Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare fette trasversali organotipiche della regione degli arti anteriori di embrioni di topo che esprimono GFP per visualizzare la crescita del nervo spinale. Ciò si ottiene incorporando prima gli embrioni in aros a basso punto di fusione e limitando l'area di tessuto e aros alla regione di interesse. Il blocco aros viene quindi montato per l'affettatura.

Quindi gli embrioni incorporati nel blocco vengono affettati con il vibratore. La fase finale della procedura consiste nel rimuovere gli aros che circondano le fette e nel trasferire le fette nelle piastre di coltura. Le fette vengono quindi coltivate e mostrano la crescita dei nervi periferici nella periferia, che può essere monitorata con la microscopia a fluorescenza.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la ghigliottina o il tritatessuti, è che le fette vengono generate in modo più controllato e mostrano una migliore vitalità in coltura. Pertanto, questo metodo può aiutare nello studio della neurobiologia dello sviluppo, come l'osservazione della guida e della crescita dei nervi spinali, dimostrando che la procedura sarà Isabel Barman. Iniziare questa procedura preparando piastre di coltura tissutale da 10 centimetri con sei millilitri di terreno di coltura e inserti di membrana di coltura da tre centimetri milli cm, 0,4 micron.

Tienili nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Quindi, riscalda il 4% di aros a basso punto di fusione in PBS nel microonde e tienilo su una piastra riscaldante in modo che rimanga a circa 37 gradi Celsius. Riempire piastre di Petri batteriologiche da 10 centimetri con PBS e adagiarle sul ghiaccio.

Quindi configura il dispositivo di raffreddamento Viome. Conservare il vassoio tampone e gli elementi di raffreddamento nel congelatore fino a completo congelamento per eseguire l'embrione. L'inclusione prima seziona gli embrioni dall'utero.

Esaminali con un microscopio a fluorescenza invertita e verifica l'espressione della GFP. Successivamente, posiziona gli embrioni su una piastra di Petri capovolta di 10 centimetri utilizzando strisce di carta watman per orientarli e rimuovere l'eccesso di PBS. Applicare aros sull'embrione per fissarlo.

Nella posizione orientata, attendere che gli aro si solidifichino, tagliano gli aros in eccesso e, se lo si desidera, il tessuto che circonda la parte centrale dell'embrione. Ruota l'embrione incorporato dall'altra parte. Applicare ulteriori aros sul tessuto embrionale per assicurarsi che l'embrione sia completamente incorporato.

Aspetta che gli aros si solidifichino. Preparare il blocco aros incorporato nell'embrione con bordi puliti. Infine, incollare il campione su un mandrino a viome con Loctite 4 0 6.

Installare il vassoio del tampone preraffreddato e gli elementi di raffreddamento. Posizionare il mandrino con il fazzoletto incollato sulla viome. Aggiungere un X-H-B-S-S al mandrino fino a coprire il fazzoletto.

Inserire una lama viome pre-pulita nel portalama. Successivamente, preparare fette trasversali con uno spessore di circa 350-450 micron. Ogni fetta viene tagliata utilizzando un microtomo HM six da 50 V.

Trasferire le fette su piastre di coltura tissutale con una pipetta da pascolo di vetro accorciata e tenerle sul ghiaccio. Usando un paio di pinze, rimuovere con cura gli aros da tutte le fette. Quindi trasferire le fette sulle membrane di coltura millicellulare con una disposizione di quattro fette su ciascuna membrana su piastre di coltura da 10 centimetri riempite con sei millilitri di coltura preriscaldata. Medio.

Incubare le fette a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino all'inizio dell'imaging time-lapse e tra gli intervalli di imaging. Posizionare la piastra di coltura tissutale contenente le membrane di coltura cellulare Millie con fette sotto un microscopio a fluorescenza verticale e localizzare l'immagine dei nervi spinali che riprendono la crescita dei nervi spinali utilizzando obiettivi quattro x 10 x o 20 x. Etichettare l'orientamento delle membrane di coltura milli cell sul tavolino del microscopio per riposizionarle correttamente durante il successivo punto temporale dell'imaging nel caso in cui non si disponga di una temperatura e di un'anidride carbonica stabili.

L'ambiente mostrato qui è una serie di imaging della crescita del nervo spinale durante 24 ore di coltura in una fetta trasversale di un embrione tau GFP omozigote. La stella indica i motoneuroni del midollo spinale ventrale e la freccia indica DRG. Il pannello superiore è stato ripreso utilizzando un obiettivo a quattro X e il pannello inferiore con un obiettivo a 10 X.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare fette trasversali organotipiche di embrioni di topo che possono essere utilizzate per visualizzare la crescita dei nervi spinali.