Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di abbinare il campionamento di prodotti freschi mediante nastro adesivo con il rilevamento molecolare di cellule intere di specie di salmonella utilizzando l'ibridazione fluorescente rapida in C due, nota anche come fish. Questo viene realizzato applicando innanzitutto un nastro adesivo al materiale desiderato ed estraendo le cellule legate alla superficie. I nastri contenenti le cellule possono essere analizzati direttamente oppure sottoposti a arricchimenti in fase solida o liquida.

Il secondo passaggio della procedura prevede l'allestimento su vetrino, la fissazione diretta e la disidratazione in una serie di etanolo per le cellule presenti o arricchite in brodo. Il secondo passaggio comprende la fissazione delle cellule in sospensione, seguita dalla risospensione delle cellule in tampone di conservazione. Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eseguire un rapido ibridazione su vetrino mediante un cocktail di sonde oligonucleotidiche specifiche per Salmonella, seguita dalla rimozione dell'eccesso di sonda mediante un risciacquo con tampone lavaggio; per i campioni analizzati mediante FISH, il passaggio di ibridazione viene effettuato in sospensione, e l'eccesso di sonda può essere rimosso mediante una semplice diluizione prima dell'analisi.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nel controcolorare le cellule legate al nastro ibridato con DPI ed esaminarle mediante microscopia a fluorescenza. Per analisi basate su dati oggettivi, non è necessario un controcolorante. In definitiva, questo metodo fornisce un mezzo per il rilevamento visivo o citometrico di specie di salmonella che potrebbero essere presenti su prodotti freschi campionati.

L'idea per questo metodo mi è venuta per la prima volta leggendo di un gruppo italiano che utilizzava un approccio simile per esaminare comunità batteriche su reperti romani in pietra arenaria. Ma r e io abbiamo guidato una discussione su questo lavoro in un corso che stavo tenendo sui metodi rapidi in microbiologia alimentare. Alcune settimane dopo, un focolaio di salmonella associato a prodotti freschi ha colpito quasi 1500 persone in 43 stati diversi.

Sebbene il nostro approccio sperimentale offra una via tempestiva e pratica per la rilevazione di tipi specifici di batteri su prodotti freschi, è anche sufficientemente portatile da consentire test sul campo o in un ambiente di produzione alimentare. Iniziare selezionando un nastro da utilizzare per il campionamento. Alcune opzioni includono il nastro per funghi disponibile in commercio o i contatti sterili, confezionati per facilitarne l'uso.

Con un pennarello indelebile, disegnare quadrati di un centimetro sul lato non adesivo di un pezzo di nastro adesivo lungo 10 centimetri, utilizzando un apposito stampo sterile in alluminio. Questo servirà come guida visiva per indicare quale porzione del nastro è stata utilizzata per prelevare il campione dalla superficie alimentare o ambientale, formando un’ansa a forma di C con il lato adesivo rivolto verso la superficie da campionare. Per fare ciò, tenere le estremità adesive tra pollice e medio e posizionare l’indice sul quadrato disegnato sul retro del nastro.

Posizionare il nastro sulla superficie da campionare e premere delicatamente l'area marcata contro la superficie senza rilasciare i bordi del nastro. Utilizzare l'indice per assicurare che il lato adesivo del nastro entri completamente a contatto con la superficie del campione. Evitare bolle d'aria utilizzando un movimento uniforme.

Estrarre lentamente il nastro dal campione. Per estrarre fisicamente i microrganismi legati alla superficie, fissare la carica cellulare. Posizionare il lato appiccicoso del nastro verso l'alto su un vetrino da microscopio. Utilizzando un comune nastro trasparente da ufficio, assicurarsi una tensione e una trazione adeguate del nastro in modo da creare una superficie piatta e priva di grinze.

Questo aiuterà a ridurre al minimo i problemi di deformazione o arricciamento del nastro durante il riscaldamento successivo. Durante l'ibridazione, posizionare il nastro con la faccia rivolta verso il basso su piastre agrarie di scaglie di xilosio del quarto quartile o XLT quattro, in modo che le cellule campionate siano a diretto contatto con la superficie agraria, facilitando così la rimozione del nastro dalla superficie agraria.

Dopo l'arricchimento, la porzione del nastro contenente il campione stampato viene appoggiata a filo con la superficie dell'agaro e un'estremità del nastro viene fissata leggermente. Le piastre di Petri vengono capovolte in modo da evitare la condensa e incubate a 35 gradi Celsius. Per consentire una crescita sufficiente delle specie di salmonella, la durata del periodo di incubazione necessario per arricchire le cellule fino a un livello rilevabile dipenderà dai livelli iniziali di contaminazione da salmonella.

Dopo il periodo di arricchimento desiderato, aprire la piastra in agar; il nastro manterrà la sua tackiness durante l'incubazione. Premere delicatamente il nastro contro l'agar utilizzando il dito indice per garantire il massimo recupero delle microcolonie formatesi all'interfaccia tra il nastro e l'agar. Afferrare il nastro dal bordo attaccato alla parete della piastra di Petri ed eliminarlo con un movimento lento e uniforme. Utilizzando un comune nastro adesivo trasparente da ufficio, montare il nastro con le cellule cariche con il lato adesivo verso l'alto su un vetrino in modo da creare una superficie piatta e priva di grinze.

Eseguire la fissazione delle cellule su nastro per 30 minuti a 25 gradi Celsius coprendo l'area di contatto del campione con 500 microlitri di formalina tamponata neutra al 10%. Smaltire il fissativo in un contenitore sigillabile sotto cappa chimica per minimizzare l'esposizione a vapori irritanti o tossici; lavare il nastro una volta in soluzione salina fosfato 1x o PBS inondando delicatamente la superficie del nastro con PBS e disidratare il campione. Utilizzando una serie progressiva di etanolo, preparare i tamponi per ibridazione e lavaggio pre-ibridazione utilizzando soluzioni commerciali di grado biologia molecolare, filtrare con una siringa da 0,22 micrometri e preriscaldare i tamponi di ibridazione e lavaggio a 55 gradi Celsius.

Aggiungere sonde oligonucleotidiche marcate con fluorocromo al tampone di ibridazione preriscaldato per ottenere una concentrazione finale della sonda di cinque nanogrammi per microlitro. Sovrapporre l'area di contatto del campione stampo sul nastro con 300 microlitri di tampone di ibridazione contenente il cocktail di sonde e ibridare le cellule legate al nastro in una camera di incubazione umida sigillata impostata a 55 gradi Celsius; per un incubarore a contatto diretto, come lo strumento in modalità vetrino, procedere con l'ibridazione per 15 minuti. Al termine dell'ibridazione, rimuovere i vetrini e scartare il sovrastrato di tampone di ibridazione contenente la sonda. Risciacquare brevemente e delicatamente con il tampone di lavaggio preriscaldato mediante pipetta.

Un piccolo volume di tampone su un vetrino inclinato permette ai vetrini di asciugarsi all'aria per la rilevazione di *Salmonella* spp. mediante microscopia a fluorescenza. Coprire il vetrino con circa 10 microlitri di Vector Shield H 1200, mezzo di montaggio contenente DAPI, il colorante nucleare di contrasto, e incubare al buio per 10 minuti. Applicare l'olio di immersione sul coprioggetto, posizionare lo striscio ed esaminare i campioni utilizzando un obiettivo ad alta ingrandimento con olio di immersione.

Il filtro DPI viene utilizzato per mettere a fuoco il campione. Successivamente, il microscopio viene commutato sul filtro appropriato e le cellule di salmonella vengono valutate visivamente in base alla loro fluorescenza verde o rossa, a seconda del colorante utilizzato per etichettare le sonde. Per la rilevazione mediante citometria a flusso, trasferire i campioni sospesi in PBS in provette rotonde da cinque millilitri e analizzarli utilizzando un citometro a flusso con eccitazione a 647 nanometri.

Analizzare i dati utilizzando il software FlowJo. Il campionamento con nastro adesivo del sierotipo terica, Ty Murium, dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminato, permette un'analisi diretta post pesca mediante microscopia o citometria a flusso per la rilevazione delle cellule. I nastri sono stati trattati per ibridazione fluorescente rapida in C due, utilizzando una combinazione di sonde di DNA specifiche per Salmonella, marcate con Texas Red, in base alla concentrazione locale iniziale di cellule di Salmonella sul nastro.

L'arricchimento in fase solida ha prodotto risultati variabili da microcoloni isolate a crescita confluenziale. Le cellule campionate con nastro adesivo possono essere analizzate mediante combinazione di FISH e citometria a flusso, immediatamente dopo il campionamento o a seguito di un arricchimento in coltura liquida di cinque ore a 35 gradi Celsius.

Sebbene abbiamo descritto l'uso della tecnica del pesce adesivo per la sicurezza alimentare, il metodo ha anche un buon potenziale per essere impiegato in altre discipline, tra cui la microbiologia ambientale, la patologia vegetale o la microbiologia clinica. Parallelamente a questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori esperimenti, come test biochimici o PCR, su arricchimenti in fase solida o liquida ottenuti da campioni estratti con il nastro. Tali test possono essere utilizzati per rispondere a domande riguardanti un eventuale salmonella presente, domande che esulano dall'ambito della procedura del pesce adesivo.