Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come le membrane biologiche possano essere comprese mediante modelli elettrici e illustrare le procedure per la registrazione dei potenziali d'azione dal cordone nervoso ventrale dell'astice. Questa dimostrazione utilizza innanzitutto componenti di un circuito su una basetta sperimentale per rappresentare le proprietà elettriche delle membrane. Il secondo passaggio della procedura consiste nel variare la resistenza e la capacità in un circuito modello per osservarne gli effetti sui tracciati di tensione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'applicare i concetti appresi da un circuito modello a una preparazione nervosa vivente. L'ultimo passaggio della procedura è registrare i potenziali d'azione composti e comprendere le proprietà dei periodi refrattari soglia e della trasmissione sinaptica. In definitiva, i risultati mostrano come l'analisi dei modelli di circuiti elettrici delle membrane biologiche e delle proprietà dei nervi viventi possa rappresentare uno strumento didattico utile, come dimostrato dalla modifica dei componenti di un circuito modello e dalla variazione della stimolazione del nervo vivente.

Questo metodo può fornire informazioni su come le membrane biologiche possono essere comprese in termini di modelli elettrici. Può inoltre essere applicato ad altri tessuti, come il muscolo. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale, poiché la dissezione del cordone nervoso ventrale e l'allestimento della registrazione possono risultare inizialmente difficili e occorre prestare attenzione per evitare di danneggiare i nervi, al fine di ottenere un buon allestimento per la stimolazione e la registrazione dal cordone nervoso.

Nella prima parte dell'esperimento, vengono utilizzati resistori e condensatori per simulare l'attività elettrica della membrana della cellula nervosa. Il circuito iniziale è composto soltanto da resistori. I condensatori vengono aggiunti in una fase successiva.

Le proprietà resistive passive della membrana nervosa sono rappresentate dal circuito mostrato qui. Il circuito è configurato con resistori in parallelo da 33 kilo ohm, che rappresentano la resistenza trasversale della membrana, e resistori in serie da 10 kilo ohm che rappresentano la resistenza intracellulare. Questo circuito presuppone che la resistenza del fluido esterno sia trascurabile rispetto alle resistenze intracellulare e trasversale della membrana.

Quando il modello di cellula è completo, collegare i cavi di uscita del power lab al modello su breadboard. Il power lab genera lo stimolo ed è dotato di una sonda di misurazione per registrare la tensione. Successivamente, collegare il power lab al computer.

Il computer viene utilizzato per visualizzare i segnali elettrici registrati dal breadboard. Il passo successivo consiste nel configurare il software del computer che controllerà lo stimolo inviato dal power lab alla cellula nervosa modello. Aprire il programma lab chart dal desktop.

Selezionare nuovo file, selezionare configurazione, quindi impostazioni del canale. Selezionare un canale da visualizzare, quindi selezionare il pannello dello stimolatore. Sono necessarie impulsi lunghi di 1,5 volt.

Per questa parte dell'esperimento, regolare l'ampiezza a un volt. Il power lab emetterà una tensione che fluttua tra +0,5 e -0,5 volt, il che corrisponde a uno stimolo massimo di un volt. Impostare la frequenza a 0,75 hertz e la durata dell'impulso a un secondo.

Per le impostazioni del canale, selezionare il canale uno da monitorare, fare clic sull'amplificatore di ingresso e nella finestra visualizzata, fare clic sul pulsante differenziale e impostare la scala a cinque volt, quindi selezionare Ok. Il passaggio successivo consiste nell'applicare un segnale elettrico al modello di cellula nervosa ed esaminare l'attenuazione del segnale lungo la lunghezza del modello. Applicare una tensione a un'estremità del circuito tra A e B facendo clic su "start" sul computer.

Misurare la tensione per la prima unità di lunghezza lungo l'assone modello e monitorarla sul computer. Mantenere fisso il cavo rosso del sonda di misurazione della tensione nel punto A della breadboard, mentre si sposta l'altro cavo in diverse posizioni tra le resistenze in serie. Osservare la caduta di tensione nei punti più distanti.

Ora interrompere la registrazione premendo stop sul computer. Misurare le differenze di tensione salvate sulle tracce memorizzate sul computer utilizzando il cursore per spostare la traccia su ciascun impulso registrato. Utilizzare il cursore del marcatore M, situato nell'angolo in basso a sinistra, per segnare il punto più basso della traccia e posizionare il cursore libero sul picco della traccia per misurare la differenza di tensione.

Leggere sullo schermo la misura della differenza di tensione e annotarla sul taccuino per ciascuna posizione di misurazione lungo il circuito. Il passo successivo consiste nel calcolare la costante di lunghezza della cellula modello, utilizzata per descrivere il decadimento esponenziale del segnale in funzione della distanza. Riportare su un grafico della differenza di potenziale in funzione della distanza dalla sorgente ogni valore di differenza di tensione, considerando i resistori della membrana come un'unità.

Oltre al grafico, determinare la costante di lunghezza di questo circuito. La costante di lunghezza di una fibra nervosa è definita come la distanza alla quale una differenza di potenziale attraverso la membrana diminuisce fino al 37% del suo valore iniziale nel punto di origine. Per simulare in modo più accurato le proprietà passive di tipo cavo delle fibre nervose e muscolari, la cellula nervosa modello verrà ampliata per includere componenti sia resistivi che capacitivi.

Non solo esiste una resistenza trasversale della membrana presente nella membrana della cellula nervosa, ma c'è anche una capacità superficiale della membrana, che distorce il segnale della cellula nervosa. Per simulare questo fenomeno, collegare in parallelo alla membrana trasversale dei condensatori da 10 microfarad. I resistori si trovano sulla basetta collegata al computer.

Impostare lo stimolatore su un secondo, un volt, ovvero un'ampiezza di 0,5 volt e impulsi a 0,75 hertz. Inoltre, nell'angolo superiore destro del pannello, impostare la frequenza di acquisizione a 20 K al secondo. Successivamente, fare clic sul canale uno sul lato destro dello schermo.

Fare clic sull'amplificatore di ingresso nella casella. Fare clic sul pulsante differenziale e impostare la portata a cinque volt. Fare clic su OK.

Per salvare queste modifiche, fare clic su start per iniziare a raccogliere i dati. Misurare i dati negli stessi punti lungo la breadboard. Al termine della raccolta dati, utilizzare la finestra di zoom per ingrandire il tempo di salita di uno dei segnali rettangolari.

Ripetere l'ingrandimento secondo necessità per espandere il tracciato. Misurare il tempo necessario affinché il segnale salga dalla linea di base fino al punto più alto del tracciato di tensione, proprio mentre si appiattisce.

Osservare l'andamento temporale del cambiamento di potenziale e la distorsione degli impulsi quadrati. Verificare inoltre se la tensione misurata è superiore a 0,2 volt utilizzando il cursore M e il cursore libero come in precedenza; leggere la variazione di tensione e registrare i dati nel proprio quaderno, assumendo una tensione soglia pari a 0,2 volt. Misurare il tempo necessario affinché il potenziale raggiunga la soglia per ciascun resistore di membrana.

Rappresenti i risultati graficamente riportando il tempo in funzione della distanza e osservi che l'aumento dello spessore della guaina mielinica provoca una diminuzione della capacità della membrana. Simuli questo fenomeno sostituendo i condensatori da 10 micro ferd sulla basetta con condensatori più piccoli da 0.1 micro ferd. Ripeta l'esperimento precedente.

Osservare il cambiamento del tempo necessario per raggiungere la soglia con un resistore selezionato. Sovrapporre i dati ottenuti con i condensatori più grandi al grafico precedente di tempo in funzione della distanza. L'aumento dello spessore della guaina mielinica permette ai segnali elettrici di salire e scendere più rapidamente in una cellula nervosa, aumentando così la velocità di conduzione.

Nella prossima parte dell'esperimento, verranno esaminate le proprietà elettrochimiche degli assoni nel cordone nervoso ventrale dell'astice. Le proprietà della diffusione della corrente passiva presentate nei circuiti modello si osservano anche nei preparati vivi. Tuttavia, un potenziale d'azione è necessario ogni volta che un segnale deve essere trasmesso su una distanza di alcuni millimetri, poiché le proprietà elettriche passive delle cellule attenuerebbero i segnali su tale distanza.

Quando i segnali viaggiano lungo il cordone nervoso ventrale dell'astice con diverse velocità di conduzione, quelli più veloci verranno osservati per primi e quelli più lenti leggermente dopo. Alcuni dei segnali si sommeranno nella registrazione, a seconda della popolazione di assoni con velocità di conduzione simili. Questo segnale elettrico sommato proveniente da più assoni è definito potenziale d'azione composto.

La serie successiva di esperimenti si concentra sulla registrazione di potenziali d'azione composti dai nervi di gambero per ottenere il cordone nervoso ventrale del gambero. Preparare innanzitutto gli strumenti per la dissezione del preparato nervoso e le soluzioni saline. Posizionare il gambero sul ghiaccio per circa cinque minuti per anestetizzarlo.

Dopo aver anestetizzato l'astice di fiume, avvolgerlo in un tovagliolo di carta umido e tenerlo in una mano con le chele posizionate tra pollice e indice. Con l'altra mano, praticare un'incisione con le forbici attraverso il rostro, tra le orbite oculari. Procedere con il taglio verso il basso fino a quando la testa non sarà completamente staccata.

Rimuovere le chele e le zampe ambulatrici. Praticare un'incisione alla base del torace cefalico sopra l'addome e staccare il torace cefalico. Rimuovere la coda e le appendici natatorie.

Eseguire un taglio lungo entrambi i lati della superficie ventrale dell'addome. Prestare attenzione a non danneggiare i tessuti più profondi. Staccare all'indietro la sezione libera dell'esoscheletro fino alla base del ventaglio caudale per esporre il cordone nervoso ventrale.

Utilizzando il bordo della pinzetta, rimuovere con attenzione il cordone nervoso ventrale a partire dall'estremità. Fare attenzione a non stirare né schiacciare il cordone nervoso. Eventuali noduli osservati sul cordone nervoso corrispondono ai gangli del gambero.

Posizionare il cordone nervoso attraverso le sbarre metalliche nella camera per nervi. È fondamentale mantenere il cordone nervoso ventrale umido. A tale scopo, aggiungere nella camera per nervi una quantità sufficiente di soluzione salina per gamberi fino a raggiungere il livello delle sbarre trasversali di metallo.

Successivamente, pipettare via una quantità sufficiente di soluzione salina per gamberi in modo che il livello del liquido tocchi appena la parte inferiore delle barre. Una volta posizionato il cordone nervoso, collegare il cavo dello stimolatore con i due elettrodi a gancio miniaturizzati alla camera del nervo. Collegare il cavo positivo rosso a uno dei loop metallici esterni vicino all'estremità del cordone nervoso e collegare il cavo negativo nero al loop metallico adiacente che è anch'esso a contatto con il cordone nervoso.

Utilizzare il manipolatore per posizionare l'elettrodo a suggente vicino all'estremità del nervo opposta ai collegamenti negativo e positivo. Aspirare con attenzione la punta del cordone nervoso ventrale all'interno dell'elettrodo di registrazione. Fissare l'elettrodo alla sonda dello stadio testa collegando un filo dell'elettrodo a suggente all'ingresso positivo della sonda e l'altro filo all'ingresso negativo.

Non importa quale filo vada a quale ingresso. La sonda può essere messa a terra alla gabbia di Faraday o al bagno salino utilizzando un filo di cloruro d'argento, oppure può essere collegata all'ingresso di massa sul amplificatore differenziale per ridurre il rumore potenziale da 60 hertz. Collegare la sonda all'amplificatore differenziale e connettere l'amplificatore al power lab.

Verificare che le impostazioni per l'amplificatore RS siano quelle indicate nella tabella nell'articolo allegato. Utilizzare il cavo USB per collegare il power lab al computer. Aprire il software scope sul desktop del computer, in alto a destra dello schermo.

Selezionare il canale due e spegnerlo. Regolare lo schermo in modo che venga visualizzato solo il canale uno, trascinando la barra centrale verso il basso dello schermo. Verificare l'amplificatore di ingresso con le impostazioni indicate nel documento allegato.

Quindi, nella sezione impostazione nella parte superiore dello schermo, selezionare stimolatore e disattivare lo stimolo isolato, impostando il ritardo a cinque millisecondi, la durata a un millisecondo, due impulsi, un intervallo di 15 millisecondi, un campo di cinque volt e un'ampiezza di 0,5 volt. Per iniziare a stimolare il cordone nervoso ventrale, fare clic sul pulsante di avvio in basso a sinistra dello schermo. Un potenziale d'azione ben definito dovrebbe apparire nella finestra di acquisizione dati dell'oscilloscopio.

Disegnare la forma generale del potenziale d'azione sul proprio quaderno. Ridurre lentamente la tensione utilizzando la scheda in alto a sinistra dello schermo. L'ampiezza del potenziale d'azione dovrebbe diminuire fino a quando il suo caratteristico andamento ondulatorio scompare.

La riduzione della tensione diminuisce il numero di neuroni reclutati per contribuire al potenziale d'azione composto; per invertire progressivamente questo effetto, aumentare la tensione. Man mano che vengono reclutati più neuroni, l'onda del potenziale d'azione composto aumenta di ampiezza. Questo esercizio illustra il fatto che i singoli neuroni presentano diverse soglie di attivazione, al di sopra delle quali vengono generati i loro potenziali d'azione.

Quando un ulteriore aumento della tensione di stimolazione non provoca un aumento dell'azione composta, tutti i neuroni sono stati reclutati e sullo schermo del computer dovrebbero essere visibili due picchi distinti nell'onda del potenziale d'azione. La parte successiva dell'esperimento esamina il periodo refrattario degli assoni. Modificare il ritardo tra gli impulsi utilizzando la scheda nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.

Continuare ad accorciare il ritardo fino a quando non si riesce più a elicitare il secondo potenziale d'azione composto. Il periodo refrattario assoluto è definito come l'intervallo di tempo tra gli impulsi in corrispondenza del quale non viene più elicitato un secondo potenziale d'azione. Il periodo refrattario relativo è definito come l'intervallo di tempo che va dalla fine del periodo refrattario assoluto al momento in cui la somministrazione di un secondo stimolo determina un potenziale d'azione secondario di ampiezza massima.

Ora è possibile studiare le proprietà di un inibitore delle giunzioni comunicanti come l'eparossietanolo. Le differenze nel potenziale d'azione composto possono essere confrontate utilizzando le stesse impostazioni di stimolazione per determinare quali segnali vengono trasmessi attraverso le giunzioni comunicanti lungo il cordone nervoso ventrale. È inoltre possibile utilizzare soluzione fisiologica fredda o soluzione fisiologica calda e misurare le differenze nelle velocità di conduzione delle diverse componenti che costituiscono il potenziale d'azione composto.

Qui sono mostrati due potenziali d'azione composti registrati dal cordone nervoso ventrale di un gambero. Questa figura illustra il periodo refrattario relativo, ovvero il periodo successivo a un potenziale d'azione composto completo durante il quale uno stimolo secondario provoca un potenziale d'azione composto di minore entità. Questa figura mostra gli effetti dell'uso di eptano sull'ampiezza del potenziale d'azione composto dopo questa procedura.

I componenti del circuito della membrana biologica possono essere variati al fine di rispondere ad ulteriori domande, come l'effetto di una densità modificata di canali di perdita nella membrana o la funzione dei canali attivati dal voltaggio dopo il loro sviluppo. Queste tecniche e procedure aprono la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia per esplorare come le cellule funzionino come circuiti elettrici e come le giunzioni comunicanti svolgano la loro funzione nei tessuti viventi negli animali.