La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

L'obiettivo generale di questo rapporto è quello di essere uno strumento didattico per gli studenti delle scuole superiori avanzate e dei corsi di laurea in fisiologia che partecipano alla sperimentazione fisiologica. Gli studenti imparano a esporre e registrare le contrazioni nell'intestino posteriore del gambero. Un ulteriore passaggio consiste nell'asportare l'intestino posteriore dall'animale, che consente l'applicazione diretta dei composti.

Successivamente, la forza e il ritmo delle contrazioni della muscolatura liscia dell'intestino posteriore vengono monitorati durante l'applicazione di vari agenti farmacologici per esaminare i meccanismi che alterano la forza della contrazione. Si ottengono risultati che mostrano l'azione dei modulatori sull'interno neurale o direttamente sul muscolo sulla base di saggi farmacologici e sottotipizzazione del recettore. Ciao, sono il Dr.J Mercier del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università di Brock.

Ho usato l'intestino posteriore del gambero come preparazione per condurre ricerche sui neurotrasmettitori che controllano i muscoli viscerali. Ho anche usato questa preparazione come strumento didattico e come parte di una collaborazione con il laboratorio del Dr.Robin Cooper presso l'Università del Kentucky, stiamo perfezionando una serie di esperimenti gestiti dagli studenti per scopi didattici. Questo metodo può fornire informazioni sulla funzione dell'intestino appeso ai gamberi.

Può anche essere applicato negli studi su malattie come le malattie che coinvolgono i ritmi peristaltici. Può anche essere utilizzato per descrivere i meccanismi alla base della modulazione dell'innervazione muscolare e neurale. Gli studenti impareranno a interpretare i dati fisiologici e farmacologici attraverso l'uso di agenti farmacologici, neurotrasmettitori e neuroormoni e acquisiranno una comprensione generale della funzione recettoriale.

Per quanto riguarda gli agonisti e gli antagonisti, gli studenti costruiranno curve dose-risposta e presenteranno i dati in forma grafica per l'analisi statistica. Per anestetizzare l'animale, posizionare un gambero di lunghezza compresa tra sei e 10 centimetri sul ghiaccio per cinque-10 minuti. Tenere il gambero anestetizzato da dietro le chele con una mano. Taglia rapidamente dall'orbita dell'occhio al centro della testa su entrambi i lati, quindi decapita i gamberi.

Il sangue del preparato sarà appiccicoso quando ci proverà, quindi lava gli strumenti una volta completato. Quindi, taglia le zampe e le chele. Quindi le pinne caudali sinistra e destra, lasciando la pinna caudale centrale tagliata lungo il lato dorsale dell'addome fino a raggiungere l'ultimo segmento.

Quindi tagliare lungo l'ultimo segmento e lungo l'altro lato. Togli il guscio dorsale. Metti i gamberi sezionati nella capsula di Petri foderata di sigar.

Povera soluzione salina di gamberi. Per coprire la preparazione si usavano dei perni di dissezione per fissare la preparazione alla piastra di Petri. L'intestino posteriore è solitamente circondato da una massa di vasi sanguigni e tessuto connettivo.

Rimuovili con una pinza. Facendo attenzione a non danneggiare l'intestino. L'intestino posteriore è ora visibile lungo l'addome.

Lasciare riposare il preparato di gambero sezionato nella soluzione salina per circa 10 minuti in modo che possa riprendersi dallo shock della dissezione e dall'esposizione salina. Fai attenzione alle lente contrazioni peristaltiche dell'intestino posteriore. Per iniziare, ora è possibile calcolare il tasso di contrazioni.

Conta il numero di contrazioni che si verificano in 30 secondi e registralo in un registro. Registra anche il tipo di contrazioni che si verificano e se sono peristaltiche o spastiche. Notare la direzione di eventuali onde peristaltiche.

Conta la velocità delle contrazioni vicino all'ano e a metà dell'addome, vedi se ci sono differenze di velocità tra queste due regioni. Avere una varietà di soluzioni di test pronte e alla stessa temperatura della soluzione salina da bagno. La prima soluzione testata qui sarà una serotonina micromolare a base di soluzione salina di gamberi.

Usando una pipetta, rimuovere la soluzione salina dalla cavità dell'addome esposto del gambero e applicare la soluzione di serotonina micromolare direttamente sull'intestino posteriore. Immediatamente dopo aver aggiunto la nuova soluzione, attendere 30 secondi e poi contare 30 secondi di contrazioni nella regione vicino all'ano, quindi contare i successivi 30 secondi di contrazioni a metà dell'addome. Registra questi numeri in un grafico e annota anche il tipo di contrazioni che si verificano. Prossimo.

Versare la soluzione di prova dal piatto di registrazione e sciacquare più volte l'intestino posteriore con normale soluzione salina di gamberi. Quindi sciacquare il preparato ogni 30 secondi per cinque minuti. A questo punto, è possibile aggiungere la soluzione di test successiva, che in questa dimostrazione è una Micromolare Topammina.

Registrare le osservazioni come prima e ripetere questo processo per il resto dei composti in esame. Quando si utilizzano più concentrazioni della stessa sostanza, assicurarsi di iniziare con la concentrazione più bassa e di lavorare su concentrazioni più elevate. La configurazione per misurare la forza delle contrazioni gastrointestinali include un laptop con il software lab chart seven, il pod bridge, il power lab, 26 T e il trasduttore di forza.

Prima di poter misurare la forza delle contrazioni muscolari gastrointestinali, è necessario isolare il tratto gastrointestinale. Per fare ciò, tagliare i muscoli nell'ultimo segmento addominale, posizionare due o più spilli attraverso la cuticola ventrale morbida su entrambi i lati dell'ano, quindi tagliare il resto dell'addome, lasciando l'intestino posteriore e l'ano attaccati a un piccolo pezzo di cuticola. L'intestino deve essere tagliato vicino alla giunzione del torace e dell'addome.

Ora sposta il tratto gastrointestinale su un piatto poco profondo con un fondo ricoperto di sarda. C'è un vaso sanguigno che corre lungo l'aspetto dorsale del tratto gastrointestinale. Estrarlo con cautela dal tratto gastrointestinale.

Versare la soluzione salina fresca dei gamberi sulla preparazione. Spostare il trasduttore di forza sulla preparazione. Osservare attentamente il perno incollato alla parte inferiore del trasduttore di forza.

L'estremità che si aggancia al budello ha una piccola curva. Agganciare la piccola curva dello spillo all'estremità tagliata del budello posteriore. Dopo aver agganciato l'intestino posteriore, muovi leggermente il piatto fino a quando l'intestino posteriore non è teso.

Fai attenzione a questo passaggio perché l'intestino deve essere teso, ma non troppo stretto. Essere troppo stretti potrebbe danneggiare il muscolo. Quando il piatto è nella posizione ottimale, usa cera o argilla per tenerlo fermo.

Quindi, avvia il software. Per iniziare la registrazione, apri il software per cartelle cliniche. Chiudi il grafico del lab, centro di accoglienza.

Vai su configurazione in alto a sinistra. Fare clic su Impostazioni canale in basso a sinistra. Modificare le impostazioni del canale in modo che abbiano un solo canale.

Fare clic su OK a destra dello schermo. Vai al canale uno pod bridge aperto. Impostare l'intervallo sull'impostazione più sensibile, 200 microvolt in questo caso nella parte superiore del grafico nell'angolo destro.

Imposta i cicli al secondo su 2K. Ora sei pronto per registrare. Fare clic su Avvia per assicurarsi che l'installazione funzioni correttamente.

Toccare leggermente la punta del trasduttore con una pipetta. Dovresti vedere una variazione di forza registrata dal software. Fare clic su stop sul software, quindi fare clic su start e lasciare che il programma venga eseguito.

Per circa 20 secondi, fai clic su Interrompi e aggiungi un commento con l'etichetta soluzione salina. Calcola il tasso di contrazioni solo misurando il tempo dall'inizio di una deflessione all'inizio della successiva, o contando la deflessione totale su un minuto o due. Calcola la velocità come contrazioni al minuto o come contrazioni al secondo a seconda della rapidità con cui si verificano.

Per misurare la forza delle contrazioni, utilizzare una misura relativa per confrontare le contrazioni in condizioni diverse sul file salvato. Spostare il marcatore M sulla linea di base, quindi spostare il cursore sul picco della deflessione e annotare il valore elencato in alto a destra dello schermo. Si tratta di un valore delta che rappresenta la differenza tra M e il picco.

Si noti che il cursore deve essere tenuto fermo al picco per misurare la variazione. Quindi spostare l'indicatore M e il cursore sulla forma d'onda successiva di interesse e ripetere la misura per esaminare l'effetto dei modulatori. Su questa preparazione, passare lentamente dalla soluzione salina a una soluzione di prova.

In questo caso, uno serotonina micromolare e continuare a registrare la velocità e la forza delle contrazioni come ultimo test. Per questa preparazione verificare se gli inibitori della giunzione gap modificano la velocità o la forza delle contrazioni, gli inibitori della giunzione gap includono un etanolo hep o soluzione salina che è stato riempito con anidride carbonica. Questi composti vengono utilizzati per ultimi in quanto possono danneggiare le fibre muscolari dopo un'esposizione prolungata per confrontare l'effetto dei vari composti, rappresentare graficamente i dati su un grafico.

Un altro uso interessante di questo preparato è quello di registrare la forza generata dai muscoli circolari. Tuttavia, se hai applicato inibitori della giunzione gap alla tua preparazione, gli inibitori potrebbero aver danneggiato i muscoli circolari, nel qual caso dovresti usare un preparato fresco per l'intestino posteriore per testare i muscoli circolari. Per esporre i muscoli circolari, tagliare il tubo dell'intestino su un piano longitudinale con forbici sottili.

Usa degli spilli sottili per fissare saldamente un lato al piatto. Fissare il perno uncinato sul trasduttore all'altro lato della striscia. Esporre il preparato agli stessi composti che sono stati testati sui muscoli longitudinali, qui viene mostrato il rapporto tra i composti testati e il numero e il tipo di contrazioni.

È possibile rappresentare graficamente il numero di contrazioni rispetto al tempo per le soluzioni saline, serotonina e glutammato. È possibile rappresentare graficamente il numero di contrazioni rispetto alla forza delle contrazioni in millivolt per le soluzioni saline di serotonina glutammato. Questi innesti possono essere eseguiti sia per i muscoli longitudinali che per quelli circolari per verificare se i muscoli longitudinali e circolari nelle diverse regioni dell'intestino mostrano risposte diverse ai vari modulatori.

Gli esperimenti di cui sopra possono essere ripetuti su diverse regioni dall'ano e lungo l'addome. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non danneggiare il tratto gastrointestinale con le pinzette e di non tirare troppo forte con il trasduttore di forza Seguendo questa procedura. Altri metodi, come le registrazioni elettrofisiologiche, del muscolo possono essere eseguite per affrontare altri problemi come le funzioni e le modulazioni dei canali ionici e che possono fungere da modello e da altri tessuti in altri modelli animali.