Name: Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Impara a preparare fette organotipiche da embrioni di topo GFP per studiare la crescita dei nervi spinali con microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale dello sviluppo dei nervi periferici.

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Gli autori riconoscono la fonte originale per l&#39;idea di eseguire cultura fetta su embrioni di topo 5. Vorremmo ringraziare Gioacchino Kirsch per generoso supporto scientifico e Anna Degen per agire come il nostro tuttofare durante le riprese. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione per la Ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) e l&#39;Università di Heidelberg (Eccellenza Cluster reti cellulari).

Parte 1: Preparazione per affettare e coltura. <ol><li> Preparare 10 cm piastre di coltura di tessuto con taglio medio (DMEM, 25% 1x HBSS, il 25% di siero fetale bovino, 0,5% di glucosio, 1 mM glutammina, 2,5 HEPES mM, pH 7,3) e di 3 cm Millicell-CM 0.4-micron cultura inserti in membrana e di tenere incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Riscaldare il 4% agarosio a basso punto di fusione in PBS nel forno a microonde e tenerlo a piastra di riscaldamento in modo che rimanga a circa 37 ° C. </li><li> Riempi i piatti batteriologico 10 cm di Petri con PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4) e posto sul ghiaccio. </li><li> Imposta dispositivo di raffreddamento microtomo o garantire che vassoio di buffer e raffreddamento elementi sono memorizzati in freezer per pre-raffreddare. </li></ol> Parte 2: embedding Embryo. <ol><li> Sezionare embrioni dall'utero ed esaminarle con un microscopio invertito a fluorescenza per verificare l'espressione della GFP. </li><li> Embrioni posto su una rovesciata di 10 cm piastra di Petri e orientarli con strisce di carta Whatman per rimuovere eccessivo PBS. </li><li> Applicare agarosio sull'embrione per risolvere il problema in questa posizione. Lasciate solidificare agarosio. </li><li> Limitare l'area che circonda l'embrione da taglio con una lama di rasoio. </li><li> Ruotare l'embrione embedded sul suo lato. </li><li> Applicare ulteriori agarosio sul tessuto embrionale per assicurare che l'embrione sia completamente incorporato. </li><li> Preparare blocco agarosio con bordi puliti e montata sul mandrino vibratome utilizzando Loctite 406, una speciale colla simile a "Glue Krazy". </li></ol> Parte 3: Sfogliatrici procedura. <ol><li> Impostare il vassoio di buffer preraffreddato e l'elemento di raffreddamento. </li><li> Inserire il mandrino con il tessuto incollato e aggiungere 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + senza HBSS, 10 mM tampone HEPES pH 7,3, 500 U / ml di penicillina / streptomicina) fino al coperto. </li><li> Inserire e fissare un predepurata (70% etanolo) lama microtomo. </li><li> Preparare 350-450 fette micron e trasferirli usando accorciato vetro pipette pasteur in piastre di coltura di tessuti conservati in ghiaccio. </li><li> Usando un paio di pinze, rimuovere con attenzione agarosio da ogni fetta e trasferimento Millicell membrane cultura. Circa 4 fette può essere coltivato su una membrana in un piatto di 10 cm di coltura tissutale pieno con 6 ml di terreno di coltura. </li><li> Incubare fette a 37 ° C e 5% di CO 2 (Terreno di coltura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% siero fetale bovino, 0,5% di glucosio, 1MM glutammina, 2,5 HEPES mM, pH 7,3). Se si esegue time-lapse serie di immagini si deve mantenere costante il volume del mezzo. Nel caso di serie a tempo di imaging per un breve lasso di tempo è sufficiente lasciare il medium così com'è. Per le modifiche cultura periodi più lunghi, dopo 12-20 ore sono raccomandati. </li></ol> Parte 4: escrescenza Imaging nervo spinale al microscopio. <ol><li> Nervi spinali immagine mettendo una di 10 cm piastra di coltura dei tessuti, contenenti le membrane cultura Millicell con le fette, sotto un microscopio a fluorescenza in posizione verticale. </li><li> Etichetta l'orientamento delle membrane cultura Millicell sul palco microscopio per posizionare correttamente durante il punto successivo tempo di imaging. </li><li> Escrescenza del nervo spinale immagine usando 4x (apertura numerica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3), o 20x (NA 0,5) obiettivi. </li></ol> La figura 1 mostra una serie di immagini raffiguranti la conseguenza del nervo spinale durante 20 ore di cultura con obiettivi 4x e 10x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 serie Imaging di escrescenza nervo spinale in una fetta trasversale di un embrione omozigote tauGPF. * = Motoneuroni del midollo spinale ventrale, freccia = DRG. La dorsale (D)-ventrale (V) asse della fetta viene indicato. Scalebars: 200 micron.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

In un confronto di metodi per preparare culture fetta embrionale di metà gestazione embrioni di topo (E10 - E12), abbiamo osservato che una vibratome produce senza dubbio i risultati più attendibili rispetto sia alla viabilità complessiva della culture e la riproducibilità dei il nervo escrescenza modelli. Al contrario, fette preparati con un elicottero dei tessuti McIlwain 3 dimostrato di essere completamente non vitali. Inizialmente abbiamo utilizzato un metodo ghigliottina 4, in cui un intera cu...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti per dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Carta Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ritagliate e levigate al fuoco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Lame da rasoio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>nessuno</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie PL</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura per camera riscaldata</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 e incubatore S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

slice cultura organotipica di gfp che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Per molti scopi, la coltivazione di embrioni di topo ex vivo come fette organotipica è auspicabile. Per esempio, impieghiamo una linea di topo transgenico (tauGFP) in cui la versione migliorata della proteina verde fluorescente (EGFP) è esclusivamente espressa in tutti i neuroni del sistema di sviluppo nervoso centrale e periferico 1, ammettendo la possibilità ad entrambi film di innervazione del la zampa anteriore e di manipolare questo processo con tecniche farmacologiche e genetiche 2. Il parametro più critico di successo nella coltivazione di culture fetta tale è il metodo con cui vengono preparate le fette. Dopo un&#39;ampia sperimentazione di una varietà di metodi, abbiamo scoperto che una vibratome è il dispositivo migliore per affettare gli embrioni in modo tale da risultare in routine di una cultura che dimostra la vitalità in un periodo di diversi giorni e, soprattutto, si sviluppa in un&#39;epoca specifico modo. Per la metà della gestazione gli embrioni, questo include la conseguenza normale di nervi spinali dal midollo spinale e gangli delle radici dorsali ai loro obiettivi in ​​periferia e alla corretta decisione del tessuto scheletrico e muscolare. In questo lavoro, presentiamo un metodo per l&#39;elaborazione di embrioni intero del giorno embrionale (E) E10 a E12 in 300-400 fette micrometro per la coltivazione in una cultura incubatore standard di tessuto, che può essere studiato per un massimo di due giorni dopo la preparazione fetta. Critico per il successo di questo approccio è l&#39;uso di un vibratome per tagliare ogni agarosio-embedded embrione. Questa è seguita dalla coltivazione delle fette su inserti cultura membrana Millicell posti sopra un piccolo volume di media, risultando in una tecnica cultura interfaccia. Una cucciolata con una media di 7 embrioni produce regolarmente almeno 14 fette (2-3 fette della regione degli arti anteriori per embrione), che varia leggermente a causa dell&#39;età degli embrioni e allo spessore delle fette. Circa l&#39;80% delle fette colta spettacolo escrescenza del nervo, che può essere misurato througout i 2 periodo coltura. Risultati rappresentativi utilizzando la linea del mouse tauGFP sono dimostrati.

Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l&#39;imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Per molte finalità, è auspicabile la coltivazione ex vivo di embrioni di topo sotto forma di sezioni organotipiche. Ad esempio, impieghiamo una linea di topi transgenici (tauGFP) in...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare sezioni trasversali organotipiche della regione dell'arto anteriore di embrioni di topo esprimenti GFP per l'analisi dell'uscita dei nervi spinali. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando gli embrioni in agarosio a basso punto di fusione e limitando l'area del tessuto e dell'agarosio alla regione di interesse. Il blocco di agarosio viene quindi montato per il taglio. Successivamente, gli embrioni inclusi nel blocco vengono tagliati con il vibratomo. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rimuovere gli aros che circondano le sezioni e nel trasferire le sezioni nelle piastre di coltura. Le sezioni vengono quindi coltivate e mostrano l'espansione dei nervi periferici verso la periferia, che può essere monitorata mediante microscopia a fluorescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la guillotina o il tritacarne per tessuti è che le sezioni vengono generate in modo più controllato e mostrano una maggiore vitalità in coltura. Pertanto, questo metodo può essere utile nello studio della neurobiologia dello sviluppo, ad esempio nell’analisi dell’orientamento e della crescita dei n

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Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Questo video dimostra la coltura ex vivo e l'imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico. Gli embrioni vengono isolati e immersi nell'agarosio. Utilizzando un vibratomo si ottengono fette contenenti i nuclei oculomotori e gli occhi. Le fette vengono mantenute in coltura e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Coltura ex vivo e imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Presentiamo qui un protocollo ottimizzato per genotipizzare, colorare e preparare topi fetali per l'imaging di proiezioni di assoni nocicettori periferici nell'intero animale, come metodo efficace per valutare i fenotipi di crescita degli assoni sensoriali nello sviluppo di topi geneticamente modificati.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara a preparare fette organotipiche da embrioni di topo GFP per studiare la crescita dei nervi spinali con microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale dello sviluppo dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici (Video) | JoVE Journal

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

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