Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T

I canali del calcio attivati dal rilascio di calcio, o canali CRAC, che si trovano nella membrana plasmatica, svolgono un ruolo importante nella proliferazione dei linfociti T e nella stimolazione dell'espressione genica. L'attivazione dei recettori dei linfociti T mediante un antigene porta alla formazione del secondo messaggero trifosfato di adenina e all'attivazione del rilascio di calcio dal deposito attraverso i recettori per il trifosfato di adenina. La riduzione della concentrazione di calcio all'interno del deposito induce l'attivazione dei canali CRAC e conseguentemente un aumento della concentrazione citosolica di calcio. Anomalie nella funzione dei canali CRAC nei linfociti T sono associate a numerose malattie umane, tra cui i disturbi da immunodeficienza combinata grave e le malattie autoimmuni.

Viene qui presentato un metodo che permette di registrare in modo affidabile e riproducibile le correnti endogene di calcio e sodio attraverso i canali di rilascio dai linfociti T umani. In primo luogo, viene applicato l'FSA garin, un inibitore della calcio-ATPasi del reticolo sarcoplasmatico-endoplasmatico, in una soluzione extracellulare priva di calcio e contenente tre millimolari di magnesio, al fine di svuotare le riserve intracellulari.

Questa procedura apre i canali crack ma non induce corrente di crack a causa della scarsa permeabilità dei canali crack al magnesio. Successivamente, viene stabilito un voltage clamp in configurazione a intera cellula sulla membrana di una cellula T. La cellula viene perfusa con una soluzione per pipetta contenente un'alta concentrazione del chelante del calcio pta.

Successivamente, vengono applicate in modo sequenziale soluzioni extracellulari contenenti calcio o prive di cationi bivalenti, per attivare le correnti misurabili di calcio e sodio attraverso i canali crack. I dati ottenuti dimostrano il livello di espressione funzionale dei canali crack nei linfociti T umani a riposo. Lo studio delle correnti di membrana attraverso i canali crack può fornire informazioni preziose sulla regolazione e sulle funzioni di questi canali, contribuendo a chiarire il ruolo dei canali crack nelle risposte immunitarie normali e nelle malattie immunologiche.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni dei linfociti T umani e della bassa ampiezza delle correnti endogene di crack in queste cellule. I linfociti T umani positivi per il CD3 per questo esperimento sono stati ottenuti da un campione di sangue periferico di un volontario sano e isolati utilizzando il cocktail di arricchimento per linfociti T umani tep e il mezzo di densità TEP. Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato, le cellule sono state mantenute in mezzo di coltura per linfociti T a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio.

Preparare le seguenti soluzioni: soluzione numero uno contenente tre millimoli di magnesio e nessun calcio, soluzione numero due contenente 20 millimoli di calcio, soluzione numero tre contenente 10 millimoli di chelante del calcio, H-E-D-T-A, e nessun ione bivalente, e soluzione per pipetta contenente 12 millimoli di chelante del calcio bta. Conservare le soluzioni a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Nel giorno dell'esperimento, tirare le pipette con un diametro della punta di circa due micron utilizzando capillari di vetro e un tiratore di pipette.

Utilizzare un tubo capillare in silice con filamento avente le specifiche indicate qui e elencate nel testo allegato. Dopo il tiraggio, le punte delle pipette vengono ricoperte con un rivestimento protettivo semiconduttore PEC R 61 0 1 e lucidate alla fiamma. Conservarle in un luogo protetto dalla polvere, ad esempio in un portapipette.

Aprire il software di controllo dell'amplificatore per patch clamp qui. Un amplificatore per patch clamp EPC 10 è controllato dal software Pulse. Configurare e salvare l'allestimento sulle macro cella e macro cella intera utilizzate per la formazione del gigaseal e per l'instaurazione della configurazione in modalità whole cell.

Successivamente, nel software di acquisizione, configurare e salvare qui il protocollo di stimolazione per registrare le correnti di perforazione. Il protocollo di acquisizione nella finestra di generazione dell'impulso è impostato come una rampa di tensione da meno 120 a più 100 millivolt per una durata di 50 millisecondi.

Creare due protocolli di stimolazione con frequenze di stimolazione a rampa di tensione di 0,5 hertz e cinque hertz, e salvarli nella finestra di generazione degli impulsi con i nomi rispettivamente di rampa uno e rampa due. Per preparare le cellule, piastrare 500 microlitri della sospensione cellulare contenente da 0,2 a 0,5 milioni di cellule in una camera di registrazione costituita da un'ogiva rivestita di poliolisina con un anello di silicone O fissato. Incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, fissare la camera di registrazione in un supporto per camera. In questo caso, si utilizza un supporto per camera personalizzato, in cui la parte inferiore sostiene il coprioggetto sul fondo della camera e la parte superiore preme contro la superficie superiore del coprioggetto. Posizionare il supporto per camera sul portapreparati del microscopio invertito utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 40x e un'illuminazione a campo chiaro.

Trova un campo di cellule e metti a fuoco. Posiziona l'elettrodo di riferimento al cloruro di argento nell'ambiente. Quindi allinea un sistema di perfusione multicanale a gravità posizionando la punta del tubo di ingresso a 45 gradi rispetto al vetrino, vicino al campo visivo; il tubo di aspirazione viene inserito nella parte superiore del supporto della camera.

Ruotare la parte superiore del supporto della camera fino a quando il tubo di aspirazione si trova opposto al tubo di ingresso per eseguire il canale corretto. Le registrazioni della corrente iniziano aprendo la valvola del sistema di perfusione per perfondere la camera di registrazione con soluzione priva di calcio. Soluzione bat numero uno contenente 3 millimolari di magnesio, integrata con 0,5-1 micromolare di AP argon per 8-10 minuti al fine di bloccare la pompa circa.

Questo passaggio esaurisce la riserva di calcio. Successivamente, utilizzare un microcaricatore einor con una pipetta ad aria a spostamento P 20. Per riempire la pipetta con la soluzione, inserirla nel supporto sulla piattaforma dell'amplificatore qui.

Un dispositivo personalizzato per pressione e aspirazione viene collegato all'aria pressurizzata e alle linee del vuoto. Per generare una pressione positiva o negativa in una pipetta per il patch, applicare una leggera pressione positiva di circa tre pollici di colonna d'acqua all'interno della pipetta collegando la pipetta all'uscita del dispositivo per pressione e aspirazione tramite il tubo di collegamento. Fare clic sul tasto di controllo della configurazione nella finestra del patch clamp EPC 10 sullo schermo del computer.

Per eseguire la macro di configurazione. Individuare una cellula rotonda di dimensioni medie con una superficie esterna liscia, ben aderente al vetrino coprioggetto. Successivamente, abbassare l'elettrodo per il patch nel bagno sotto controllo visivo tramite il microscopio nella finestra dell'oscilloscopio.

La corrente che scorre attraverso la pipetta può essere osservata dopo aver immerso la pipetta nella soluzione di bagnetto. Un cambiamento a gradino nell'ampiezza della corrente è provocato dall'impulso di tensione di prova di cinque millivolt applicato alla pipetta tramite la macro di configurazione. Il software calcola automaticamente la resistenza della pipetta e la visualizza nella finestra della resistenza della membrana.

Sullo schermo del computer, la resistenza della pipetta è solitamente compresa tra cinque e sei megaohm. Fare clic sul tasto di controllo automatico nella finestra dell'amplificatore sullo schermo del computer per correggere il potenziale di offset generato tra la pipetta e l'elettrodo di riferimento. La corrente di base si sposterà a un livello di corrente zero.

Utilizzare il micromanipolatore per portare la punta della pipetta a contatto con la membrana cellulare. Una volta stabilito il contatto, si osserverà una diminuzione dell'ampiezza della corrente evocata dall'impulso di prova. Applicare una pressione negativa compresa tra 20 e 40 pollici di acqua alla pipetta per il patch.

Monitorare la formazione del giga-seal nella finestra dell'oscilloscopio. L'ampiezza della corrente evocata dall'impulso di prova dovrebbe diminuire gradualmente all'aumentare del valore della resistenza della pipetta fino a superare i cinque gigaohm. Di solito il contatto del giga-seal si forma rapidamente, ma può richiedere da uno a due minuti per ottenere un giga-seal stabile.

Una volta ottenuto il sigillo giga, scollegare il porta-pipetta dal dispositivo di aspirazione a pressione rimuovendo il tubo di collegamento dall'uscita. Fare clic sul tasto di controllo onsell sullo schermo del computer per eseguire la macro onsell, precedentemente impostata prima dell'esperimento. Secondo il manuale EPC 10, compensare la capacità della pipetta facendo clic sul tasto di controllo automatico nella finestra cfat.

Nella finestra dell'oscilloscopio, il transitorio di corrente scomparirà e il valore della capacità della pipetta verrà visualizzato nella finestra cfat per rompere la membrana cellulare. All'interno della pipetta, collegare la pipetta a una siringa da 20 centimetri cubici tramite il tubo di collegamento e tirare indietro lo stantuffo per applicare una pressione negativa aggiuntiva alla pipetta. Quando la membrana cellulare all'interno della pipetta si rompe, appariranno due transitori di corrente che caricano la membrana cellulare a un nuovo livello di tensione. Fare clic sul tasto di controllo della modalità "whole cell" sullo schermo del computer per eseguire la macro preimpostata per la modalità "whole cell".

Quindi, impostare il potenziale di mantenimento a più 30 millivolt nella finestra V membrana; un potenziale di mantenimento positivo aiuta a prevenire l'attivazione del canale dello crack dipendente dal calcio. Successivamente, fare clic sul tasto auto controllo nella finestra C lenta. Per compensare la capacità cellulare nella finestra dell'oscilloscopio, il transitorio di corrente scomparirà.

I valori di capacità cellulare e resistenza in serie appariranno rispettivamente nelle finestre C lenta e R serie. La resistenza in serie è tipicamente compresa tra sette e venti megaohm. I valori di C lenta, che corrispondono alla capacità cellulare, sono generalmente nell'intervallo da 1,5 a 2,5 picofarad.

Nelle cellule T umane a riposo, fare clic sul tasto di controllo rampa uno nella finestra dell'oscilloscopio per applicare una serie di rampe di tensione con una frequenza di 0,5 hertz. Questo eseguirà il protocollo di stimolazione generato e salvato in precedenza nella finestra dell'oscilloscopio. Verranno mostrate le correnti evocate dalle rampe di tensione. Registrare.

Queste tracce di corrente in soluzione priva di calcio numero uno contenente tre millimolari di magnesio. In questa soluzione, la corrente del canale CRAC è molto piccola a causa della scarsa permeabilità dei canali CRAC al magnesio. Utilizzare queste tracce nelle analisi future come correnti di perdita.

L'ampiezza assoluta della perdita a meno 100 millivolt dovrebbe essere uguale o inferiore a cinque picoampere. Se la cellula è permeabile, interrompere l'esperimento e ricominciare con una nuova pipetta per il patch e una nuova cellula.

Successivamente, per registrare la corrente del calcio attraverso i canali CRAC, commutare le valvole di perfusione in modo da sostituire la soluzione di bagnatura numero uno con la soluzione di bagnatura numero due contenente 20 millimolare di calcio. Questo consente agli ioni calcio di fluire attraverso i canali CRAC e di produrre una corrente entrante nella finestra dell'oscilloscopio. Una corrente del calcio rettificante entrante attraverso i canali CRAC sviluppa un'ampiezza di corrente a potenziali negativi, continuando ad aumentare per circa un minuto a causa della potenziamento dipendente dal calcio della corrente CRAC.

Fare clic sul tasto di controllo rampa due nella finestra dell'oscilloscopio per eseguire un protocollo di stimolazione preimpostato, che modifica la frequenza di stimolazione mediante rampe di tensione con un aumento di cinque hertz nella frequenza di stimolazione, utile per registrare la corrente sodica massimale attraverso i canali crack, di natura transitoria. Successivamente, commutare nuovamente le valvole di perfusione per sostituire la soluzione di bagno numero due con la soluzione numero tre contenente sodio e priva di cationi bivalenti nella finestra dell'oscilloscopio. Si sviluppa una corrente sodica transitoria di maggiore ampiezza con rettificazione entrante attraverso i canali crack.

Una volta terminato l'esperimento, chiudere il file: ciò consente di salvare le tracce di corrente registrate per un'analisi successiva. Per analizzare i dati, recuperare i record di corrente salvati nel software di analisi. In questo caso, si utilizza il software Pulse, impiegando coppie di cursori nella finestra dell'oscilloscopio del programma Pulse. Misurare le ampiezze di corrente all'inizio e alla fine delle rampe di tensione.

Le ampiezze della corrente vengono misurate a meno 100 millivolt e a più 100 millivolt. Esportare i valori delle ampiezze della corrente in un programma grafico come il software Origin per grafici e analisi scientifici. Per ulteriori analisi e rappresentazioni grafiche, le correnti di crack sono state misurate in cellule T di riposo CD3 positive provenienti da un soggetto umano sano utilizzando il metodo qui descritto; questa figura mostra l'andamento temporale delle correnti di crack registrate in configurazione di voltage clamp in tutta la cellula a meno 100 millivolt, indicati dai cerchi pieni, e a più 100 millivolt, indicati dai cerchi vuoti.

Prima della formazione del giga-ohm seal, la cellula è stata pre-incubata per circa 10 minuti nella soluzione da bagno numero uno priva di calcio e contenente 3 millimolari di magnesio con 0,5 micromolari di ortogon dopo il break-in. Le soluzioni sono state applicate in sequenza nel seguente ordine: soluzione da bagno numero uno priva di calcio e contenente 3 millimolari di magnesio, seguita dalla soluzione da bagno numero due contenente 20 millimolari di calcio, seguita dalla soluzione da bagno numero tre priva di cationi bivalenti, seguita nuovamente dalla soluzione da bagno numero due contenente 20 millimolari di calcio. La cellula è stata stimolata con una serie di rampe di tensione da meno 120 millivolt a più 100 millivolt come mostrato qui.

Ramp di tensione sono stati applicati ogni 200 millisecondi, ovvero a una frequenza di cinque hertz, nella soluzione di bat numero tre priva di cationi bivalenti, e ogni due secondi, ovvero a una frequenza di 0,5 hertz, in tutte le altre soluzioni. Si noti lo sviluppo lento della corrente del calcio attraverso i canali crack dopo l'applicazione della soluzione di bat numero due contenente 20 millimolari di calcio, e lo sviluppo rapido e transitorio della corrente del sodio attraverso i canali crack nella soluzione di bat numero tre priva di cationi bivalenti. Questa figura mostra tracce di corrente rappresentative registrate durante i ramp di tensione in assenza di calcio.

Soluzione bat numero uno contenente magnesio 3 mM, soluzione bat numero due contenente calcio 20 mM e soluzione bat libera da cationi bivalenti. Numero tre, i tracciati della corrente di calcio e di sodio durante le singole rampe di tensione possono essere ottenuti sottraendo le correnti registrate nella soluzione bat numero uno priva di calcio e contenente magnesio 3 mM dalle correnti registrate nella soluzione bat numero due contenente calcio 20 mM e nella soluzione bat priva di cationi bivalenti numero tre. I tracciati di corrente risultanti mostrano relazioni corrente-tensione tipiche delle correnti di calcio e sodio attraverso canali crack. Tali tracciati sono visibili qui.

Una volta padroneggiata questa tecnica e una volta eseguiti correttamente tutti i passaggi della procedura, è possibile registrare correnti di canale di crack da cinque a dieci cellule al giorno. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare correnti di correzione a riposo in linfociti T umani. Seguendo questa procedura, si dovrebbe essere inoltre in grado di registrare correnti corrette in altre cellule del sistema immunitario, come linfociti T umani attivati, monociti, macrofagi e anche linee cellulari. Elettrofisiologico.

La registrazione delle correnti ioniche nei canali delle cellule del sistema immunitario potrebbe consentire ai ricercatori di chiarirne il ruolo nell'omeostasi del calcio nelle cellule immunitarie.