Le registrazioni fisiologiche NMJs uscita alta e bassa del muscolo estensore gamberi Leg

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come esporre e distinguere le terminazioni motorie fasica e tonica mediante colorazione morfologica e registrazione elettrofisiologica nel muscolo estensore del gambero. Questo viene ottenuto innanzitutto pinzando il primo o il secondo arto camminatore di un gambero di media taglia, rimuovendo il taglio della cuticola ed eliminando il muscolo flessore nel segmento meite. Ciò espone il muscolo estensore e il fascio nervoso.

Il secondo passaggio della procedura consiste nella colorazione del preparato con ioduro di etilamino sterile e metilperiteneo, o quattro D due asp, per visualizzare gli assoni e le terminazioni nervose. Il terzo passaggio della procedura prevede la stimolazione selettiva di neuroni tonici e/o fasici, effettuando contemporaneamente registrazioni intracellulari di potenziali postsinaptici eccitatori evocati nella fibra muscolare. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'utilizzare un elettrodo focale per registrare eventi qu spontanei ed evocati dalle terminazioni.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che distinguono morfologicamente e fisiologicamente le terminazioni toniche da quelle fasiche, mediante microscopia a fluorescenza immunoistochimica ed elettrofisiologia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fisiologia sinaptica, in ambiti come l'affaticamento muscolare, la depressione sinaptica e la comunicazione crociata sinaptica. L'esperimento inizia prelevando con attenzione l'astaco, evitando le sue chele.

Stacca la gamba dal corpo al segmento pod ischioideo. Una pressione decisa sul segmento pod ischioideo induce l'astice di fiume ad automizzare, ossia a staccare naturalmente la prima gamba ambulacrale. L'astice di fiume smetterà di sanguinare e viene rimesso nel suo serbatoio di contenimento.

L'astice non viene sacrificato. Posizionare la gamba su un pezzo di carta da filtro in modo che il preparato possa essere girato facilmente durante i tagli. Ruotare la gamba fino a quando il lato esterno, che è il lato laterale, è rivolto verso l'alto sul piatto di dissezione.

Questo generalmente ha il lato arrotondato rivolto verso l'alto. Utilizzando una lametta affilata fissata a un taglierino per bisturi, incidere la cuticola all'interno del segmento meite seguendo il modello mostrato in figura. Fare attenzione a non tagliare troppo in distale lungo il taglio da dorsale a ventrale lungo l'articolazione carpod del meite.

Questo taglio crea una finestra nel meite al di sopra dei muscoli della gamba sottostanti. Lasciare per ora il cuticolo al suo posto. Posizionare il preparato in una capsula per dissezione contenente soluzione fisiologica per gamberi.

A questo punto, inserire un perno nella parte centrale del segmento carpod e nella faccia dorsale del segmento ischia pod con pinzette fini, sollevare leggermente la finestra tagliata nella cuticola dall'estremità distale e, utilizzando il rasoio, staccare le fibre del muscolo flessore dalla cuticola. Continuare a tagliare in senso distale-prossimale, quindi sollevare completamente la finestra di cuticola. Per esporre il muscolo estensore, è necessario rimuovere il muscolo flessore sovrastante.

Separare il tendine del muscolo flessore spostandolo dal muscolo flessore con un perno. Quindi tagliare il tendine all'articolazione metacarpo-carpale. Come mostrato, prestare molta attenzione a tirare il tendine lontano dalla cavità della gamba prima di effettuare il taglio e a tagliare solo il tendine, senza recidere il nervo principale della gamba che si trova sul lato interno del tendine.

Pizzicare il tendine nel punto in cui è stato reciso con pinzette ed estrarre il muscolo flessore dalla gamba sollevandolo in direzione prossimale. Per esporre il nervo del muscolo estensore, recidere il nervo principale della gamba all'articolazione meropodocarpale e tirare con attenzione il nervo principale della gamba indietro, oltre il muscolo estensore. La separazione del nervo del muscolo estensore dal nervo principale della gamba può essere facilitata tirando delicatamente la parte distale del moncone del nervo principale verso il lato del preparato. Quando si stacca il nervo principale della gamba indietro oltre il muscolo estensore, potrebbe essere necessario recidere piccoli rami dell'assone inibitorio.

Il fascio nervoso può essere visualizzato mediante colorazione con blu di metilene. Tuttavia, il blu di metilene non verrebbe utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche in questa immagine superiore. Frecce rosse indicano il tratto nervoso di interesse.

Il fascio nervoso di interesse è il fascio più grande che si dirama dal nervo principale della gamba in prossimità dell'estremità prossimale del meropodo. Osservare la ramificazione degli assoni e i due assoni chiaramente visibili all'interno del nervo. Ora che nervo e muscolo sono esposti, preparare l'apparato utilizzato per l'esperimento.

Le registrazioni intra ed extracellulari vengono effettuate con un amplificatore e una testa standard. Utilizziamo un amplificatore modello Axon Clamp due B e una testa modello uno XLU. Sono necessarie tre elettrodi, una intracellulare e due extracellulari.

I due elettrodi extracellulari verranno utilizzati per stimolare il nervo e registrare eventi sinaptici evocati e spontanei. Lucidare con la fiamma gli elettrodi focali e piegarli leggermente sopra un elemento riscaldante. Dopo aver riempito un elettrodo focale con soluzione salina, posizionarlo nel supporto per elettrodi stimolanti e inserire il filo dello stimolatore in modo che entri in contatto con la soluzione salina.

Questo è collegato a un'unità di isolamento per la stimolazione P 15 di grasso, che a sua volta è collegata a uno stimolatore S 88 grasso. Durante le registrazioni elettrofisiologiche, il colorante vitale per D due ASP viene utilizzato per visualizzare gli assoni e colorarli; scambiare la soluzione fisiologica nel bagno con una soluzione contenente cinque micromolari di quattro D due ASP per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, riempire nuovamente la capsula con soluzione fisiologica di gambero, posizionare il preparato sotto un microscopio ed esaminare con un obiettivo Forex.

E con un oculare 10x, spostare l'elettrodo stimolante nell'area di interesse. Il passaggio successivo consiste nel posizionare il lume dell'elettrodo stimolante macro-patch sull'assone fasico o su quello tonico. Questa fotografia di un preparato colorato con quattro coloranti, tra cui il due come colorante, mostra che l'assone tonico è più visibile a causa del contenuto mitocondriale aumentato.

I terminali tonici mostrano numerose varicosità e i terminali fasici hanno un aspetto più sottile in microscopia a fluorescenza. L'obiettivo 20x posiziona l'elettrodo su un asse neurale tonico o fasico. In questo caso, l'elettrodo viene posizionato sull'asse neurale tonico.

Inserire l'elettrodo intracellulare nel suo micromanipolatore, quindi posizionare l'elettrodo intracellulare in una cellula muscolare estensore. Questo verrà utilizzato per registrare i potenziali postsinaptici eccitatori intracellulari o EPSP. Per la registrazione di EPSP qualitativi.

Posizionare il secondo elettrodo focale in un micromanipolatore. Questa operazione viene eseguita rimuovendo il precedente elettrodo intracellulare e il relativo supporto, sostituendoli con un supporto per elettrodo pulito. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare il lume del secondo elettrodo focale direttamente sopra una varicosità sinaptica.

La resistenza dell'elettrodo e del sigillo viene determinata inviando impulsi di corrente di prova attraverso l'elettrodo. Nei nostri esperimenti, le resistenze del sigillo variavano da 0,3 a un megaohm e la resistenza dell'elettrodo da 0,5 a uno. La resistenza del sigillo in megaohm può essere monitorata per tutta la durata della registrazione.

Quando si è pronti per iniziare la stimolazione, accendere il software Scope 5.0 e iniziare a stimolare l'assone isolato. Nel fascio nervoso, l'assone tonico viene stimolato tramite l'elettrodo a suggente e i potenziali postsinaptici eccitatori (EPSP) della fibra muscolare vengono registrati con un elettrodo intracellulare o extracellulare. Gli EPSP vengono acquisiti su un computer tramite un'interfaccia Power Lab Forest.

Dopo la stimolazione dell'assone tonico, l'elettrodo stimolante può essere spostato sull'assone fasico e l'esperimento può essere ripetuto dopo la stimolazione del nervo. L'elettrodo intracellulare registra i potenziali postsinaptici eccitatori generati in risposta all'attività sia del neurone motore tonico che di quello fasico. La facilitazione sinaptica delle giunzioni neuromuscolari toniche dipende dalla frequenza della stimolazione nervosa, come mostrato qui per successivi treni di circa 20 stimoli ciascuno a una frequenza di 60 hertz.

Si noti la facilitazione che si verifica con stimoli ripetuti. Questa figura confronta le ampiezze dei potenziali postsinaptici eccitatori generati dalla stimolazione del nervo tonico a frequenze di 20 hertz in blu, 40 hertz in verde e 60 hertz in rosso; si osservi la marcata facilitazione evidenziata alle frequenze di stimolazione più elevate. I terminali tonici presentano una bassa efficacia sinaptica, ma mostrano risposte facilitate molto evidenti.

Ecco gli EPSP tonici da soli, e poi le risposte fasici sovrapposte alla stessa scala. A differenza dei terminali tonici, i terminali fasici presentano un'elevata efficacia qualitativa, ma mostrano depressione sinaptica con stimolazione ad alta frequenza. La depressione sinaptica ai terminali fasici è inoltre correlata alla frequenza di stimolazione, come mostrato qui.

Una stimolazione continua a cinque hertz per 30 minuti deprime la risposta alla giunzione neuromuscolare. Con una frequenza di stimolazione più elevata, il preparato si deprime più rapidamente con una stimolazione appropriata. La giunzione neuromuscolare dell'astice genera EPSP di tipo non rigenerativo.

Questi EPSP possono essere utilizzati per studiare le proprietà qualitative che costituiscono i segnali elettrici graduati in questi muscoli. Qui vengono mostrate le risposte sinaptiche qualitative del terminale tonico. Si noti che non tutte le prove di stimolazione producono un evento qualitativo.

Il conteggio diretto degli eventi quantici è possibile con una stimolazione a bassa frequenza per ogni risposta evocata. Il numero di eventi quantici può essere facilmente determinato per le terminazioni toniche. Contando gli eventi quantici, le risposte sinaptiche del neurone motore fasico possono essere registrate nello stesso modo.

Tuttavia, le risposte evocate sono di natura multiquantale. Il contenuto quantale medio viene stimato utilizzando l'ampiezza media o l'area delle deflessioni insieme all'ampiezza media o all'area dei picchi degli eventi spontanei. Un ultimo promemoria: fare attenzione durante la rimozione del muscolo flessore per non danneggiare il nervo che innerva il muscolo estensore.

È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.