Name: Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Impara a preparare fette organotipiche da embrioni di topo GFP per studiare la crescita dei nervi spinali con microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale dello sviluppo dei nervi periferici.

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Gli autori riconoscono la fonte originale per l&#39;idea di eseguire cultura fetta su embrioni di topo 5. Vorremmo ringraziare Gioacchino Kirsch per generoso supporto scientifico e Anna Degen per agire come il nostro tuttofare durante le riprese. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione per la Ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) e l&#39;Università di Heidelberg (Eccellenza Cluster reti cellulari).

Parte 1: Preparazione per affettare e coltura. <ol><li> Preparare 10 cm piastre di coltura di tessuto con taglio medio (DMEM, 25% 1x HBSS, il 25% di siero fetale bovino, 0,5% di glucosio, 1 mM glutammina, 2,5 HEPES mM, pH 7,3) e di 3 cm Millicell-CM 0.4-micron cultura inserti in membrana e di tenere incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Riscaldare il 4% agarosio a basso punto di fusione in PBS nel forno a microonde e tenerlo a piastra di riscaldamento in modo che rimanga a circa 37 ° C. </li><li> Riempi i piatti batteriologico 10 cm di Petri con PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4) e posto sul ghiaccio. </li><li> Imposta dispositivo di raffreddamento microtomo o garantire che vassoio di buffer e raffreddamento elementi sono memorizzati in freezer per pre-raffreddare. </li></ol> Parte 2: embedding Embryo. <ol><li> Sezionare embrioni dall'utero ed esaminarle con un microscopio invertito a fluorescenza per verificare l'espressione della GFP. </li><li> Embrioni posto su una rovesciata di 10 cm piastra di Petri e orientarli con strisce di carta Whatman per rimuovere eccessivo PBS. </li><li> Applicare agarosio sull'embrione per risolvere il problema in questa posizione. Lasciate solidificare agarosio. </li><li> Limitare l'area che circonda l'embrione da taglio con una lama di rasoio. </li><li> Ruotare l'embrione embedded sul suo lato. </li><li> Applicare ulteriori agarosio sul tessuto embrionale per assicurare che l'embrione sia completamente incorporato. </li><li> Preparare blocco agarosio con bordi puliti e montata sul mandrino vibratome utilizzando Loctite 406, una speciale colla simile a "Glue Krazy". </li></ol> Parte 3: Sfogliatrici procedura. <ol><li> Impostare il vassoio di buffer preraffreddato e l'elemento di raffreddamento. </li><li> Inserire il mandrino con il tessuto incollato e aggiungere 1x HBSS (Ca 2 +-Mg 2 + senza HBSS, 10 mM tampone HEPES pH 7,3, 500 U / ml di penicillina / streptomicina) fino al coperto. </li><li> Inserire e fissare un predepurata (70% etanolo) lama microtomo. </li><li> Preparare 350-450 fette micron e trasferirli usando accorciato vetro pipette pasteur in piastre di coltura di tessuti conservati in ghiaccio. </li><li> Usando un paio di pinze, rimuovere con attenzione agarosio da ogni fetta e trasferimento Millicell membrane cultura. Circa 4 fette può essere coltivato su una membrana in un piatto di 10 cm di coltura tissutale pieno con 6 ml di terreno di coltura. </li><li> Incubare fette a 37 ° C e 5% di CO 2 (Terreno di coltura: DMEM, 25% 1x HBSS, 25% siero fetale bovino, 0,5% di glucosio, 1MM glutammina, 2,5 HEPES mM, pH 7,3). Se si esegue time-lapse serie di immagini si deve mantenere costante il volume del mezzo. Nel caso di serie a tempo di imaging per un breve lasso di tempo è sufficiente lasciare il medium così com'è. Per le modifiche cultura periodi più lunghi, dopo 12-20 ore sono raccomandati. </li></ol> Parte 4: escrescenza Imaging nervo spinale al microscopio. <ol><li> Nervi spinali immagine mettendo una di 10 cm piastra di coltura dei tessuti, contenenti le membrane cultura Millicell con le fette, sotto un microscopio a fluorescenza in posizione verticale. </li><li> Etichetta l'orientamento delle membrane cultura Millicell sul palco microscopio per posizionare correttamente durante il punto successivo tempo di imaging. </li><li> Escrescenza del nervo spinale immagine usando 4x (apertura numerica [NA] 0,1), 10x (NA 0,3), o 20x (NA 0,5) obiettivi. </li></ol> La figura 1 mostra una serie di immagini raffiguranti la conseguenza del nervo spinale durante 20 ore di cultura con obiettivi 4x e 10x. <img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 serie Imaging di escrescenza nervo spinale in una fetta trasversale di un embrione omozigote tauGPF. * = Motoneuroni del midollo spinale ventrale, freccia = DRG. La dorsale (D)-ventrale (V) asse della fetta viene indicato. Scalebars: 200 micron.

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

In un confronto di metodi per preparare culture fetta embrionale di metà gestazione embrioni di topo (E10 - E12), abbiamo osservato che una vibratome produce senza dubbio i risultati più attendibili rispetto sia alla viabilità complessiva della culture e la riproducibilità dei il nervo escrescenza modelli. Al contrario, fette preparati con un elicottero dei tessuti McIlwain 3 dimostrato di essere completamente non vitali. Inizialmente abbiamo utilizzato un metodo ghigliottina 4, in cui un intera cu...

<table><tbody><tr><td>HBSS 10x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti per dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio L.M.P.</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>Carta Whatmann</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ritagliate e levigate al fuoco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 100x</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti Millicell-CM</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 10 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>LOCTITE 406</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Lame da rasoio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>nessuno</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo x4</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie PL</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo x10</td><td>Olympus Corporation</td><td>serie UPLFL &amp;#8211;PH</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura per camera riscaldata</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 e incubatore S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

slice cultura organotipica di gfp che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Per molti scopi, la coltivazione di embrioni di topo ex vivo come fette organotipica è auspicabile. Per esempio, impieghiamo una linea di topo transgenico (tauGFP) in cui la versione migliorata della proteina verde fluorescente (EGFP) è esclusivamente espressa in tutti i neuroni del sistema di sviluppo nervoso centrale e periferico 1, ammettendo la possibilità ad entrambi film di innervazione del la zampa anteriore e di manipolare questo processo con tecniche farmacologiche e genetiche 2. Il parametro più critico di successo nella coltivazione di culture fetta tale è il metodo con cui vengono preparate le fette. Dopo un&#39;ampia sperimentazione di una varietà di metodi, abbiamo scoperto che una vibratome è il dispositivo migliore per affettare gli embrioni in modo tale da risultare in routine di una cultura che dimostra la vitalità in un periodo di diversi giorni e, soprattutto, si sviluppa in un&#39;epoca specifico modo. Per la metà della gestazione gli embrioni, questo include la conseguenza normale di nervi spinali dal midollo spinale e gangli delle radici dorsali ai loro obiettivi in ​​periferia e alla corretta decisione del tessuto scheletrico e muscolare. In questo lavoro, presentiamo un metodo per l&#39;elaborazione di embrioni intero del giorno embrionale (E) E10 a E12 in 300-400 fette micrometro per la coltivazione in una cultura incubatore standard di tessuto, che può essere studiato per un massimo di due giorni dopo la preparazione fetta. Critico per il successo di questo approccio è l&#39;uso di un vibratome per tagliare ogni agarosio-embedded embrione. Questa è seguita dalla coltivazione delle fette su inserti cultura membrana Millicell posti sopra un piccolo volume di media, risultando in una tecnica cultura interfaccia. Una cucciolata con una media di 7 embrioni produce regolarmente almeno 14 fette (2-3 fette della regione degli arti anteriori per embrione), che varia leggermente a causa dell&#39;età degli embrioni e allo spessore delle fette. Circa l&#39;80% delle fette colta spettacolo escrescenza del nervo, che può essere misurato througout i 2 periodo coltura. Risultati rappresentativi utilizzando la linea del mouse tauGFP sono dimostrati.

Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l&#39;imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Per molte finalità, è auspicabile la coltivazione ex vivo di embrioni di topo sotto forma di sezioni organotipiche. Ad esempio, impieghiamo una linea di topi transgenici (tauGFP) in...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare sezioni trasversali organotipiche della regione dell'arto anteriore di embrioni di topo esprimenti GFP per l'analisi dell'uscita dei nervi spinali. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando gli embrioni in agarosio a basso punto di fusione e limitando l'area del tessuto e dell'agarosio alla regione di interesse. Il blocco di agarosio viene quindi montato per il taglio. Successivamente, gli embrioni inclusi nel blocco vengono tagliati con il vibratomo. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rimuovere gli aros che circondano le sezioni e nel trasferire le sezioni nelle piastre di coltura. Le sezioni vengono quindi coltivate e mostrano l'espansione dei nervi periferici verso la periferia, che può essere monitorata mediante microscopia a fluorescenza.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la guillotina o il tritacarne per tessuti è che le sezioni vengono generate in modo più controllato e mostrano una maggiore vitalità in coltura. Pertanto, questo metodo può essere utile nello studio della neurobiologia dello sviluppo, ad esempio nell’analisi dell’orientamento e della crescita dei nervi spinali, e a illustrare la procedura sarà Isabel Barman. Iniziare la procedura preparando piastre da 10 centimetri per colture cellulari con sei millilitri di mezzo di coltura e inserti con membrana per coltura da tre centimetri Milli Cell CM, 0,4 micron.Mantenerli nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, riscaldare al microonde l'agarosio al 4% a basso punto di fusione in PBS e mantenerlo su una piastra riscaldante in modo che resti a circa 37 gradi Celsius. Riempire piastre di Petri batteriologiche da 10 centimetri con PBS e posizionarle sul ghiaccio.Quindi impostare il dispositivo di raffreddamento Viome. Conservare il vassoio del tampone e gli elementi di raffreddamento nel congelatore fino a quando non saranno completamente congelati per eseguire l'inclusione degli embrioni. Inizialmente dissezionare gli embrioni dall'utero.Esaminarli con un microscopio fluorescente invertito e verificare l'espressione di GFP. Successivamente, posizionare gli embrioni su una piastra di Petri da 10 centimetri invertita utilizzando strisce di carta Watman per orientarli ed eliminare l'eccesso di PBS. Applicare aros sull'embrione per fissarlo.In posizione orientata, attendere che l'aros si solidifichi, tagliare l'eccesso di aros e, se desiderato, il tessuto circostante la porzione centrale dell'embrione. Ruotare l'embrione incorporato sull'altro lato. Applicare ulteriore aros sul tessuto embrionale per assicurare che l'embrione sia completamente incorporato.Attendere che gli aros si solidifichino. Preparare un blocco di aros con embrione incluso e bordi puliti. Infine, incollare il campione su un mandrino viome con Loctite 4 0 6.Preparare il vassoio per il buffer pre-raffreddato e gli elementi di raffreddamento. Posizionare il mandrino con il tessuto incollato sul viome. Aggiungere un X-H-B-S-S al mandrino fino a quando il tessuto non è completamente ricoperto.Inserire una lama viome pre-pulita nel porta-lama. Successivamente, preparare sezioni trasversali con uno spessore di circa 350-450 micron. Ogni sezione viene tagliata utilizzando un microtomo HM six 50 V.Trasferire le fette in piastre per colture di tessuto utilizzando una pipetta di vetro Pastor con estremità arrotondata e mantenerle sul ghiaccio. Utilizzando una pinzetta, rimuovere con attenzione gli aros da tutte le fette. Successivamente, trasferire le fette sulle membrane per colture cellulari Milli, disponendo quattro fette su ciascuna membrana in piastre di coltura da 10 centimetri contenenti sei millilitri di mezzo di coltura preriscaldato.Incubare le sezioni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino all'inizio dell'acquisizione dell'immagine in time-lapse e tra gli intervalli di acquisizione. Posizionare la piastra per colture cellulari contenente membrane Milli per colture cellulari con sezioni sotto un microscopio fluorescente eretto e localizzare i nervi spinali; acquisire l'immagine della fuoriuscita dei nervi spinali utilizzando obiettivi 4x, 10x o 20x. Etichettare l'orientamento delle membrane per colture cellulari Milli sulla piastra del microscopio per poterle riposizionare correttamente durante il successivo punto temporale di acquisizione, nel caso in cui non si disponga di un ambiente stabile per temperatura e anidride carbonica.L'ambiente mostrato qui è una serie di immagini della fuoriuscita dei nervi spinali durante 24 ore di coltura in una sezione trasversale di un embrione omozigote tau GFP. La stella indica i neuroni motori del midollo spinale ventrale e la freccia indica il ganglio della radice dorsale (DRG). Il pannello superiore è stato acquisito utilizzando un obiettivo 4X, mentre il pannello inferiore con un obiettivo 10X.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare sezioni trasversali organotipiche di embrioni di topo che possono essere utilizzate per l'immagine della fuoriuscita dei nervi spinali.

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Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici (Video) | JoVE Journal

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