Name: La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Scopri come generare transgeni in Caenorhabditis elegans mediante recombineering con marcatori GalK. Questo metodo preserva gli elementi regolatori nativi per studi di genetica e biologia molecolare.

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Gli autori desiderano ringraziare Lindsey Nash aiuto per sviluppare la tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere AG028977 di ALF, una borsa di progetto pilota presso l&#39;Università di Pittsburgh OAIC (AG024827), e fondi presso l&#39;Università di Pittsburgh.

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<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
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<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
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<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
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<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La generazione di transgeni da fosmids offre il vantaggio di mantenere tutti gli elementi promotore nativo, varianti di splicing, e 3 &#39;UTR elementi di regolamentazione. Questo può portare alla costruzione di un transgene che è più riflettente del pattern di espressione nativa, o la costruzione di un transgene funzionale quando altri approcci non 5. I transgeni risultante può trasportare una varietà di etichette tra cui epitopo GFP o un tag TAP. La costruzione di transgeni coin...

<table><tbody><tr><td>Kit FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di fosfato di potassio 0,132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-desossigalattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasi Phusion del DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>Base di agar MacConkey</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

la produzione di c. elegans transgeni attraverso recombineering con il galk marcatori selezionabili

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

La creazione di animali transgenici è largamente utilizzato in C. elegans ricerca compreso l&#39;uso di proteine ​​di fusione GFP per studiare la regolamentazione e pattern di espressione di geni di interesse o di generazione di purificazione in tandem affinità (TAP) tagged versioni di geni specifici per facilitare la loro purificazione. Tipicamente transgeni sono generati mettendo un promotore a monte di un gene reporter GFP o cDNA di interesse, e questo produce spesso un modello rappresentativo di espressione. Tuttavia, gli elementi critici della regolazione genica, come elementi di controllo nella regione non tradotta 3 &#39;o promotori alternativa, potrebbe non essere raggiunto da questo approccio. Inoltre solo una variante di splicing singolo può essere in genere studiati con questo mezzo. Al contrario, l&#39;uso del DNA genomico verme portato da cloni di DNA fosmid comprende probabilmente la maggior parte se non tutti gli elementi coinvolti nella regolazione genica in vivo che permette la maggiore capacità di catturare il modello autentico di espressione e la tempistica. Per facilitare la generazione di transgeni usando il DNA fosmid, ci descrivono un E. coli procedura basata recombineering per inserire GFP, un TAP-tag, o sequenze di interesse in qualsiasi posizione nel gene. La procedura utilizza il gene galK come marcatore di selezione per entrambe le fasi di selezione positiva e negativa in recombineering che si traduce ad ottenere la modifica desiderata con alta efficienza. Inoltre, plasmidi contenenti il gene galK affiancato da braccia omologia con GFP di uso comune e TAP geni di fusione sono disponibili che riducono il costo di oligo del 50% quando si genera un GFP o proteina di fusione TAP. Questi plasmidi utilizzare l&#39;origine replica R6K che esclude la necessità di ampia purificazione dei prodotti PCR. Infine, dimostrano anche una tecnica per integrare il unc-119 marcatore al backbone fosmid che permette fosmid di essere iniettato direttamente o bombardati in vermi per generare animali transgenici. Questo video mostra le procedure coinvolte nella generazione di un transgene attraverso recombineering utilizzando questo metodo.

La capacità di produrre transgeni per<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Usando il DNA genomico portato da fosmids è particolarmente interessante come tutti gli elementi nativi normativo vengono conservati. Descritto è un procedimento semplice e robusto per la produzione di transgeni attraverso recombineering con il<em&gt; GalK</em&gt; Marcatore.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

La creazione di animali transgenici è ampiamente utilizzata nella ricerca su C. elegans, incluso l'uso di proteine di fusione con GFP per studiare la regolazione e...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare transgeni utilizzando il DNA genomico del verme contenuto in un clone di libreria SMID. L'uso del DNA genomico preserva tutti gli elementi di controllo nativi, come gli enhancer nelle regioni UTR tre prime. Questo risultato si ottiene trasferendo il FO smid nel ceppo di E coli SW 1 0 6 per sfruttare il sistema di ricombinazione lambda red inducibile.Come secondo passaggio, il gene GAL K viene inserito nella posizione desiderata nel FO smid, marcando il sito in cui verrà collocato il GFP o il tag tap. Successivamente, il gene Gade viene sostituito con GFP o un TAC tap mediante ricombinazione omologa, seguita da una selezione negativa utilizzando galattosio deossi per generare il transgene modificato. I risultati ottenuti mostrano che questi transgeni possono essere creati rapidamente e con successo, come dimostrato dalla verifica dell'inserzione T mediante PCR su colonie.Ciao, mi chiamo Love Ship. Lavoro nel laboratorio di Fisher presso l'Università di Pittsburgh. Oggi illustrerò la tecnica per la creazione di un transgene C. elegans.Perché ricombinare con GK come marcatore selezionabile. Il vantaggio principale di questa tecn

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RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici...

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Le proteine ​​contengono spesso più domini che possono esercitare diverse funzioni cellulari. Gene knock-out (KO) non considerano questa diversità funzionale. Qui riportiamo un cambio cassette ricombinazione mediata (RMCE) approccio basato lo struttura-funzione in cellule staminali embrionali KO che consente la dissezione molecolare dei vari domini funzionali o varianti di una proteina.

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