Receptor Organi muscolare all'addome gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti in propriocezione

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la dissezione e la registrazione dai neuroni sensoriali primari, che trasmettono informazioni sui movimenti e sulle posizioni articolari come informazione propriocettiva per un animale. Questo viene realizzato innanzitutto dissezionando l'addome dell'astice ed esponendo la metà dorsale del preparato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel registrare l'attività elettrica da un organo recettoriale articolare posizionando un nervo segmentale all'interno di un elettrodo a suggente.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel muovere l'articolazione in diverse posizioni e nel correlare il movimento al profilo di attività. L'ultimo passaggio della procedura è esaminare le strutture anatomiche associate all'organo sensoriale. Questa procedura illustra un approccio per registrare l'attività dai neuroni propriocettivi primari ed può essere utilizzata per studiare gli effetti della neuromodulazione biogenica.

Questo metodo può aiutare gli istruttori a insegnare concetti fondamentali di fisiologia sensoriale, come l'adattamento sensoriale e il modo in cui i neuromodulatori alterano la percezione sensoriale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla propriocettività e sugli invertebrati, può essere applicato anche ad altri organismi modello, come i mammiferi, per comprendere meglio i fusi muscolari intrafusali. Questa procedura descrive come isolare, stimolare e registrare l'attività dagli organi recettoriali muscolari localizzati nei muscoli addominali dell'astice.

Il primo passo consiste nel dissezionare il nervo dell'astice e i muscoli addominali contenenti l'organo recettoriale muscolare. Selezionare un astice, nel nostro caso Procambarus clarkii, con una lunghezza corporea compresa tra sei e dieci centimetri, e posizionarlo sul ghiaccio per due o tre minuti per anestetizzarlo. La dissezione inizierà decapitando l'astice, come indicato dalle linee contrassegnate con A nella figura.

Il successivo taglio in corrispondenza di B separerà il torace dall'addome, e il terzo taglio in corrispondenza di C aprirà l'addome. Una volta che l'astice è stato anestetizzato, tenere l'astice anestetizzato dietro le chele con una mano. Tagliare rapidamente dalla cavità oculare fino al centro della testa su entrambi i lati, quindi staccare la testa dall'astice.

Il sangue del preparato è appiccicoso quando si asciuga, quindi pulire immediatamente gli strumenti. Dopo aver staccato la testa dell'astice, effettuare un taglio tra il torace e l'addome sulla faccia ventrale. Rimuovere i plessi branchiali.

Se l'astice è maschio, rimuovere lo stilo. A questo punto dovrebbe essere facile separare l'addome dal torace. Inserire una lama delle forbici all'interno dell'addome e, con la punta delle forbici rivolta lontano dal preparato, tagliare lungo il margine laterale.

Ripetere sul lato opposto. Prendere l'estremità posteriore della pinzetta e spingere i muscoli e il tratto gastrointestinale lontano dal lato dorsale del preparato. Assicurarsi di non premere sui muscoli.

Tagliare trasversalmente da laterale a laterale l'ultima costola per rimuovere la parte ventrale della coda. Immergere il preparato in soluzione fisiologica per gamberi e posizionare la capsula petri contenente l'addome del gambero sotto la lente del microscopio per dissezione. Il passaggio successivo consiste nel preparare l'apparato di stimolazione e registrazione.

L'allestimento è composto da una gabbia di Faraday, un microscopio, un illuminatore ad alta intensità, un micromanipolatore e un bagno salino. La gabbia di Faraday serve a bloccare i campi elettrici esterni che potrebbero interferire con la registrazione elettrica. Posizionare il microscopio in modo che sovrasti il piano del microscopio.

Spostare l'illuminatore ad alta intensità in una posizione comoda. Inserire l'elettrodo a suzione nel micromanipolatore e posizionare il micromanipolatore in modo che l'elettrodo a suzione abbia facile accesso al bagno salino. Aspirare la soluzione salina all'interno dell'elettrodo a suzione fino a quando la soluzione salina entra in contatto con il filo di argento.

Disporre l'altro filo in modo che sia vicino alla punta dell'elettrodo a suggente, in modo che entrambi i fili siano a contatto con il bagno salino. Collegare l'amplificatore differenziale CA CDC al Power Lab 26 T e verificare le impostazioni sull'amplificatore. Collegare la testata di testa alla sonda di ingresso dell'amplificatore.

Collegare i fili elettrici dell'elettrodo di aspirazione allo stadio della testa. I fili devono essere collegati con il rosso in alto a sinistra, il verde al centro e il nero in basso. A questo punto, collegare il cavo USB dal power lab 2016 al computer.

Assicurarsi che sia l'amplificatore che il power lab 26 T siano collegati e accesi prima di aprire lab chart seven sul computer; avviare lab chart seven, il software per la registrazione dei dati sul computer. Viene visualizzata la finestra di benvenuto di lab chart.

Chiuderlo. Fare clic su impostazione. Fare clic su impostazioni del canale in basso a sinistra della finestra.

Modificare il numero di canali su uno facendo clic su OK in alto a sinistra del grafico. Impostare i cicli al secondo a circa 2K. Impostare le divisioni sull'asse Y a 500 o 200 millivolt sulla destra del grafico.

Fare clic sul canale uno. Fare clic sull'amplificatore di ingresso. Selezionare le seguenti impostazioni: singolo estremo, accoppiamento in alternata (AC), inversione per invertire il segnale se necessario e anti-aliasing.

Per iniziare la registrazione dei dati, fare clic su avvia per terminare la registrazione dei dati. Fare clic su stop per collegare elettricamente a massa il bagno inserendo un filo di riferimento al cloruro d'argento nel bagno e l'altra estremità a una massa comune. Se il collegamento a massa del bagno provoca rumore elettrico durante la registrazione, scollegare il bagno dalla massa.

Il passo successivo consiste nell'esporre i muscoli e i nervi di interesse. I muscoli estensori profondi mediali, o DEM, vengono identificati dalle loro fibre a elica spiraliforme, mentre i muscoli estensori profondi laterali, o DEL, presentano fibre lineari. Questa figura mostra una fotografia dei muscoli DEM e DEL drenati, allineati con un disegno schematico dei muscoli.

Esaminare il preparato al microscopio e individuare i muscoli DEM e DEL. A questo punto non è possibile vedere gli organi recettoriali muscolari poiché si trovano al di sotto dei muscoli visibili. Inserire due puntine nella regione medio-sagittale nella parte distale dell'addome, tra i muscoli DEM, sulla prima e sulla seconda costola.

Osservare al microscopio per individuare il nervo che trasporta gli assoni sensitivi dagli organi recettoriali muscolari. Cercare il segmento con il nervo più accessibile. Il nervo è di colore bianco e può essere visualizzato spruzzando salina sulla preparazione con una pipetta o soffiando leggermente sulla preparazione.

Questo fa muovere il nervo e quindi ne facilita l'identificazione. Una volta localizzato il nervo, utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'elettrodo a suggente direttamente sopra il nervo. Tirare delicatamente sulla siringa per aspirare il nervo all'interno dell'elettrodo.

Si può osservare il nervo che viene aspirato nell'elettrodo attraverso il microscopio. Per iniziare l'esperimento, fare clic su "start" nel software di registrazione dati. Utilizzare pinzette per muovere delicatamente la coda dell'astice su e giù con un angolo di 180 gradi.

Utilizzare il marcatore di commento nel software per annotare l'angolo di stimolazione da utilizzare durante l'analisi successiva dei dati. Ripetere l'esperimento a un angolo di 45 gradi, registrando il cambiamento di angolo con il marcatore di commento del software. Ripetere a un angolo di 90 gradi.

Osservare la differenza nella risposta del nervo sensoriale a ciascun angolo. Al termine della registrazione, è possibile osservare direttamente gli organi recettoriali muscolari. Questa figura mostra le posizioni relative degli organi recettoriali muscolari etichettati SA e RA per adattamento rapido e adattamento lento e dei muscoli D-E-M-D-E-L e SEM.

La fotografia a destra è stata colorata con blu di metilene. Per osservare gli organi recettoriali muscolari nel tuo preparato, coloralo prima con blu di metilene. Versa la soluzione salina per gamberi dal piatto e sostituiscila con una soluzione di blu di metilene, quindi agita delicatamente il piatto per alcuni minuti.

Quindi versare l'eccesso di blu di metilene nel contenitore dei rifiuti e aggiungere soluzione salina fresca sulla preparazione. Riposizionare la piastra sotto il microscopio per dissezionare il muscolo sovrastante, al fine di esporre gli organi recettoriali muscolari.

Tagliare il segmento lungo la costola laterale rispetto al piano sagittale medio posizionando una lama delle forbici sotto il muscolo e sollevandola mentre si taglia lungo il muscolo. Una volta recisi i muscoli DEL uno e due, staccare questi muscoli e osservare uno strato sottile di muscolo chiamato muscolo estensore mediale superficiale o SEM. Gli organi recettoriali muscolari sono le ultime due fibre mediali disposte parallelamente al muscolo elicoidale.

Siate molto attenti in questo passaggio per non danneggiare gli organi recettoriali muscolari. Nel sistema meccanorecettoriale dell'astice esistono due tipi distinti di recettori del tratto. Le unità sensoriali fasiche sono innervate da assoni motori veloci, mentre le unità sensoriali toniche sono innervate da assoni motori lenti, come mostrato in questa figura.

Quando un recettore tonico viene stimolato da uno stiramento, si adatta lentamente allo stimolo e continua a generare un modello stabile di potenziali d'azione. Al contrario, quando un recettore afasico viene stimolato da uno stiramento, si adatta rapidamente allo stimolo e genera solo un breve modello di potenziali d'azione. Questa registrazione mostra la risposta nervosa quando il segmento addominale che lo contiene è stato piegato.

Prima, il segmento è stato piegato ad un angolo di 45 gradi e poi rilassato. La registrazione successiva mostra la risposta al rilassamento dopo una flessione di 90 gradi. Questo dimostra che l'organo recettoriale muscolare rapido presenta un'attività aumentata in risposta a un maggiore allungamento del filamento MRO.

Questa registrazione successiva mostra l'attività dell'organo recettoriale muscolare provocata dalla flessione della coda e dal mantenimento di una posizione a 45 gradi. Si noti l'adattamento dell'attività neurale indicato dalla riduzione della frequenza di scarica. Un'utile estensione di questo esperimento sarebbe esaminare se i neuromodulatori alterano la frequenza di scarica, registrare il processo di adattamento della risposta sensoriale misurando la frequenza di scarica in diversi momenti mentre si mantiene una posizione statica costante ed inserire i dati in una tabella come quella mostrata qui di seguito, seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'esame degli effetti di neuroormoni quali la topamina, la serotonina e la prolattina, possono essere testati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sui meccanismi cellulari con cui composti agiscono sui neuroni sensoriali primari. Dopo lo sviluppo di questo preparato, i ricercatori hanno descritto il sito di inizio del potenziale d'azione nei neuroni, aprendo la strada a ulteriori studi nel campo della neurofisiologia per esplorare la trasduzione meccanica e la propriocettività degli arti, non solo negli invertebrati, ma anche nei vertebrati. Questo è un eccellente preparato per l'insegnamento di molti concetti fondamentali della neurofisiologia.