Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di accoppiare il campionamento basato su nastro adesivo di prodotti freschi con la rilevazione molecolare di cellule intere di specie di salmonella utilizzando la fluorescenza rapida nell'ibridazione C 2, nota anche come pesce. Ciò si ottiene applicando prima del nastro adesivo al materiale desiderato ed estraendo le celle legate alla superficie. I nastri di carica cellulare possono essere analizzati direttamente o sottoposti ad arricchimenti in fase solida o liquida.

La seconda fase della procedura consiste nel nastrare, nell'autofissazione e nella disidratazione in una serie di etanolo per le cellule alluse o arricchite in brodo. La seconda fase prevede la fissazione cellulare in sospensione, seguita dalla sospensione Resus delle cellule nel tampone di conservazione. La terza fase della procedura consiste nell'eseguire una rapida fase di ibridazione su nastro utilizzando un cocktail di sonde oligonucleotidiche specifiche per la salmonella, seguita dalla rimozione della sonda in eccesso con un risciacquo con tampone di lavaggio per i campioni analizzati via fax, la fase del pesce viene eseguita in sospensione e la sonda in eccesso può essere rimossa utilizzando una semplice fase di diluizione prima dell'analisi.

La fase finale della procedura consiste nel controcolorare le cellule legate al nastro ibridato con DPI ed esaminarle utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per le analisi basate sui fatti, non è necessaria una macchia di contrasto. In definitiva, questo metodo fornisce un mezzo per il rilevamento visivo o citometrico delle specie di salmonella che possono essere presenti sui prodotti freschi campionati.

Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho letto di un gruppo italiano che stava usando un approccio simile per esaminare le comunità batteriche su reliquie di pietra aeronautica romana. Ma io e r abbiamo condotto una discussione su questo lavoro in un corso che stavo insegnando sui metodi rapidi in microbiologia alimentare. Poche settimane dopo, un'epidemia di salmonella riconducibile a prodotti freschi ha iniziato a far ammalare quasi 1500 persone in 43 stati diversi.

il nostro approccio sperimentale offre una via pratica e tempestiva per il rilevamento di specifici tipi di batteri su prodotti freschi, dall'altro è anche sufficientemente portatile da consentire l'analisi sul campo o in un ambiente di produzione alimentare. Inizia selezionando un nastro da utilizzare per il campionamento. Alcune opzioni includono il nastro per funghi disponibile in commercio o a contatto che sono sterili e anche confezionati per facilità d'uso.

Con un pennarello indelebile, disegna dei quadrati di un centimetro sul lato non malato di un pezzo di nastro adesivo di 10 centimetri usando un modello di alluminio sterile. Questo servirà come guida visiva per notare quale parte del nastro è stata utilizzata per campionare il cibo o la superficie ambientale formando un anello di nastro a forma di CS con il lato adesivo rivolto verso la superficie da campionare. Per fare ciò, tieni le estremità adesive con il pollice e il medio e posiziona l'indice contro il quadrato disegnato sul retro del nastro.

Posizionare il nastro sulla superficie da campionare e premere delicatamente l'area contrassegnata contro la superficie senza rilasciare i bordi del nastro. Utilizzare il dito indice per assicurarsi che il lato adesivo del nastro sia completamente a contatto con la superficie del campione. Evitare le bolle con un movimento uniforme.

Estrarre lentamente il nastro dal campione. L'estrazione fisica dei microbi legati alla superficie fissa la carica cellulare. Nastro adesivo con il lato rivolto verso l'alto su un vetrino da microscopio Utilizzando un nastro da ufficio trasparente generico, assicurarsi che il nastro sia in tensione e in tensione adeguate in modo da creare una superficie piana e non rugosa.

Ciò contribuirà a ridurre al minimo i problemi di deformazione o arricciamento del nastro. Durante il successivo riscaldamento. Durante l'ibridazione, posizionare il nastro a faccia in giù su piastre di xilosio che affettano il terzile quattro o XLT quattro in modo che le cellule campionate siano a diretto contatto con la superficie agricola per facilitare la rimozione del nastro dalla superficie agricola.

Dopo l'arricchimento, la parte di contatto del nastro con il campione sagomato viene posizionata a filo con la superficie agricola e un'estremità del nastro viene fatta aderire liberamente. La parete laterale delle piastre della piastra di Petri è invertita per evitare la condensa e incubata a 35 gradi Celsius. Per consentire una crescita sufficiente delle specie di salmonella, la durata del periodo di incubazione necessario per arricchire le cellule a un livello rilevabile dipenderà dai livelli iniziali di contaminazione da salmonella.

Dopo il periodo di arricchimento desiderato, aprire la piastra di agar, il nastro manterrà la sua appiccicosità durante l'incubazione. Premere delicatamente il nastro contro l'agar utilizzando il dito indice per garantire il massimo recupero delle micro colonie formate All'interfaccia dell'agar a nastro, afferrare il nastro dal bordo attaccato alla parete della capsula di Petri e rimuoverlo con un movimento lento e uniforme. Utilizzando un nastro da ufficio trasparente generico, montare il nastro di carica cellulare con il lato adesivo rivolto verso l'alto su un vetrino da microscopio in modo da creare una superficie piana e non rugosa.

Eseguire la fissazione della cella su nastro per 30 minuti a 25 gradi Celsius coprendo l'area di contatto del campione con 500 microlitri di formina tamponata neutra al 10%. Gettare il fissativo in un contenitore sigillabile sotto una cappa chimica per ridurre al minimo l'esposizione a vapori irritanti o tossici, lavare il nastro una volta in una x soluzione salina tamponata con fosfato o PBS inondando delicatamente la superficie del nastro con PBS disidratare il campione. Utilizzando una serie di etanolo progressivo, preparare tamponi di ibridazione e lavaggio pre-ibridazione utilizzando il filtro per soluzioni di biologia molecolare commerciale utilizzando una siringa da 22 micrometri e preriscaldare i tamponi di ibridazione e lavaggio a 55 gradi Celsius.

Aggiungere sonde oligonucleotidiche marcate in fluorescenza al tampone di ibridazione preriscaldato per una concentrazione finale della sonda di cinque nanogrammi per microlitro sovrapporre l'area di contatto del campione sagomata del nastro con 300 microlitri di tampone di ibridazione contenente il cocktail di sonda e le cellule legate al nastro ibridato in una camera di incubazione sigillata umida impostata a 55 gradi Celsius per un incubatore a contatto diretto, come lo strumento in modalità slide ibridato per 15 minuti. Dopo l'ibridazione, i vetrini vengono rimossi e la sonda contenente la sovrapposizione del tampone di ibridazione viene scartata. Sciacquare brevemente e delicatamente con il tampone di lavaggio preriscaldato mediante pipettaggio.

Un piccolo volume di tampone su un vetrino inclinato consente ai vetrini di asciugarsi all'aria per il rilevamento onap delle specie di salmonella tramite microscopia a fluorescenza. Sovrapporre il vetrino con circa 10 microlitri di vector shield H 1200, terreno di montaggio contenente dpi, il controcolorante nucleare incubare al buio per 10 minuti. Posizionare l'olio da immersione sul coperchio, scivolare ed esaminare i campioni utilizzando un obiettivo a olio ad alto ingrandimento.

Il filtro DPI viene utilizzato per mettere a fuoco il campione. Il microscopio viene quindi commutato sul filtro appropriato e le cellule di salmonella vengono valutate visivamente in base alla loro fluorescenza verde o rossa, a seconda del colorante utilizzato per etichettare le sonde. Prima del rilevamento citrico, trasferire i campioni sospesi PBS in provette di campionamento a fondo tondo da cinque millilitri ed esaminare utilizzando un citometro a flusso con eccitazione a 647 nanometri.

Analizza i dati utilizzando il software FlowJo. Il campionamento con nastro adesivo di terica sierotipo, Ty Murium dalla superficie di un pomodoro contaminato artificialmente, facilita l'analisi diretta post-pesce tramite microscopia o carica cellulare di citometria a flusso. I nastri sono stati elaborati per una rapida fluorescenza nell'ibridazione C 2 utilizzando una combinazione di sonde di DNA specifiche per la salmonella e marcati con Texas Red, a seconda della concentrazione locale iniziale di cellule di salmonella sul nastro.

L'arricchimento in fase solida ha prodotto risultati che vanno dalle micro colonie isolate alla crescita confluente. Le cellule campionate su nastro possono essere analizzate tramite citometria combinata di pesce e citometria a flusso, immediatamente dopo il campionamento o dopo una superficie liquida di cinque ore. Mini arricchimento della coltura a 35 gradi Celsius.

Sebbene abbiamo descritto l'uso della tecnica del pesce a nastro per la sicurezza alimentare, il metodo ha anche un buon potenziale per l'uso in altre discipline, tra cui la microbiologia ambientale, la patologia vegetale o la microbiologia clinica. Parallelamente a questa procedura, ulteriori esperimenti come test biochimici o PCR possono essere eseguiti su arricchimenti in fase solida o liquida da campioni estratti su nastro. I test possono essere utilizzati per rispondere a domande su una salmonella che potrebbe essere presente, domande che esulano dall'ambito della procedura per la pesca.