in una zona tranquilla della struttura del mouse dove non dovrebbe essere disturbato (cioè non la pulizia della gabbia) fino a diversi giorni dopo il parto. Riducendo al minimo qualsiasi ulteriore stress per l'animale si riduce la probabilità di parto pretermine. </li><li> Una volta completato l'iniezione, pulire la pipetta sterile due volte con PBS 1X ed una volta con il 70% EtOH. </li><li> Femmine iniettare deve essere osservato ogni giorno per assicurare che si stanno riprendendo dalla procedura senza difficoltà. L'incisione devono essere monitorati per gonfiore, infiammazione segni, la separazione delle ferite, e altre infezioni. Post-operatorio analgesici possono essere somministrati, se necessario. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: La sopravvivenza dei feti iniettato a termine la consegna è il principale fattore limitante per raggiungere il successo con questa tecnica. A seconda del materiale iniettato e la tensione di mouse utilizzato, i tassi di sopravvivenza può variare. In generale, le iniezioni di cellule ematopoietiche in topi wild-type a E14 dovrebbe tradursi in almeno il 50% nati vivi cuccioli. Alti tassi di sopravvivenza sono possibili a seconda sia gli aspetti tecnici della iniezione e le caratteristiche dei topi viene iniettato. Ridurre al minimo il trauma per le membrane dell'utero e amniotico è l'aspetto più importante tecnica di questo protocollo. Sharp, pipette di piccolo calibro si tradurrà in minimo trauma uterina durante l'iniezione. Si consiglia di non utilizzare aghi da iniezione standard del calibro di prefabbricati aghi è troppo grande e si tradurrebbe in un grande buco in utero. Fatti a mano pipette iniezione di vetro sono gli unici aghi di piccolo calibro che possono essere utilizzati per iniezioni in utero. Un'attenta e meticolosa tecnica chirurgica, compresa la gestione delicata dell'utero e una breve anestesia è fondamentale anche per ottenere risultati ottimali. Caratteristiche specifiche dei topi riceventi come il background genetico, l'età gestazionale, e la dimensione cucciolata può colpire anche la sopravvivenza. Alcuni ceppi di topi sono più suscettibili di parto pretermine e la perdita di gravidanza, a seconda del loro background genetico. 15 animali transgenici con difetti muscolari o neurodegenerative può avere una ridotta capacità di offrire feti vaginale dopo aver subito una laparotomia mediana. 8 Queste donne in gravidanza può richiedere la consegna da parte taglio cesareo. Abbiamo anche scoperto che l'età gestazionale al momento della iniezione può impatto vitalità. Feti che sono di età inferiore ai 12 giorni embrionali hanno una minore incidenza di sopravvivenza rispetto ai vecchi feti. Infine, abbiamo trovato che le dimensioni dei rifiuti di grandi dimensioni (&gt; 10 feti) tendono ad avere più alti tassi di morte del feto dopo l'iniezione. Attenzione sia gli aspetti tecnici di questa tecnica e le caratteristiche specifiche dei topi essere iniettato in grado di massimizzare la sopravvivenza dei feti iniettato. ve_content "&gt; Quando questi metodi vengono eseguite correttamente, ci si può aspettare che tutti i feti sono esposti al materiale iniettato. Simile l'impostazione post-natale, tuttavia, la consegna di successo di cellule o virus in utero non sempre risultato attecchimento delle cellule del donatore o gene espressione, rispettivamente. attecchimento delle cellule staminali, per esempio, dipende da diversi fattori quali la dose e la fonte delle cellule trapiantate. Allo stesso modo, il successo di trasduzione virale è, in parte, determinata dal tipo di vettore virale usato. Si deve capire i numerosi fattori che la sopravvivenza impatto cucciolo, attecchimento cellulare e trasduzione virale per raggiungere il successo con questo protocollo. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma raffigurante corretta affilatura delle pipette di iniezione (Punto 1.4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
<li>Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchimerism+and+tolerance+after+in+utero+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice.</a> J Surg Res. 77, 1-5 (1998).</li>
<li>Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chimerism+threshold+predicts+sustained+engraftment+and+NK-cell+tolerance+in+prenatal+allogeneic+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras.</a> Blood. 112, 5245-5253 (2008).</li>
<li>Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+bone+marrow+and+fetal+liver+cells+after+in+utero+transplantation+in+MDX+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice.</a> J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).</li>
<li>Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+following+in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+murine+models+of+hemoglobinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy.</a> Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).</li>
<li>Bouchard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+in+cardiac+and+skeletal+muscle+following+fetal+administration+of+adenoviral+or+adeno-associated+viral+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice.</a> J Gene Med. 5, 941-950 (2003).</li>
<li>Meza, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+pyruvate+kinase+deficiency+in+mice+by+gene+therapy+using+the+human+isoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme.</a> Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+liver+and+muscle+after+in+utero+injection+of+lentiviral+vectors+with+different+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes.</a> Mol Ther. 6, 349-358 (2002).</li>
<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Oltre 50 anni fa, Billingham, Brent e Medawar utilizzati in utero trapianto nei topi per indurre tolleranza immunitaria a proteine ​​estranee. 16 Da allora, diverse varianti di questa tecnica sono stati utilizzati per affrontare le questioni in immunologia e la biologia delle cellule staminali. Il protocollo dettagliato qui è uno dei metodi più accessibile per IUT. Il fegato fetale propone un obiettivo facilmente visualizzati e fornisce l&#39;accesso alla circolazione sis...

<table><tbody><tr><td>Pipette</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di pipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello P-30</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatore</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Affilatore di pipette</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modello BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino di nell&#39;utero trapianto

A Mouse Model of in Utero Transplantation

Il trapianto di cellule staminali in utero e virus ha un potenziale enorme per il trattamento di malattie congenite nel feto umano. Per esempio, nel trapianto di utero (IUT) di cellule staminali ematopoietiche è stato usato per trattare con successo pazienti con grave immunodeficienza combinata 1,2. In altre condizioni, tuttavia, IUT è stata tentata senza successo. 3 Alla luce di questi risultati contrastanti, la disponibilità di un efficiente non umani modello per studiare le conseguenze biologiche del trapianto di cellule staminali e la terapia genica è fondamentale per far avanzare questo campo. Noi e altri ricercatori hanno utilizzato il modello murino di IUT di studiare fattori che influenzano il successo di attecchimento in utero trapiantato cellule staminali ematopoietiche in entrambi i topi wild-type 4-7 e quelli con malattie genetiche. 8,9 L&#39;ambiente fetale offre anche notevoli vantaggi per l&#39; successo della terapia genica in utero. Per esempio, la consegna di adenovirali 10, virale adeno-associato 10, retrovirali 11 e vettori lentivirali 12,13 nel feto ha portato alla trasduzione degli organi più distanti dal sito di iniezione a lungo termine l&#39;espressione genica. Nell&#39;utero La terapia genica può quindi essere considerato come una possibile strategia di trattamento per i disturbi del singolo gene come la distrofia muscolare o la fibrosi cistica. Un altro potenziale vantaggio del IUT è la capacità di indurre tolleranza immunitaria ad un antigene specifico. Come si è visto nei topi affetti da emofilia, l&#39;introduzione del fattore IX presto risultati di sviluppo della tolleranza a questa proteina 14. In aggiunta al suo utilizzo nelle indagini potenziali terapie umane, il modello murino di IUT può essere un potente strumento di riflessione su questioni di base in biologia cellulare e dello sviluppo staminali. Per esempio, si possono fornire diverse piccole molecole di indurre o di inibire l&#39;espressione del gene specifico a definire le fasi di gestazione e manipolare i percorsi di sviluppo. L&#39;impatto di queste alterazioni possono essere valutate in punti temporali diversi dopo il trapianto iniziale. Inoltre, si possono trapiantare pluripotenti o lignaggio cellule progenitrici specifici nell&#39;ambiente fetale per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un ambiente host non irradiato e imperturbabile. Il modello murino di IUT ha già fornito numerose intuizioni nei settori di immunologia e biologia cellulare e dello sviluppo staminali. In questo video basato su protocollo, si descrive passo-passo approccio a svolgere IUT in feti di topo e indicare le tappe critiche e potenziali insidie ​​di questa tecnica.

Il modello murino di<em&gt; In utero</em&gt; Trapianto è uno strumento versatile che può essere utilizzato per studiare le potenziali applicazioni cliniche di trapianto di cellule staminali e la terapia genica nel feto. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio generale di eseguire questa tecnica

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

Il trapianto di cellule staminali e di virus in utero possiede un potenziale enorme per il trattamento di disturbi congeniti nel feto umano. Per esempio, in...

L'obiettivo generale di questa procedura è trapiantare cellule o virus nei feti di topo. In primo luogo, effettuare un'incisione sulla faccia ventrale del topo. Successivamente, esteriorizzare l'utero e i feti, quindi eseguire le iniezioni in utero.Infine, reinserire delicatamente l'utero nella cavità peritoneale e chiudere la fascia addominale e la cute. Alla fine, si possono ottenere risultati che dimostrano l'attecchimento cellulare o l'espressione genica mediante citometria a flusso PCR o immunohistochimica nel trapianto di cellule staminali e nella terapia genica uterina. Grazie alle nostre strategie innovative per il trattamento di malformazioni congenite prima della nascita, possiamo sfruttare l'immaturità del sistema immunitario fetale per indurre tolleranza verso cellule allogeneiche o verso proteine esogene.Il modello murino di trapianto in utero ci permette di studiare i fattori biologici specifici del feto che portano all'induzione di una tolleranza all'innesto. Questa tecnica sarà ora dimostrata da Amer Nial, chirurgo e ricercatore postdottorando nel mio laboratorio. La preparazione delle pipette per iniezione inizia tirando pipette di vetro mediante un tiratore di pipette precedentemente calibrato per ottenere la separazione della pipetta.Entro 15 secondi, posizionare la pipetta nel tiratore di pipette e fissarla in sede utilizzando le morse superiore e inferiore. Successivamente, premere il pulsante di trazione. Il filamento si riscalderà e la pipetta si separerà.La pipetta avrà un restringimento in corrispondenza del quale va tagliata l'estremità, in modo che la distanza tra l'inizio del restringimento e la fine della pipetta sia compresa tra 1,04 e 1,05 centimetri. Poiché la lunghezza della pipetta è inversamente proporzionale al calibro dell'orifizio della pipetta, realizzare una pipetta più lunga comporta un'estremità più debole, più soggetta a rottura durante l'iniezione e potenzialmente in grado di compromettere la sopravvivenza del feto murino iniettato.Per creare un bisellatura uniforme, la punta della pipetta deve essere affilata su una ruota affilatrice al diamante. Accendere la ruota, quindi abbassare delicatamente la pipetta sulla ruota affilatrice in rotazione. Quando la pipetta viene tagliata inizialmente, spesso si rompe formando naturalmente un bisello.Alla punta, rivalutare periodicamente la pipetta attraverso il microscopio collegato per assicurarsi che la pipetta sia ancora a contatto con la ruota. Poiché, quando il bisellatura diventa liscia, perderà il contatto con la ruota affilatrice. Una volta che il bisellatura è liscia, la punta della pipetta deve essere affilata.Sollevare la pipetta in modo che non tocchi più la ruota affilatrice. Ruotarla in senso orario di 10 a 50 gradi e appoggiare nuovamente la pipetta sulla ruota affilatrice in rotazione per circa 10 secondi. Fare attenzione a non appoggiare la pipetta sul bordo per un periodo troppo lungo, altrimenti potrebbe sviluppare una superficie irregolare.Rimuovere la pipetta dalla ruota affilatrice ed esaminare il bordo. Di solito questo passaggio deve essere ripetuto con diverse piccole regolazioni per ottenere un bordo affilato. Dopo aver completato un lato, affilare il bordo opposto nello stesso modo appena illustrato.Questo diagramma illustra l'accurata affilatura delle pipette per iniezione, una vista inferiore del bisellino di un ago correttamente affilato e una vista laterale di una pipetta con un bordo irregolare, come mostrato qui. Infine, utilizzare un pennarello indelebile per tracciare una linea circonferenziale ogni quattro millimetri a partire dal punto in cui inizia la zona conica della pipetta; queste marcature corrispondono a un volume di cinque microlitri.Dopo aver preparato l'iniezione, le pipette e il materiale iniettabile, è possibile predisporre il sistema per le iniezioni. Per prima cosa, pulire due volte la pipetta di iniezione con un XPBS, immergere la pipetta in PBS e premere il pulsante di riempimento fino a quando viene aspirata una quantità sufficiente di liquido per riempire la pipetta. Quindi controllare ogni volta il PBS.Successivamente, preparare l'area dell'intervento con una coperta riscaldata, un'illuminazione adeguata e gli strumenti chirurgici necessari. Le iniezioni verranno eseguite utilizzando lenti di ingrandimento chirurgiche con un ingrandimento di 2,5 x. In questa dimostrazione, anche se può essere utilizzato un microscopio stereoscopico, posizionare il topo anestetizzato su un tappetino riscaldante in posizione supina e fissare ogni arto con del nastro adesivo per immobilizzare l'animale.Dopo aver tagliato il pelo, preparare l'addome con iodopovidone al 10%, seguito da alcol, verificando con una pinzata al dito del piede che l'animale sia completamente anestetizzato. Successivamente, effettuare un'incisione di un centimetro nell'addome inferiore. L'aspetto più inferiore dell'incisione deve trovarsi approssimativamente un centimetro al di sopra del pube. Incidere la pelle e la fascia.Attenzione a non danneggiare l'intestino e la vescica, che si trovano immediatamente al di sotto del sottile strato di fascia. Utilizzando bastoncini di cotone, allungare delicatamente la fascia ed estrarre l'utero gr attraverso l'incisione. Identificare le ovaie destra e sinistra per assicurarsi di visualizzare l'intero utero, quindi contare il numero totale di feti.Rimettere l'utero nella cavità addominale prima di procedere, in modo che i feti rimangano caldi mentre ci si prepara per le iniezioni. Poiché i materiali iniettabili sono generalmente in un piccolo volume, di solito li si colloca in una piccola provetta da microcentrifuga per poter riempire l'ago senza rompere la punta della pipetta. Dato che le iniezioni rappresentano l'aspetto più complesso di questa procedura, una buona tecnica che provochi un trauma minimo all'utero è fondamentale per il successo di questa metodica.I feti devono essere tenuti saldamente, ma con sufficiente delicatezza da evitare danni. È inoltre fondamentale che i movimenti siano stabili durante l'inserimento e il ritiro della pipetta per l'iniezione. Aspirare il volume appropriato di materiale in base al numero di feti che si intende iniettare.È importante mantenere le punte della pipetta di mers per evitare di aspirare il campione all'interno dei tubi del microinjector. Tenere delicatamente un feto e identificare la parte del feto che si intende iniettare. In questa dimostrazione, inietteremo ogni feto in una diversa parte del corpo, il primo nel fegato fetale.Con il pollice e l'indice, stabilizzare il feto all'interno della cavità amniotica in modo che non ruoti mentre si esegue l'iniezione. Per iniettare nel fegato, inserire con attenzione la pipetta attraverso l'utero, l'amnios e la cute fetale, fino a raggiungere il fegato fetale. Una pipetta affilata dovrebbe penetrare facilmente attraverso questi tessuti.Iniettare il volume desiderato nel feto ed estrarre delicatamente la pipetta. È fondamentale mantenere movimenti costanti durante l'inserimento, l'iniezione e l'estrazione della pipetta per le iniezioni intraperitoneali. La pipetta viene inserita anche attraverso l'utero, l'amnios e la pelle fetale, ma mirando leggermente al di sotto del fegato fetale.Iniettare il volume desiderato per le iniezioni intramuscolari. Posizionare il feto in modo da identificare l'anca e il femore e iniettare nel muscolo gluteo. Per le iniezioni intraventricolari, è facile visualizzare le suture coronali per indirizzare la pipetta verso la sede appropriata per queste iniezioni.Sono necessarie pipette di calibro leggermente maggiore per penetrare il cranio senza rompere la pipetta. Per studi che prevedono il prelievo postnatale, tutti i feti devono ricevere iniezioni tecnicamente perfette, poiché non esiste un modo per distinguere feti iniettati e non iniettati dopo la nascita. Se le iniezioni vengono eseguite correttamente, il materiale non dovrebbe fuoriuscire dalla cavità amniotica o dall'utero.Dopo aver iniettato con attenzione i feti, riposizionare l'utero nella cavità addominale, assicurandosi che non sia torcito su se stesso o attorno al suo apporto vascolare. Somministrare un millilitro di uno XPBS nella cavità peritoneale della madre per sostituire qualsiasi liquido perso durante la procedura. Chiudere l'incisione in due strati con un punto di sutura assorbibile intrecciato da cinque oh.Chiudere innanzitutto la fascia senza danneggiare l'intestino o la vescica sottostanti, quindi chiudere la cute. Infine, restituire la femmina iniettata alla propria gabbia individuale. Posizionare la gabbia su una coperta riscaldata e aggiungere lettiera nella gabbia.Posizionare il topo in un'area tranquilla della struttura per topi, dove non dovrebbe essere disturbato fino a diversi giorni dopo il parto. Minimizzare qualsiasi stress aggiuntivo per l'animale ridurrà le probabilità di travaglio pretermine. Di seguito sono mostrati risultati rappresentativi dell'attecchimento del donatore dopo trapianto cellulare in utero. Fetusi al giorno embrionale 14 sono stati trapiantati con cellule staminali ematopoietiche positive per GFP.È stato quindi eseguito un prelievo di sangue periferico da un cucciolo chimera per rilevare l'espressione della GFP nelle cellule del donatore mediante citometria a flusso, confermando la presenza di cellule del donatore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare le pipette per iniezione ed eseguire iniezioni in utero. Una volta acquisite queste tecniche fondamentali.Questo metodo può essere modificato per iniettare feti a diverse età gestazionali al fine di studiare la biologia fondamentale dello sviluppo e delle cellule staminali.

a-mouse-model-of-in-utero-transplantation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Una descrizione della induzione chirurgica di endometriosi in topi e ratti con auto-trapianto di tessuto uterino alla cascata delle arterie del mesentere intestinale.

Modello murino di endometriosi chirurgicamente indotto da Auto-trapianto di tessuto uterino

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Nonostante l'importanza funzionale e mediche...

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l'esposizione fetale all'infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Qui, introduciamo un metodo per eseguire l'iniezione di spermatide rotondo (ROSI) nei topi, una tecnica con promettenti applicazioni cliniche e utilità per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo embrionale.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Questo studio introduce un nuovo modello murino specificamente progettato per simulare l'endometrioma, un sottotipo clinicamente significativo di endometriosi. Utilizzando topi C57BL/6J, il modello mira a chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base dell'infertilità correlata all'endometrioma, offrendo uno strumento raffinato per colmare l'attuale divario di conoscenze in medicina riproduttiva.

Istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne l'infertilità correlata

Scopri il trapianto in utero nel topo per studiare terapie con cellule staminali e terapia genica. Questo metodo consente di analizzare l'innesto cellulare e l'espressione genica nel feto, sfruttando il sistema immunitario immaturo.

Un modello murino di Nell'utero Trapianto

Esplora altri video