Name: La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Impara le tecniche di dissezione e misurazione delle contrazioni peristaltiche nell'intestino posteriore del gambero. Questo metodo didattico permette agli studenti di esplorare la neurofisiologia e la farmacologia dei muscoli viscerali.

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Supportato da University of Kentucky, Dipartimento di Biologia, Ufficio di studi universitari e il College of Arts &amp; Sciences.

1. Introduzione La panoramica più recente completa del hindgut gambero è stato rispettato in una dissertazione dal Dott. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, USA), che si è concentrata principalmente sulla modulazione serotoninergica e innervazione (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crostacei sono stati studiati più di 100 anni fa da Alexandrowicz, un pioniere in anatomia comparata (Alexandrowicz, 1909), che ha descritto i vari aspetti della loro innervazione. La ricerca continua nel corso degli anni, individuando le tipologie di strati muscolari e architettura, affrontando la funzione complessiva del hindgut in osmoregolazione per l'animale intero, ed esaminando il controllo modulazione della contrattilità hindgut da differenti composti (vedi recensione di Musolf, 2007). E 'interessante notare che la parte anale del hindgut agisce non solo per espellere le feci, ma anche a prendere l'acqua dall'ambiente per osmoregolazione. Questa regione dell'intestino può subire avanti o indietro la peristalsi a seconda delle esigenze dell'animale. Alexandrowicz (1909) ha identificato due plessi nervosi che innervano l'hindgut crostaceo, un plesso interno e un esterno del plesso, che poi si è rivelata una ricca fonte per l'identificazione e la caratterizzazione neurotrasmettitori. Nel 1950 il Dr. Ernst Florey ha iniziato una serie di studi farmacologici sulla hindgut gamberi e ha dimostrato che le contrazioni sono modulati da acetilcolina e composti correlati e anche da epinefrina e norepinefrina (Florey, 1954). Florey, lo scopritore di una sostanza inibitoria conosciuta come "fattore-I", studiato gli effetti della sostanza sulla varie preparazioni, incluso il sistema gastrointestinale a gamberi (Florey, 1961). Factor-I fu poi dimostrato di essere GABA. Così, il gambero di fiume hindgut svolto un ruolo importante nel primi studi di inibizione sinaptica. In seguito alla scoperta di GABA, altri trasmettitori putativi sono stati anche dimostrato di essere associato con i plessi hindgut e per ottenere risposte fisiologiche. Trasmettitori includono la dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) due peptidi orcokinin (NFDEIDRSGFGFN e AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000.) e un peptide myosuppressin (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide più probabile, cfr Stemmler et al 2007). Ognuna di queste sostanze modula contrazioni hindgut spontanea, e tutti tranne GABA sembrano essere eccitatori. Il hindgut risponde anche al glutammato e quisqualate (Jones, 1962;. Errato et al 2003), ma chiara evidenza di innervazione glutammatergica non è stato riportato. Messaggeri intracellulari che mediano gli effetti dei vari trasmettitori sono in gran parte inesplorato, ma ci sono prove del coinvolgimento di cAMP nella capacità della dopamina per aumentare le contrazioni (Knotz &amp; Mercier, 1995). Anche se il hindgut crostaceo contratti spontaneamente dopo denervazione, tali contrazioni sono deboli e disorganizzati (Galles, 1982; Winlow &amp; Laverack, 1972a). Movimento peristaltico richiede potenza del motore coordinato dal sistema nervoso centrale, apparentemente originario degli ultimi ganglio addominale (Winlow &amp; Laverack, 1972a, b, c). In gamberi di fiume, la potenza del motore viene portato al hindgut attraverso la radice 7 ° addominale, che contiene 75 assoni i cui corpi cellulari sono localizzati nel ganglio ultimi addominale (Kondoh &amp; Hisada, 1986). Almeno alcuni dei peptidi sembrano essere fornita al plesso hindgut provenienti dai neuroni del ganglio ultimi addominale (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al 1991b; Siwicki &amp; Bishop, 1986), ma la dopamina è fornito da neuroni in più gangli anteriori (Mercier et al. 1991a). Dal potenza del motore attraverso la radice 7 ° addominale è necessaria per i grandi, contrazioni coordinato, è probabile che alcuni o tutti i trasmettitori putativo sopra elencati contribuiscono in qualche modo alla peristalsi. I loro contributi relativi, tuttavia, non sono noti. Alcune informazioni possono essere acquisite attraverso lo studio dei loro effetti sui muscoli circolari e longitudinali separatamente (Mercier &amp; Lee, 2002). Oltre a controllare il movimento del cibo non digerito, il plesso nervoso associate alla hindgut crostaceo sembra svolgere un importante funzione endocrina associati muta. Il hindgut del granchio, Carcinus maenas, contiene cellule endocrine che rilasciano l'ormone iperglicemico dei crostacei e dei suoi precursori dei peptidi durante ecdysis (Webster et al. 2000), suggerendo un ruolo nella assorbimento di acqua e gonfiore associati muta. Così, il crostaceo hindgut partecipa a diversi importanti processi fisiologici. Questo rapporto è principalmente uno strumento didattico per avanzati studenti liceali e universitari nei corsi di fisiologia che partecipano alla sperimentazione. L'importanza e il potenziale meccanismo alla base come i contratti hindgut e le funzioni possono essere affrontati dagli studenti. Agenti farmacologici, neurotrasmettitori, neurormoni e saranno utilizzati, e curve dose-risposta sarà costruito, che sarà coinvolgere gli studenti in modo di acquisire e interpretare i dati fisiologici e farmacologici. Una conoscenza generale della funzione dei recettori rispetto agli agonisti e antagonisti possono essere raggiunti. Gli studenti impareranno anche a presentare i dati in forma grafica per l'analisi statistica. E 'molto facile da analizzare e registrare le contrazioni dalla hindgut gamberi. Nella preparazione sezionato, l'intestino è facilmente esposto a sostanze esogene. L'alterazione dell'attività peristaltica può essere monitorato visivamente o con un trasduttore di forza, che può anche controllare la forza delle contrazioni. A causa della sua semplicità e affidabilità come preparazione biologico, il gambero di fiume hindgut è ancora molto utile per indagare molti interrogativi ricerca sui meccanismi della peristalsi, modulazione della potenza del motore e la contrazione muscolare, e la funzione del recettore. Il hindgut è utile anche per gli insetticidi test, crustaceancides, e inquinanti per i meccanismi specifici di azioni. 2. Metodi 2.1) Materiali <ul><li> gambero </li><li> gamberi salina </li><li> strumenti di dissezione (forbici grossolana e fine, grossolana e una pinza sottile) </li><li> Sylgard a fondo piatto Petri </li><li> perni in acciaio dissezione </li><li> bicchieri (di tenere soluzioni chimiche) </li><li> parafilm (per la copertura di miscelazione e soluzioni) </li></ul> 2.2) La dissezione <ol><li> Gambero di fiume (Procambarus clarkii) misura 6-10 cm di lunghezza del corpo deve essere collocato in ghiaccio per 5 a 10 minuti per anestetizzare l'animale prima della dissezione comincia. </li><li> Tenere il gambero anestetizzato da dietro le unghie con una sola mano. Rapidamente, tagliato dalla presa occhio al centro della testa su entrambi i lati, e poi decapitare i gamberi (Nota: il sangue dalla preparazione sarà appiccicoso quando si asciuga, quindi lavare gli attrezzi una volta completato). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Decapitazione di gamberi </li><li> Tagliare il chelipeds e le gambe camminando. </li><li> Tagliare il alettoni a destra ea sinistra, lasciando solo il tailfin centrale (uropod). </li><li> Sul lato dorsale del gambero taglio ventrale sia sul lato destro e sinistro della cuticola dorsale. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Rimozione della cuticola dorsali </li><li> Tagliati trasversalmente sul lato dorsale della cuticola, facendo in modo che il taglio è superficiale per evitare di danneggiare la GI Quindi rimuovere la parte inferiore della cuticola dorsale addominale. </li><li> Mettere i gamberi sezionato in un Sylgard alberato piatto. </li><li> Pin i gamberi al piatto sulla punta della pinna caudale. Si può utilizzare più perni su entrambi i lati della GI se necessario per tenere il corpo verso il basso. </li><li> Riempire il piatto con soluzione salina gamberi che copre il GI Assicurarsi di spegnere continuamente il GI con soluzione fisiologica con una pipetta. Soluzione salina è una versione modificata di Van Harreveld (1936), che è fatto con 205 mM NaCl, 5.3 mM KCl; 13,5 mm CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES e portato a pH 7.4. Il gambero sezionato dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: gamberi Dissected con intatta GI. </li></ol> 2.3) Esperimenti 2.3.1) Le contrazioni nell'animale <ol><li> Sono soluzioni del composto da testare e pronto alla stessa temperatura del bagno salino. Su potrebbe utilizzare soluzioni individuali di serotonina (100 nM, 1microM), glutammato (1microM), e la dopamina (1microM) ha fatto in soluzione salina gamberi come sostanze di partenza da testare. </li><li> Lasciare che il gambero sezionato per sedersi nella soluzione gamberi per circa dieci minuti per permettere di adeguare allo shock della dissezione e l'esposizione salina. Le contrazioni peristalsi lenta dal hindgut dovrebbe iniziare a verificarsi. </li><li> Una volta che iniziano le contrazioni, registrare il numero di contrazioni che si verificano in 30 secondi (si noti il ​​tipo di contrazioni che si verificano: tipo peristalsi cioè, o spastica, e la direzione di eventuali onde peristaltiche). Tabella 1: contrazioni in gamberi di fiume Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Numero di contrazioni </td><td> Tipo di contrazioni </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Utilizzando un pipipetta, rimuovere la soluzione salina nella cavità dell'addome esposti i gamberi, e applicare salini contenenti la sostanza in esame direttamente sul hindgut. </li><li> Subito dopo aver aggiunto la soluzione, registrare il numero di contrazioni che si verificano dopo 30 secondi e prendere nota del tipo di contrazioni che si verificano (cioè peristaltico, o spastica). Tabella 2: contrazioni con l'esposizione a composti <table border="1"><tbody><tr><td> Composto testato </td><td> Concentrazione </td><td> Numero di contrazioni </td><td> Tipo di contrazioni </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Immediatamente dopo la registrazione della risposta alla sostanza in esame, lavare i tempi di GI diverse gamberi con soluzione salina normale. Lasciate che la preparazione per 5 minuti, durante il risciacquo circa ogni 30 secondi con soluzione salina gamberi. </li><li> Usando una pipetta, posto alcune saline contenenti il ​​composto poi esaminare o una concentrazione della sostanza varia ultimi testato direttamente sul hindgut. E 'meglio cominciare con una concentrazione più bassa e così un lavoro di concentrazioni più elevate. </li><li> Immediatamente dopo l'aggiunta di nuove sostanze o di ogni nuova concentrazione, registrare il numero di contrazioni che si verificano dopo 30 secondi e prendere nota del tipo di contrazioni. </li></ol> 2.3.2) le forze di registrazione della contrazione nei preparati escisso <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Setup <ol><li> Fissare il trasduttore al pod ponte. </li><li> Collegare il pod ponte verso il 26T PowerLab. </li><li> Fissare il 26T PowerLab alla porta USB del computer. </li><li> Aperto LabChart7, cliccando sull'icona labchart7 sul desktop. <ul><li> Il Welcome casella Centro LabChart si aprirà. Chiuderlo. </li><li> Fare clic su Setup </li><li> Clicca sulle impostazioni dei canali. Modificare il numero di canali a 1 (in basso a sinistra della scatola) premere OK. </li><li> In alto a sinistra del grafico di cicli al secondo a circa 2k. Impostare il volt (asse y) a circa 500 o 200 mV. </li><li> Clicca sul canale 1 sulla destra del grafico. Clicca su amplificatore di ingresso. Assicurarsi che le impostazioni: single-ended, accoppiamento AC, e invertire (inverte il segnale, se necessario), e anti-alias, sono controllati. </li><li> Per iniziare la stampa avviare la registrazione. </li></ul></li><li> Raccogliete la preparazione e taglio del tratto gastrointestinale nella congiuntura tra il torace e l'addome. Poi accuratamente tagliata intorno alla parte telson della coda. Rimuovere il tratto gastrointestinale dal gambero sezionato e metterla nel piatto Sylgard. C'è un vaso sanguigno che corre lungo la faccia dorsale del tratto gastrointestinale. Estrarre con cautela questo lontano dal tratto GI. Versare salina fresca gamberi sulla preparazione. </li><li> Posizionare il trasduttore di forza nel morsetto in prossimità del gambero sezionato. </li><li> Agganciare il trasduttore di forza nella GI gamberi come mostrato nella Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: hindgut isolata del gambero in soluzione fisiologica attaccato al gancio del trasduttore di forza </li><li> Attendere che il GI comincia a contrarsi, e spingere inizio il LabChart7. </li><li> Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Spingere "stop", e aggiungere un commento etichettato, "Saline solo". Compila la tabella 4. Tabella 4: contrazioni con mescola di interesse <table border="1"><tbody><tr><td> Numero di contrazioni </td><td> Ampiezza delle contrazioni (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere i composti di prova di interesse, e subito premere "start" sul LabChart7. </li><li> Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Premere "stop" e aggiungere un commento direttamente sul file grafico come sostanza a ciò che è stato aggiunto e la sua concentrazione. Compila la tabella qui sotto. Tabella 5: contrazioni con mescola _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Numero di contrazioni </td><td> Ampiezza delle contrazioni (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Risciacquare la preparazione con soluzione salina gamberi con una pipetta. </li><li> Aggiungere altre sostanze o varie concentrazioni in un modo simile. Immediatamente spinta "start" sul LabChart7. </li><li> Lasciare che il programma di funzionare per circa 20 secondi. Spingere "stop", e aggiungere un commento e l'etichetta direttamente sul file grafico che indica la compound utilizzati e la concentrazione. </li></ol> 3. Analisi dei dati <ol><li> Da 2.3.1 dell'esperimento, grafico il numero di contrazioni di ogni soluzione (fisiologica, serotonina, glutammato) in funzione del tempo. Spiegare le tendenze. </li><li> Da 2.3.2 dell'esperimento, grafico il numero di contrazioni di ogni soluzione (fisiologica, serotonina, glutammato) vs l'ampiezza delle contrazioni in mV. Spiegare le tendenze. </li></ol> 3.1) misura la velocità e la forza delle contrazioni Per indicizzare il tasso di contrazione in grado di misurare il tempo dall'inizio su una flessione all'inizio del prossimo o contare le deviazioni totale di più di un minuto o due. I valori possono poi essere messo in termini di contrazioni al minuto o secondo per secondo quanto rapida che si stanno verificando. Per indicizzare la forza delle contrazioni una misura relativa potrebbe essere utilizzato per confrontare diverse condizioni. Sul file salvato si può utilizzare il marcatore "M" e passare alla linea di base. Quindi utilizzare il cursore e passare al picco della deflessione e prendere nota del valore indicato in alto a destra dello schermo come un valore delta (la differenza da M a picco). Si noti il ​​cursore deve essere tenuto fermo per la misura del cambiamento. Quindi spostare il M alla forma nuova ondata di interesse e ripetere la misura.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I dati forniti nel film associati e testo descrivono i passaggi chiave necessari per registrare l&#39;attività nel hindgut del gambero in situ e in vitro. Uno degli obiettivi della nostra relazione è quello di aumentare la consapevolezza del potenziale di questa preparazione a studenti conduzione laboratori investigativi che insegnano concetti fondamentali di fisiologia e farmacologia. Queste preparazioni possono essere utilizzate per indagare su una serie di domande sperimentale che porterà a una migliore comprensione delle funzioni fisiologiche del hindgut. I meccanismi alla base della regolamentazione onde peristaltiche e la loro inversione non sono ancora noti. I meccanismi di maggiore controllo dell&#39;intero tratto gastrointestinale sono, inoltre, non pienamente compresi. La questione di come centri superiori integrare la propria attività con l&#39;uscita autonomo che controlla direttamente il sistema gastrointestinale rimane uno spazio aperto di indagine (Shuranova et al., 2006). Inoltre, la capacità di osmoregolazione del hindgut crostacei e le funzioni di osmoregolazione durante lo stress muta e ambientali non sono stati completamente chiariti. Ci sono ancora molte domande in attesa di risposte in questa preparazione.

<ol><li> Gambero di fiume (Procambarus clarkii). Atchafalaya biologica Supply Co., Raceland, LA., USA. </li><li> Standard di gamberi salina: Modificato dalla soluzione di Van Harreveld (1936). (In mm) 205 NaCl, 5.3 KCl; 13,5 CaCl 2 2H 2 O; 2,45 MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES e portato a pH 7.4. Serotonina, dopamina, glutammato e sono realizzati in soluzione salina gamberi. Tutti i prodotti chimici sono ottenuti da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Strumenti di dissezione: Fine # 5 pinzette, forbici, lama portalama, spille # 26002-20 insetti (tutti ottenuti da Strumenti Scienze Fine (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) </li><li> Sylgard a fondo piatto Petri </li><li> Bicchieri (di tenere soluzioni chimiche) </li><li> I segnali elettrici vengono registrati in linea ad una interfaccia PowerLab 26T a un computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). Noi utilizziamo software standard da ADInstruments nome o Campo Grafico. <li> Ponte pod per il trasduttore di forza (baccelli Ponte differenti sono necessari per i diversi tipi di trasduttori di forza). </li><li> MLT0402 (2 grammi) trasduttore di forza è il grado di ricerca, come mostrato nel video. MLT 0210 / D (10 mg-25 grammi) e la MLT 500 / A (0-500g) sono i trasduttori educativo gradi (ADInstruments). </li></ol>

la sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Lo scopo della relazione è di descrivere le tecniche di dissezione per la preparazione del hindgut gamberi e per dimostrare come fare registrazioni fisiologiche con un trasduttore di forza di monitorare la forza di contrazione. Inoltre, ci dimostrano come monitorare visivamente l&#39;attività peristaltica, che può essere usato come un test biologico per diversi peptidi, amine biogene e neurotrasmettitori. Questa preparazione è suscettibile di laboratori studente in fisiologia e farmacologia per dimostrare concetti agli studenti. Questa preparazione è stato in uso da oltre 100 anni, e offre ancora molto come modello per lo studio della generazione e regolazione del ritmo peristaltica e per descrivere i meccanismi alla base della loro modulazione. I saggi farmacologici e di sub-tipizzazione dei recettori che sono stati avviati più di 50 anni fa sul hindgut contribuiscono ancora oggi alla ricerca. Questa preparazione robusto è adatto a studenti di formazione in fisiologia e farmacologia.

In questo rapporto si dimostra tecniche che possono essere utilizzati per studiare la biologia del hindgut gamberi. Mostriamo come dissezionare un addome gamberi e studiare l&#39;anatomia associati, la fisiologia e la modulazione di attività. L&#39;attività peristaltica e la forza delle contrazioni sono misurati utilizzando un trasduttore di forza.

La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

Lo scopo del rapporto è descrivere le tecniche di dissezione per la preparazione dell'intestino posteriore del gambero e dimostrare come effettuare registrazioni fisiologiche ...

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di costituire uno strumento didattico per studenti di scuola superiore avanzata e universitari dei corsi di fisiologia che partecipano a esperimenti fisiologici. Gli studenti imparano a esporre e registrare le contrazioni nell'intestino posteriore del gambero. Un ulteriore passaggio consiste nell'escindere l'intestino posteriore dall'animale, il che permette l'applicazione diretta di composti.Successivamente, la forza e il ritmo delle contrazioni del muscolo liscio dell'intestino posteriore vengono monitorati applicando diversi agenti farmacologici per esaminare i meccanismi che alterano l'intensità della contrazione. Si ottengono risultati che mostrano l'azione dei modulatori sulle innervazioni neurali o direttamente sul muscolo, in base a saggi farmacologici e sottotipizzazione dei recettori. Salve, sono il dottor J. Mercier del Dipartimento di Scienze Biologiche della Brock University.Ho utilizzato l'intestino posteriore del gambero come preparazione per condurre ricerche sui neurotrasmettitori che controllano i muscoli viscerali. Ho inoltre impiegato questa preparazione come strumento didattico e, nell'ambito di una collaborazione con il laboratorio del Dott. Robin Cooper presso l'Università del Kentucky, stiamo perfezionando diversi esperimenti eseguiti dagli studenti a scopo formativo. Questo metodo può fornire informazioni sul funzionamento dell'intestino posteriore del gambero.È inoltre applicabile negli studi di patologie come quelle che coinvolgono i ritmi peristaltici. Può essere utilizzato anche per descrivere i meccanismi alla base della modulazione dell'innervazione muscolare e nervosa. Gli studenti impareranno a interpretare dati fisiologici e farmacologici attraverso l'uso di agenti farmacologici, neurotrasmettitori e neuroormoni, e acquisiranno una comprensione generale della funzione recettoriale.Per quanto riguarda agonisti e antagonisti, gli studenti costruiranno curve dose-risposta e presenteranno i dati in forma grafica per l'analisi statistica. Per anestetizzare l'animale, posizionare un gambero di lunghezza corporea compresa tra sei e dieci centimetri su del ghiaccio per cinque-dieci minuti. Tenere il gambero anestetizzato dietro le chele con una mano. Tagliare rapidamente dall'orbita oculare fino al centro della testa su entrambi i lati, quindi staccare la testa dal gambero.Il sangue della preparazione sarà appiccicoso durante la manipolazione, quindi lavare gli strumenti al termine. Successivamente, rimuovere le zampe e le chele. Poi tagliare le pinne laterali della coda, lasciando intatta la pinna centrale, e proseguire il taglio lungo il lato dorsale dell'addome fino all'ultimo segmento.Quindi tagliare lungo l'ultimo segmento e lungo l'altro lato. Rimuovere il carapace dorsale. Posizionare l'astice dissecato nella capsula di Petri foderata con carta da sigaretta.Soluzione salina scarsa per gamberi. Per coprire il preparato, utilizzare puntine da dissezione per fissare il preparato alla capsula di Petri. L'intestino posteriore è solitamente circondato da una massa di vasi sanguigni e tessuto connettivo.Rimuoverli con pinzette, avendo cura di non danneggiare l'intestino. L'intestino posteriore è ora visibile lungo l'addome.Lasciare il preparato di gambero dissecato in soluzione salina per circa 10 minuti, in modo che possa riprendersi dallo shock della dissezione e dall'esposizione alla soluzione salina. Osservare le lente contrazioni peristaltiche dell'intestino posteriore. A questo punto, è possibile calcolare la frequenza delle contrazioni.Contare il numero di contrazioni che si verificano in 30 secondi e registrarle in un registro. Registrare anche il tipo di contrazioni che si verificano e se sono peristaltiche o spastiche. Notare la direzione di eventuali onde peristaltiche.Contare la frequenza delle contrazioni vicino all'ano e a metà dell'addome, verificare se esistono differenze di frequenza tra queste due regioni. Avere a disposizione una varietà di soluzioni di prova pronte e alla stessa temperatura della soluzione salina di immersione. La prima soluzione testata qui sarà serotonina uno micromolare preparata in soluzione salina per gamberi di fiume.Utilizzando una pipetta, rimuovere la soluzione salina dalla cavità dell'addome esposto dell'astice e applicare direttamente la soluzione di serotonina da un micromolare sul retto. Immediatamente dopo aver aggiunto la nuova soluzione, attendere 30 secondi e quindi contare le contrazioni avvenute nell'arco di 30 secondi nella zona vicina all'ano, dopodiché contare le contrazioni dei successivi 30 secondi a metà dell'addome. Registrare questi valori in una tabella e annotare anche il tipo di contrazioni che si verificano. Successivo.Versare la soluzione di prova dalla capsula di registrazione e risciacquare l'intestino posteriore diverse volte con soluzione fisiologica normale per gamberi. Quindi risciacquare il preparato ogni 30 secondi per cinque minuti. A questo punto, è possibile aggiungere la successiva soluzione di prova, che in questa dimostrazione è una micromolare di Topamina.Registri le osservazioni come in precedenza e ripeta questo processo per i restanti composti in esame. Quando si utilizzano concentrazioni multiple della stessa sostanza, assicurarsi di iniziare dalla concentrazione più bassa e procedere verso concentrazioni più elevate. L'allestimento per misurare la forza delle contrazioni GI comprende un laptop con il software Lab Chart 7, il Bridge Pod, il Power Lab 26T e il trasduttore di forza.Prima di poter misurare la forza delle contrazioni muscolari del tratto gastrointestinale, è necessario isolare il tratto GI. A tale scopo, asportare i muscoli nell'ultimo segmento addominale, inserire due o più spilli attraverso la cuticola ventrale morbida su entrambi i lati dell'ano, quindi rimuovere il resto dell'addome, lasciando il retto e l'ano attaccati a un piccolo frammento di cuticola. L'intestino deve essere sezionato vicino alla giunzione tra torace e addome.Ora spostare il tratto gastrointestinale in una piastra bassa con fondo rivestito in sardina. Lungo l'aspetto dorsale del tratto gastrointestinale si trova un vaso sanguigno. Rimuoverlo con attenzione dal tratto gastrointestinale.Versare una soluzione salina fresca per gamberi sulla preparazione. Spostare il trasduttore di forza sulla preparazione. Osservare attentamente il perno incollato alla base del trasduttore di forza.La punta che si aggancia all'intestino presenta una piccola curvatura. Agganciare la piccola curvatura del perno all'estremità tagliata dell'intestino posteriore. Dopo aver agganciato l'intestino posteriore, spostare leggermente la piastra finché l'intestino posteriore non risulta teso.Siate cauti in questo passaggio poiché l'intestino deve essere teso, ma non troppo. Se troppo teso potrebbe danneggiare il muscolo. Quando la piastra è nella posizione ottimale, utilizzate cera o argilla per mantenerla ferma.Successivamente, avviare il software. Per iniziare la registrazione, aprire il software Lab Chart. Chiudere il Lab Chart e il Welcome Center.Vai alla configurazione in alto a sinistra. Fai clic su impostazioni del canale in basso a sinistra. Modifica le impostazioni del canale in modo da avere un solo canale.Fare clic su ok nella parte destra dello schermo. Passare al canale uno, aprire il modulo bridge. Impostare la scala sull'impostazione più sensibile, in questo caso 200 microvolt, nella parte superiore del grafico nell'angolo destro.Impostare i cicli al secondo su 2K. Ora sei pronto per registrare. Fare clic su inizia per assicurarsi che l'installazione funzioni correttamente.Toccare leggermente la punta del trasduttore con una pipetta. Si dovrebbe osservare una variazione della forza registrata dal software. Fare clic su stop nel software, quindi su start e lasciare eseguire il programma.Per circa 20 secondi, fare clic su stop e aggiungere un commento etichettato come soluzione salina. Calcolare la frequenza delle contrazioni misurando il tempo che intercorre dall'inizio di una deflessione all'inizio della successiva, oppure contando il numero totale di deflessioni in un minuto o due. Calcolare la frequenza in contrazioni al minuto o in contrazioni al secondo, a seconda della rapidità con cui si verificano.Per misurare la forza delle contrazioni, utilizzare una misura relativa per confrontare le contrazioni in diverse condizioni sul file salvato. Spostare il marcatore M alla linea di base, quindi spostare il cursore fino al picco della deflessione e annotare il valore indicato in alto a destra dello schermo. Questo è un valore delta, ovvero la differenza tra M e il picco.Si noti che il cursore deve essere mantenuto fermo sul picco al fine di misurare la variazione. Successivamente, spostare il marcatore M e il cursore sulla successiva forma d'onda di interesse e ripetere la misurazione per esaminare l'effetto dei modulatori. In questo preparato, passare lentamente alla soluzione di prova.In questo caso, aggiungere un micromolare di serotonina e continuare a registrare la frequenza e la forza delle contrazioni come ultimo test. Per questo preparato, verificare se gli inibitori delle giunzioni comunicanti modificano la frequenza o la forza delle contrazioni; gli inibitori delle giunzioni comunicanti includono etanolo eparinizzato o soluzione salina saturata con anidride carbonica. Questi composti vengono utilizzati per ultimi poiché potrebbero danneggiare le fibre muscolari dopo un'esposizione prolungata. Per confrontare l'effetto dei vari composti, riportare i dati in un grafico.Un altro interessante utilizzo di questa preparazione consiste nel registrare la forza generata dai muscoli circolari. Tuttavia, se si sono applicati inibitori delle giunzioni comunicanti alla preparazione, questi potrebbero aver danneggiato i muscoli circolari; in tal caso, si dovrebbe utilizzare una preparazione fresca dell'intestino posteriore per testare i muscoli circolari. Per esporre i muscoli circolari, praticare un'incisione longitudinale lungo il tubo intestinale con forbici fini.Utilizzare spilli fini per fissare saldamente un lato alla piastra. Collegare lo spillo ad uncino del trasduttore all'altro lato della striscia. Esporre il preparato agli stessi composti testati sui muscoli longitudinali; la relazione tra i composti testati e il numero e tipo di contrazioni è mostrata qui.È possibile tracciare graficamente il numero di contrazioni in funzione del tempo per le soluzioni di soluzione fisiologica, serotonina e glutammato. È possibile riportare graficamente il numero di contrazioni in funzione della forza delle contrazioni in millivolt per le soluzioni di soluzione fisiologica, serotonina e glutammato. Questi grafici possono essere realizzati sia per i muscoli longitudinali che per quelli circolari, al fine di verificare se i muscoli longitudinali e circolari nelle diverse regioni dell'intestino presentano risposte differenti ai vari modulatori.Gli esperimenti sopra descritti possono essere ripetuti su diverse regioni a partire dall'ano e lungo l'addome. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione a non danneggiare il tratto gastrointestinale con le pinzette e di non tirare troppo forte con il trasduttore di forza dopo aver eseguito questa procedura. Altri metodi, come le registrazioni elettrofisiologiche del muscolo, possono essere effettuati per affrontare altri aspetti, quali le funzioni e le modulazioni dei canali ionici, e possono servire come modello per altri tessuti in altri modelli animali.

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