Name: La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Scopri come generare transgeni in Caenorhabditis elegans mediante recombineering con marcatori GalK. Questo metodo preserva gli elementi regolatori nativi per studi di genetica e biologia molecolare.

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Gli autori desiderano ringraziare Lindsey Nash aiuto per sviluppare la tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere AG028977 di ALF, una borsa di progetto pilota presso l&#39;Università di Pittsburgh OAIC (AG024827), e fondi presso l&#39;Università di Pittsburgh.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La generazione di transgeni da fosmids offre il vantaggio di mantenere tutti gli elementi promotore nativo, varianti di splicing, e 3 &#39;UTR elementi di regolamentazione. Questo può portare alla costruzione di un transgene che è più riflettente del pattern di espressione nativa, o la costruzione di un transgene funzionale quando altri approcci non 5. I transgeni risultante può trasportare una varietà di etichette tra cui epitopo GFP o un tag TAP. La costruzione di transgeni coin...

<table><tbody><tr><td>Kit FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di fosfato di potassio 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-desossigalattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasi Phusion del DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base di agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

la produzione di c. elegans transgeni attraverso recombineering con il galk marcatori selezionabili

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La creazione di animali transgenici è largamente utilizzato in C. elegans ricerca compreso l&#39;uso di proteine ​​di fusione GFP per studiare la regolamentazione e pattern di espressione di geni di interesse o di generazione di purificazione in tandem affinità (TAP) tagged versioni di geni specifici per facilitare la loro purificazione. Tipicamente transgeni sono generati mettendo un promotore a monte di un gene reporter GFP o cDNA di interesse, e questo produce spesso un modello rappresentativo di espressione. Tuttavia, gli elementi critici della regolazione genica, come elementi di controllo nella regione non tradotta 3 &#39;o promotori alternativa, potrebbe non essere raggiunto da questo approccio. Inoltre solo una variante di splicing singolo può essere in genere studiati con questo mezzo. Al contrario, l&#39;uso del DNA genomico verme portato da cloni di DNA fosmid comprende probabilmente la maggior parte se non tutti gli elementi coinvolti nella regolazione genica in vivo che permette la maggiore capacità di catturare il modello autentico di espressione e la tempistica. Per facilitare la generazione di transgeni usando il DNA fosmid, ci descrivono un E. coli procedura basata recombineering per inserire GFP, un TAP-tag, o sequenze di interesse in qualsiasi posizione nel gene. La procedura utilizza il gene galK come marcatore di selezione per entrambe le fasi di selezione positiva e negativa in recombineering che si traduce ad ottenere la modifica desiderata con alta efficienza. Inoltre, plasmidi contenenti il gene galK affiancato da braccia omologia con GFP di uso comune e TAP geni di fusione sono disponibili che riducono il costo di oligo del 50% quando si genera un GFP o proteina di fusione TAP. Questi plasmidi utilizzare l&#39;origine replica R6K che esclude la necessità di ampia purificazione dei prodotti PCR. Infine, dimostrano anche una tecnica per integrare il unc-119 marcatore al backbone fosmid che permette fosmid di essere iniettato direttamente o bombardati in vermi per generare animali transgenici. Questo video mostra le procedure coinvolte nella generazione di un transgene attraverso recombineering utilizzando questo metodo.

La capacità di produrre transgeni per<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Usando il DNA genomico portato da fosmids è particolarmente interessante come tutti gli elementi nativi normativo vengono conservati. Descritto è un procedimento semplice e robusto per la produzione di transgeni attraverso recombineering con il<em&gt; GalK</em&gt; Marcatore.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

La creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata nella ricerca su C. elegans, incluso l'uso di proteine di fusione con GFP per studiare la regolazione e...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare transgeni utilizzando il DNA genomico del verme contenuto in un clone di libreria SMID. L'uso del DNA genomico preserva tutti gli elementi di controllo nativi, come gli enhancer nelle regioni UTR tre prime. Questo risultato si ottiene trasferendo il FO smid nel ceppo di E coli SW 1 0 6 per sfruttare il sistema di ricombinazione lambda red inducibile.Come secondo passaggio, il gene GAL K viene inserito nella posizione desiderata nel FO smid, marcando il sito in cui verrà collocato il GFP o il tag tap. Successivamente, il gene Gade viene sostituito con GFP o un TAC tap mediante ricombinazione omologa, seguita da una selezione negativa utilizzando galattosio deossi per generare il transgene modificato. I risultati ottenuti mostrano che questi transgeni possono essere creati rapidamente e con successo, come dimostrato dalla verifica dell'inserzione T mediante PCR su colonie.Ciao, mi chiamo Love Ship. Lavoro nel laboratorio di Fisher presso l'Università di Pittsburgh. Oggi illustrerò la tecnica per la creazione di un transgene C. elegans.Perché ricombinare con GK come marcatore selezionabile. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per la creazione di transgeni Cogan è che in questo approccio utilizziamo il DNA genomico del gene di interesse e siamo quindi in grado di includere tutti gli elementi critici della regolazione genica, come gli elementi di controllo nella regione UTR tre prime, i trascritti di splicing alternativi, i promotori alternativi e gli enhancer distali, che potrebbero essere trascurati negli approcci convenzionali basati sul clonaggio standard. Cominciamo dunque.Ordinare il clone FO smid per il gene di interesse o GOI dal servizio genico utilizzando Worm Base come guida. Quando si selezionano i cloni, scegliamo quelli in cui il GOI si trova al centro della sequenza. I cloni che escludono i geni adiacenti potrebbero essere preferibili, ma potrebbero essere difficili da reperire in coltura.Il clone SMID per il GOI in LB contenente 12,5 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo, gli smid vengono inviati nel ceppo EPI 300 e possono essere coltivati a 37 gradi Celsius. Successivamente, coltivare una cultura notturna di 1,5 millilitri dello SMID a 37 gradi Celsius ed eseguire una mini prep del DNA smid. Utilizzando il kit per la preparazione SMID di Epicenter, seguire il protocollo alternativo descritto nelle istruzioni, che prevede l'aggiunta della miscela Ribo shorter in una fase precedente, determinare la concentrazione del DNA FOSS.L'utilizzo di un campo spettrofotometrico è generalmente molto basso ma adeguato. Per un'elettroporazione di successo, preparare cellule elettrocompetenti SW106 coltivando una coltura di cinque millilitri in brodo LB a 32 gradi Celsius in un tubo da 14 millilitri con tappo a chiusura ermetica.La mattina seguente, inoculare un millilitro della coltura in 100 millilitri di lb in un matraccio da due litri. Far crescere i batteri SW 1 0 6 fino a un OD 600 compreso tra 0,6 e 0,8.Non eseguire il trattamento termico. Raccogliere le cellule in pellet mediante centrifugazione a 5.000 G per cinque minuti. Ri-sospendere il pellet mediante leggero vortex in un millilitro di glicerolo al 10% freddo di ghiaccio.Quindi aggiungere 50 millilitri di glicerolo al 10% freddo di ghiaccio. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta. Infine, pellettare nuovamente lo SW 1 0 6 mediante centrifugazione ed eliminare tutto tranne circa 500 microlitri di ciascun sopranatante Resus.Sospendere i pellet mediante vortex delicato, congelare 100 microlitri di Ali Watts in azoto liquido o su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento della trasformazione. Trasformare il DNA fosmidico in cellule elettrocompetenti SW106 mediante elettroporazione dei batteri con circa 50 nanogrammi di DNA fosmidico in cuvette con interstizio di 0,1 centimetri, utilizzando un elettroporatore EOR 2510 a 1.350 volt. Recuperare i batteri in un millilitro di LB per un'ora a 32 gradi Celsius, piastrare su piastre di LB con cloramfenicolo e incubare a 32 gradi Celsius per tutta la notte.Verificare la presenza del gene di interesse mediante PCR su colonie coltivando una cultura di cinque millilitri in LB con 12,5 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo a 32 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri della cultura a una reazione PCR standard con gli oligonucleotidi adiacenti e aumentare l'incubazione iniziale a 95 gradi Celsius a cinque minuti per lisare i batteri prima della reazione. Infine, preparare una coltura in glicerolo per la conservazione a lungo termine al fine di inserire il gene gal K nel FO smid che contiene il gene di interesse.Preparare innanzitutto piastre con terreno minimo mops contenente il 0,2% di galattosio. Per la ricetta, consultare la parte scritta di questo protocollo. Successivamente, amplificare mediante PCR la cassetta P mod four gal, k, g o P mod four gal K GT.Utilizziamo un gel di fusione o un gel go tac. Purificare il prodotto PCR risultante. Quantificare il rendimento su un gel o mediante uno spettrofotometro NanoDrop.Conservare il prodotto PCR a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Inoculare cinque millilitri di lb e cloramfenicolo con cellule SW 1 0 6 contenenti il DNA Foss. Incubare per tutta la notte a 32 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di coltura notturna a 100 millilitri di lb e cloramfenicolo. In un matraccio da due litri, far crescere fino a un OD compreso tra 0,6 e 0,8.Questo di solito richiede da tre a quattro ore mentre la coltura è in crescita. Impostare un bagnomaria agitato a 42 gradi Celsius per riscaldarlo, inserendo un matraccio sterile da 250 millilitri nel supporto. L'uso di un bagnomaria agitato per il passaggio successivo è fondamentale per ottenere un'alta efficienza.Successivamente trasferire 50 millilitri della coltura SW 1 0 6 nel matraccio da 250 millilitri e sottoporre a shock termico a 42 gradi Celsius e 100 giri al minuto per esattamente 20 minuti nel bagnomaria agitato. Lasciare i batteri rimanenti a 32 gradi Celsius per utilizzarli come controllo non indotto. Raffreddare i batteri indotti e non indotti su ghiaccio per 10 minuti.Trasferire i campioni in due provette sterili per centrifuga e centrifugare a circa 5.000 G per cinque minuti. Rimuovere completamente il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di glicerolo al 10% freddo di ghiaccio mediante vortexaggio delicato. Aggiungere altri 49 millilitri di glicerolo al 10% freddo di ghiaccio.Ripetere questo lavaggio, quindi centrifugare nuovamente. Rimuovere il soprannatante capovolgendo le provette e risospendere il pellet nella piccola quantità di liquido residuo Eloqua in campioni da 100 microlitri. Congelare su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius il giorno seguente.Electroporazione: indurre e non indurre cellule SW106 con 150 nanogrammi del prodotto PCR preparato, utilizzando cuvette con interstizio di 0,1 centimetri in un elettroporatore Einor 25 ton. Impostare a 1.350 volt. Recuperare i batteri in un millilitro di LB in un tubo Falcon da 14 millilitri.Incubare a 32 gradi Celsius per quattro ore e mezza; al termine dell'incubazione, centrifugare i batteri a 13.200 giri/min per 15 secondi e risospendere nel mezzo M nove. Si prega di fare riferimento alla parte scritta di questo protocollo per la ricetta. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.Per rimuovere ogni mezzo ricco, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere in un millilitro di M9 prima di effettuare il saggio di diluizioni seriali su mops. Incubare il mezzo minimo da tre a cinque giorni a 32 gradi Celsius in un incubatore. Avere pazienza poiché i veri positivi crescono lentamente; effettuare un’isolazione su agar Macon per purificare la colonia e verificare che sia positiva per GLK.Le colonie dovrebbero diventare di un rosa brillante. Selezionare una singola colonia e inoculare una coltura di cinque millilitri di lb con cloramfenicolo, da incubare in agitazione durante la notte a 32 gradi Celsius. Confermare l'inserzione del gruppo protettivo gal al sito corretto mediante PCR utilizzando gli oligonucleotidi adiacenti.Fare riferimento alla tabella uno nella parte scritta di questo protocollo. Per le sequenze di oligonucleotidi, aggiungere 0,5 microlitri della coltura a una reazione PCR standard e aumentare l'incubazione iniziale a 95 gradi Celsius a cinque minuti per lisare i batteri. Il prodotto PCR dovrebbe presentare un aumento di dimensione a causa della presenza del gene GAL K.Infine, preparare una coltura in glicerolo per la conservazione. Preparare piastre di terreno minimo MOPS contenenti 0,2% deossigalattosio o DOG e 0,2% glicerolo. Per la ricetta, consultare la parte scritta di questo protocollo. PCR.Amplificare i frammenti del marcatore da PMO 4G FP PBS 1761 o PBS 1479 utilizzando gli stessi oligonucleotidi impiegati nel primo ciclo oppure oligonucleotidi specifici più corti per GFP o tap. Se si stanno preparando costrutti multipli, è particolarmente utile utilizzare gli oligonucleotidi più corti, poiché lo stesso prodotto di PCR può essere impiegato per tutti i costrutti. Purificare il prodotto di PCR su gel. Misurare la concentrazione su gel o mediante spettrofotometro. Generare cellule competenti indotte e non indotte W 1 0 6 che portano il SMID con il gene Gale K come descritto in precedenza. Trasformare le cellule SW 1 0 6 indotte e non indotte con circa 100 nanogrammi di prodotto di PCR utilizzando elettrocuvette con interstizio di 0,1 centimetri in un elettroporatore EINOR 25 10 impostato a 1.350 volt.Raccogliere in un millilitro di LV in un tubo da 14 millilitri con tappo a vite e incubare in uno shaker a 32 gradi Celsius per quattro ore e mezza. Lavare e diluire le cellule in M9 come mostrato in precedenza. Piastrare i batteri su mops, mezzo minimo contenente 0,2% DOG e 0,2% glicerolo, e incubare le piastre a 32 gradi Celsius per tre giorni per confermare la presenza dell'inserzione.Utilizzare quattro colonie per inoculare colture notturne di cinque millilitri in LB con 12,5 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo. Eseguire la PCR su colonia come descritto in precedenza. Utilizziamo sia gli oligonucleotidi specifici più corti per GFP sia gli oligonucleotidi flanking per dimostrare l'inserzione corretta e il sito corretto.GFP è di circa 800 paia di basi. TAP è di circa 550 paia di basi e gal KT è di 1,4 chilobasi. Infine, preparare una coltura glicerolata per la conservazione a lungo termine.La modifica di FO smed mediante ricombinazione fornisce risultati robusti e tassi di successo superiori al 90% nel passaggio di selezione negativa, che vengono regolarmente osservati. Inoltre, questo protocollo richiede circa due settimane per essere completato, rendendo la preparazione dei transgeni piuttosto rapida. Sono state identificate 48 colonie su piastre DOG e utilizzate per la PCR di colonia con gli oligonucleotidi flag GFP, che hanno amplificato l'inserzione GFP in questo esperimento. 47 su 48 colonie sono corrette e una colonia non è stata modificata correttamente, come mostrato dalle 48 colonie identificate su piastre DOG e utilizzate per la PCR di colonia con gli oligonucleotidi flag GFP, che hanno amplificato l'inserzione GFP in questo esperimento.46 su 48 colonie sono corrette e due colonie non sono state modificate correttamente. Il punto più importante da tenere a mente durante l'esecuzione di questo esperimento è che i batteri SW106 devono essere coltivati a 32 gradi Celsius e non a temperature più elevate, poiché la crescita a temperature più alte selezionerebbe mutanti con mutazioni che compromettono il sistema Lambda red. Buona fortuna con il vostro esperimento.

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Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Questo protocollo descrive una procedura rapida e a basso consumo di materiale per l'integrazione di array extracromosomici transgenici nel genoma di Caenorhabditis elegans utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV). Inoltre, questo protocollo è particolarmente adatto per le linee transgeniche che trasmettono array extracromosomici ad alta velocità.

Un protocollo rapido per l'integrazione di array extracromosomici con un'elevata velocità di trasmissione nel genoma di C. elegans

Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

Studi struttura-funzione nel topo cellule staminali embrionali Uso ricombinasi mediata Cassette Scambio

Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.

Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis

Un flusso di lavoro di microiniezione CRISPR/Cas9 per il marcattura fluorescente endogena nella linea germinale di Caenorhabditis elegans per ottenere linee di knock-in omozigoti per l'analisi in vivo della localizzazione delle proteine.

Marcatura Endogena Fluorescente mediata da CRISPR/Cas9 dei geni specifici della linea germinale in Caenorhabditis elegans

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ)...

Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Scopri come generare transgeni in Caenorhabditis elegans mediante recombineering con marcatori GalK. Questo metodo preserva gli elementi regolatori nativi per studi di genetica e biologia molecolare.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

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