Name: Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Impara la registrazione patch clamp whole-cell delle correnti CRAC nei linfociti T umani. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare il signaling del calcio e le malattie immunologiche associate.

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Siamo grati al Dipartimento di Fisiologia e membrana Biologia, Università di California Davis per averci fornito servizi e un ambiente eccellente per lo studio dei canali ionici.

1. Preparazione di riposo linfociti T umani <ol><li> Utilizzando Cocktail RosetteSep umani arricchimento cellule T e Medium Density RosetteSep, purificare le cellule T da campioni di sangue umano secondo le istruzioni del produttore. La popolazione cellulare risultante dovrebbe contenere 95% di cellule T CD3 + riposo. Noi purificare i linfociti T umani da campioni di sangue periferico raccolti da volontari sani in conformità al protocollo approvato dal Consiglio di UC Davis interno Review. </li><li> Dopo l'isolamento, risospendere riposo le cellule T ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml nel terreno di coltura contenente RPMI-1640 medium con la glutamina e HEPES, integrati da siero di vitello fetale del 10%, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 vitamina soluzione, 1% RPMI 1640 aminoacidi soluzione, piruvato di sodio 1% e 0,03% β-mercaptoetanolo. </li><li> Luogo sospensione di cellule in fiasche di coltura cellulare e di mantenere a 37 ° C in un incubatore umidificato al 5% di CO 2 fino a 24 ore prima dell'esperimento. </li></ol> 2. Preparazione della Camera di registrazione <ol><li> I seguenti sono necessari per preparare camere di registrazione: a) al silicio O-ring, b) rotondo, 25 mm coprioggetto pulito con etanolo al 70% e distillata H 2 O, c) miscelato Sylgard184, preparati secondo le istruzioni del produttore e d) due 60 x 15 mm Petri. </li><li> Luogo ~ 0,5 mL di misto Sylgard184 in un 60x15 mm piastra di Petri. </li><li> Immergere la parte inferiore della O-ring nel pinze Sylgard184 utilizzando. </li><li> Rimuovere l'eccesso Sylgard184 dal bordo della O-ring mettendo l'O-ring su una superficie pulita, come un altro piatto di Petri. </li><li> Posizionare l'anello sul coprioggetto e premere verso il basso. </li><li> Curare la Sylgard184 dal riscaldamento delle camere a 85 ° C per 40-60 minuti o fino a quando il Sylgard184 è polimerizzato. </li><li> Memorizzare le camere di registrazione in un contenitore privo di polvere. </li></ol> 3. Preparazione del Pipette Patch <ol><li> Il giorno dell'esperimento, tirare pipette con diametro punta ~ 2-micron utilizzando vetro capillari e un estrattore pipetta. Utilizziamo tubi in vetro borosilicato con filamento (OD: 1,5 mm e ID: 1,10 mm). Pipette conservare in un luogo privo di polvere. </li><li> Cappotto puntali con Sylgard184 o HIPEC rivestimento protettivo Semiconductor R6101, secondo una procedura standard 9. </li><li> Delicatamente fuoco lucidare le pipette prima dell'esperimento. </li></ol> 4. Patch Morsetto Preparazione installazione <ol><li> Configurare e salvare le macro per la formazione gigaseal nel software di controllo del vostro patch-clamp amplificatore. Usiamo un EPC-10 amplificatore supportata da Windows XP e software Pulse per l'acquisizione dei dati. Abbiamo impostato il "set-up", "a-cella", e "a cellula intera" macro secondo la EPC-10 manuale e utilizzarli per tutti gli esperimenti. </li><li> Preparare le soluzioni di bagno e soluzioni pipetta elencati nella tabella 1 prima l'esperimento e conservarli a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Prodotti chimici </td><td colspan="3"> Soluzioni per vasca da bagno (mM) </td><td> Soluzioni pipetta (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> Bapta </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzioni per le registrazioni CARC intera-cella corrente. Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. <ol start="3"><li> Determinare i potenziali di giunzione liquida (LJ) tra la soluzione di pipetta di patch e ogni soluzione da bagno 10. Salvare il valore LJ nel luogo appropriato utilizzando il software di acquisizione. Per esempio, nel programma Pulse inserire il valore LJ in controllo "LJ" nella finestra "amplificatore". </li><li> Configurare e salvare i protocolli di stimolazione, come mostrato nella Figura 1, nell'apposito spazio del vostro software di acquisizione prima che gli esperimenti. Nel programma Pulse, abbiamo impostato il protocollo di acquisizione della "Generazione Pulse" finestra. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. . Protocollo di stimolazione rampa di tensione da -120 a +100 mV di 50 ms di durata viene applicata ogni 0,2 - 2 s (5 - 0,5 Hz). Potenziale Holding (V h) tra le rampe è mantenuta a 30 mV. </li></ol> 5. Le cellule di montaggio sullo stage microscopio <ol><li> Cappotto le camere di registrazione con poli-L-lisina per ~ 20 minuti e lavare con H 2 O e poi con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) prima di placcatura le cellule. </li><li> Piatto 500 microlitri di sospensione cellulare contenente 0,2-0,5 x10 6 celle nella camera e incubare per 20 minuti a 37 ° C. </li><li> Fissare la camera di registrazione con le cellule attaccato in un supporto da camera. Noi usiamo una misura porta della camera, dove la base sostiene la parte inferiore del vetrino, mentre la parte superiore leggermente preme contro la parte superiore del coprioggetto. </li><li> Posizionare il supporto da camera sul palco del microscopio invertito. </li><li> Concentrarsi sulle cellule in luce trasmessa. Usiamo un obiettivo 40X immersione in olio. </li><li> Posizionare la Ag / AgCl elettrodo di riferimento nella vasca. </li><li> Allineare l', multibarrel gravità sistema guidato perfusione. La punta del tubo di flusso deve essere posizionato ad un angolo di 45 ° fino alla fine coprioggetto al campo di vista. </li><li> Posizionare il tubo di aspirazione di fronte alla punta del tubo di afflusso. </li><li> Profumato la camera con tampone fosfato salino (PBS) o HBSS per lavare via i media di coltura cellulare e le cellule debolmente collegate. </li></ol> 6. CRAC Canale Correnti di registrazione <ol><li> Trova una cella che è saldamente attaccato al vetrino. Noi di solito selezionare una media grandezza, cellule rotonde con una superficie esterna liscia. </li><li> Profumato della camera di registrazione con Ca 2 +-free, 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 (tabella 1) contenente 0,5-1 thapsigargin mM per 8-10 minuti per bloccare la pompa SERCA. Eseguiamo questa operazione per esaurire il negozio prima della formazione gigaseal. </li><li> Utilizzando un microloader Eppendorf e un P-20 pipetta a spostamento, riempire la pipetta di patch con la soluzione di pipetta (Tabella 1) e inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta sulla headstage amplificatore. Il Ca 2 + chelante Bapta è incluso nella soluzione pipetta ad esaurire passivamente il negozio e per ridurre Ca 2 +-dipendente inattivazione del canale CRAC. </li><li> Applicare una piccola quantità di pressione positiva (~ 3 pollici di H 2 O) dentro la pipetta di patch prima di entrare nel bagno. Noi usiamo una misura della pressione di aspirazione dispositivo collegato ad aria compressa e le linee di vuoto per creare una pressione positiva o negativa all'interno di una pipetta di patch. </li><li> Abbassare la pipetta di patch nel bagno sotto controllo visivo tramite il microscopio. Nella finestra "Oscilloscopio", dovreste vedere una corrente che fluisce attraverso la pipetta. Un passo simile cambiamento nella ampiezza della corrente deve essere indotto da un impulso di tensione piccola ampiezza (trigger) applicato dalla macro preimpostate. A questo punto, dovreste essere in grado di determinare il valore di resistenza pipetta. La resistenza delle nostre pipette è tipicamente 5-6 MW. </li><li> Correggere il potenziale "offset" generato tra la pipetta e l'elettrodo di riferimento. </li><li> Sotto controllo visivo tramite il microscopio, portare la punta della pipetta più vicino alla cella fino a toccare la membrana cellulare. </li><li> Applicare una pressione negativa (20-40 cm di H 2 O) dentro la pipetta di patch. </li><li> Monitorare la formazione gigaseal nella finestra "oscilloscopio". Vedrete l'ampiezza della corrente, indotta dagli impulsi di test, diminuisce e aumenta il valore della resistenza pipetta&gt; 5 GΩ. Forme di solito gigaseal all'interno di un fesecondo w, ma potrebbero essere necessari 1-2 minuti per ottenere un gigaseal stabile. </li><li> Compensare la capacità pipetta ("C-Fast"). </li><li> Rompere la membrana del cerotto da applicare un'ulteriore pressione negativa utilizzando una siringa da 20 cc. </li><li> Impostare il potenziale tenendo a +30 mV. Un potenziale tenendo positivo aiuta a prevenire il calcio-dipendente inattivazione del canale CRAC. </li><li> Compensare la capacità della membrana della cellula ("C-slow"); salvare o registrare il valore di C-slow. </li><li> Controllare il valore della resistenza di accesso "R s". Nei nostri esperimenti, la R s è tipicamente 7-20 MW. </li><li> Iniziare ad applicare una serie di rampe di tensione con una frequenza di 0,5 Hz (Figura 1) a Ca 2 +-gratis 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione da bagno # 1. In questa soluzione, la corrente CRAC è trascurabile rispetto alla "fuga" in corso a causa della scarsa permeabilità dei canali CRAC per Mg 2 +. Salvare e utilizzare le tracce registrate in soluzione attuale vasca n. 1 su future analisi come "perdita" delle correnti. L'ampiezza assoluta della "fuga" in corso a -100 mV deve essere inferiore o uguale a 5 pA. Se la cella è "permeabile", interrompere l'esperimento e ricominciare con una pipetta nuova patch e una nuova cellula. </li><li> Per registrare Ca 2 + corrente attraverso canali CRAC (I Ca-CRAC), sostituire Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 con 20 mM di Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (tabella 1) cambiando le valvole di perfusione. Questo permette di Ca 2 + a fluire attraverso canali CRAC e producono una corrente verso l'interno. Nella finestra "Oscilloscopio", si vedrà lo sviluppo di dentro rettificare I Ca-CRAC (Figura 2). L'ampiezza della corrente a tensioni negative continueranno ad aumentare per circa 1 minuto a causa del Ca 2 +-dipendente potenziamento della corrente CRAC. </li><li> Aumentare la frequenza di stimolazione con rampe di tensione a 5 Hz, che è necessario per registrare il transitorio di corrente Na + attraverso canali CRAC. </li><li> Sostituire il 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 con Na +-contenenti cationi bivalenti senza soluzione di # 3 (Tabella 1) cambiando le valvole di perfusione. Nella finestra "Oscilloscopio", si vedrà uno sviluppo di maggiore ampiezza transitoria interiormente rettificazione Na + corrente attraverso i canali CRAC (I Na-CRAC; Figura 2). </li><li> Si può applicare 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2, che contengono 1-5 mM La 3 +, alla fine dell'esperimento per registrare la "fuga" di corrente. Tuttavia, non abbiamo trovato questo approccio utile perché la "perdita" cambiamenti in corso nel tempo e può diventare grandi o più piccoli alla fine dell'esperimento. Noi preferiamo seguire la corrente registrato nel Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 all'inizio dell'esperimento come una "fuga" di corrente. </li><li> Salva le tracce registrate in corso per ulteriori analisi. </li></ol> 7. Analisi dei dati <ol><li> Recuperare il record salvati corrente in software di analisi. Usiamo il programma di impulsi per l'analisi. </li><li> Misurare le ampiezze corrente all'inizio e alla fine della rampa di tensione. Noi di solito misura le ampiezze di corrente a -100 mV e +100 mV con le coppie di cursori nella finestra "Oscilloscopio" del programma Pulse. </li><li> Esportare i valori di ampiezze di corrente in un programma di grafica per ulteriori analisi e presentazione grafica. Noi usiamo grafica scientifica Origin e software per l'analisi, la versione 7. </li></ol> 8. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. CRAC correnti in una cella di riposo T umani. (A), corso Tempo di correnti CRAC registrati in whole-cell voltage-clamp configurazione a -100 mV (cerchi pieni) e +100 mV (cerchi aperti). Prima di formazione gigaseal, la cella era preincubate per circa 10 minuti a Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 + che contiene la soluzione bagno # 1 thapsigargin contenenti 0,5 micron. Dopo il rodaggio, soluzioni bagno sono stati applicati in sequenza i seguenti: Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 +, che contiene la soluzione bagno # 1 (0 Ca + 3 Mg), seguiti da 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (20 Ca), seguita da cationi bivalenti soluzione senza bagno # 3 (DVF), seguita dalla soluzione del bagno # 2 (20 Ca). La cella è stata stimolata da una serie di rampe di tensione, come mostrato nella Figura 1. La frequenza delle rampe è stato di 5 Hz in soluzione bagno # 3 (DVF) e 0,5 Hz in tutte le altre soluzioni. Si noti il lento sviluppo di I Ca-CRAC dopo l'applicazione di 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 e il rapido sviluppo transitoria di I Na-CRAC in soluzione bagno DVF # 3. (B), Rappresentante tracce registrate durante le rampe di attuale tensione a Ca 2 +-free 3 mM Mg 2 +, che contiene la soluzione bagno # 1 ("Fuga"), 20 mM Ca 2 +-bagno che contiene la soluzione # 2 (20 Ca), e la soluzione del bagno # 3 (DVF). (C, D), corrente-tensione I rapporti di Ca-CRAC (C) e io Na-CRAC (D) ottenuto sottraendo "fuga" di corrente dalle correnti registrati durante tensione rampe in 20 mM Ca 2 + contenenti bagno soluzione # 2 (20 Ca), e la soluzione del bagno # 3 (DVF) mostrato nel grafico (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le indagini elettrofisiologiche delle correnti CRAC a riposo cellule T è un compito impegnativo perché la endogeno ampiezza CRAC corrente in queste cellule è di piccole dimensioni a causa delle dimensioni piccole cellule (il riposo umano diametro delle cellule T è nel range di 5-8 micron). Qui vi presentiamo uno step-by-step procedura affidabile per registrare le correnti CRAC a riposo linfociti T umane isolate da cellule mononucleari del sangue periferico. Questa tecnologia ci permette di studiare la fisiologia e l&#39...

<table><tbody><tr><td>Cocktail di arricchimento per linfociti T umani RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di densità RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo RPMI 1640 con glutammina/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Serum fetale di vitello</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (soluzione 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione vitaminica RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato di inositolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato di poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di lantanio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargina</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Kit di elastomero siliconico Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Rivestimento protettivo per semiconduttori HIPEC R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo da laboratorio 63-500 Series ad alta prestazione per isolamento dalle vibrazioni</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore per patch clamp EPC 10 con testa</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Olympus 1X71 con obiettivo a immersione in olio 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Computer Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi e grafica scientifica Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di pipette per patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato con filamento (diametro esterno: 1,5 mm e diametro interno: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microfornace Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Anelli O in silicone</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip da 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell registrazione del calcio release-activated di calcio (crac) correnti in human linfociti t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

Nei linfociti T, l&#39;esaurimento di Ca 2 + dal intracellulare Ca 2 + negozio porta all&#39;attivazione di plasmalemmal Ca + 2 canali, chiamati Calcio Release-Activated di calcio (CRAC) canali. Canali CRAC un ruolo molto importante nella regolazione della proliferazione delle cellule T e l&#39;espressione genica. Anormale funzione del canale CRAC nelle cellule T è stato collegato a gravi malattie autoimmuni immunodeficienza combinata e 1, 2. Studiare la funzione CRAC canale in cellule T possono scoprire nuovi meccanismi molecolari che regolano le normali risposte immunitarie e svelare le cause di malattie umane correlate. Le registrazioni elettrofisiologiche delle correnti di membrana forniscono la valutazione più accurata delle proprietà del canale funzionale e la loro regolamentazione. Valutazione elettrofisiologica CRAC correnti di canale in cellule Jurkat T, un essere umano linea di leucemia a cellule T, è stata eseguita più di 20 anni fa 3, tuttavia, le misurazioni CRAC corrente in normali cellule T umano rimane un compito impegnativo. Le difficoltà di registrazione dei canali CRAC correnti in normali cellule T sono aggravate dal fatto che i derivati ​​dal sangue i linfociti T sono molto più piccoli nelle dimensioni di cellule Jurkat T e, di conseguenza, l&#39;intero endogeno delle cellule correnti CRAC sono molto bassi in ampiezza. Qui, diamo uno step-by-step procedura che abitualmente utilizzano per registrare il Ca 2 + o Na + correnti attraverso canali CRAC a riposo cellule T isolate dal sangue periferico di donatori sani. Il metodo qui descritto è stato adottato dalle procedure utilizzate per la registrazione delle correnti CRAC in cellule Jurkat T e cellule T attivate umane 4-8.

Forniamo un passo-passo protocollo per la cellula intera registrazione patch clamp di calcio Release-Activated di calcio (CRAC) correnti in cellule mononucleate del sangue periferico derivati ​​linfociti T umani.

Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T

Nei linfociti T, l'esaurimento del Ca2+ dai depositi intracellulari di Ca2+ porta all'attivazione dei canali del Ca2+ plasmalemmali, denominati canali del calcio attivati dal rilascio di calcio...

I canali del calcio attivati dal rilascio di calcio, o canali CRAC, che si trovano nella membrana plasmatica, svolgono un ruolo importante nella proliferazione dei linfociti T e nella stimolazione dell'espressione genica. L'attivazione dei recettori dei linfociti T mediante un antigene porta alla formazione del secondo messaggero trifosfato di adenina e all'attivazione del rilascio di calcio dal deposito attraverso i recettori per il trifosfato di adenina. La riduzione della concentrazione di calcio all'interno del deposito induce l'attivazione dei canali CRAC e conseguentemente un aumento della concentrazione citosolica di calcio. Anomalie nella funzione dei canali CRAC nei linfociti T sono associate a numerose malattie umane, tra cui i disturbi da immunodeficienza combinata grave e le malattie autoimmuni.Viene qui presentato un metodo che permette di registrare in modo affidabile e riproducibile le correnti endogene di calcio e sodio attraverso i canali di rilascio dai linfociti T umani. In primo luogo, viene applicato l'FSA garin, un inibitore della calcio-ATPasi del reticolo sarcoplasmatico-endoplasmatico, in una soluzione extracellulare priva di calcio e contenente tre millimolari di magnesio, al fine di svuotare le riserve intracellulari.Questa procedura apre i canali crack ma non induce corrente di crack a causa della scarsa permeabilità dei canali crack al magnesio. Successivamente, viene stabilito un voltage clamp in configurazione a intera cellula sulla membrana di una cellula T. La cellula viene perfusa con una soluzione per pipetta contenente un'alta concentrazione del chelante del calcio pta.Successivamente, vengono applicate in modo sequenziale soluzioni extracellulari contenenti calcio o prive di cationi bivalenti, per attivare le correnti misurabili di calcio e sodio attraverso i canali crack. I dati ottenuti dimostrano il livello di espressione funzionale dei canali crack nei linfociti T umani a riposo. Lo studio delle correnti di membrana attraverso i canali crack può fornire informazioni preziose sulla regolazione e sulle funzioni di questi canali, contribuendo a chiarire il ruolo dei canali crack nelle risposte immunitarie normali e nelle malattie immunologiche.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni dei linfociti T umani e della bassa ampiezza delle correnti endogene di crack in queste cellule. I linfociti T umani positivi per il CD3 per questo esperimento sono stati ottenuti da un campione di sangue periferico di un volontario sano e isolati utilizzando il cocktail di arricchimento per linfociti T umani tep e il mezzo di densità TEP. Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato, le cellule sono state mantenute in mezzo di coltura per linfociti T a 37 gradi Celsius in un incubatore a biossido di carbonio.Preparare le seguenti soluzioni: soluzione numero uno contenente tre millimoli di magnesio e nessun calcio, soluzione numero due contenente 20 millimoli di calcio, soluzione numero tre contenente 10 millimoli di chelante del calcio, H-E-D-T-A, e nessun ione bivalente, e soluzione per pipetta contenente 12 millimoli di chelante del calcio bta. Conservare le soluzioni a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Nel giorno dell'esperimento, tirare le pipette con un diametro della punta di circa due micron utilizzando capillari di vetro e un tiratore di pipette.Utilizzare un tubo capillare in silice con filamento avente le specifiche indicate qui e elencate nel testo allegato. Dopo il tiraggio, le punte delle pipette vengono ricoperte con un rivestimento protettivo semiconduttore PEC R 61 0 1 e lucidate alla fiamma. Conservarle in un luogo protetto dalla polvere, ad esempio in un portapipette.Aprire il software di controllo dell'amplificatore per patch clamp qui. Un amplificatore per patch clamp EPC 10 è controllato dal software Pulse. Configurare e salvare l'allestimento sulle macro cella e macro cella intera utilizzate per la formazione del gigaseal e per l'instaurazione della configurazione in modalità whole cell.Successivamente, nel software di acquisizione, configurare e salvare qui il protocollo di stimolazione per registrare le correnti di perforazione. Il protocollo di acquisizione nella finestra di generazione dell'impulso è impostato come una rampa di tensione da meno 120 a più 100 millivolt per una durata di 50 millisecondi.Creare due protocolli di stimolazione con frequenze di stimolazione a rampa di tensione di 0,5 hertz e cinque hertz, e salvarli nella finestra di generazione degli impulsi con i nomi rispettivamente di rampa uno e rampa due. Per preparare le cellule, piastrare 500 microlitri della sospensione cellulare contenente da 0,2 a 0,5 milioni di cellule in una camera di registrazione costituita da un'ogiva rivestita di poliolisina con un anello di silicone O fissato. Incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, fissare la camera di registrazione in un supporto per camera. In questo caso, si utilizza un supporto per camera personalizzato, in cui la parte inferiore sostiene il coprioggetto sul fondo della camera e la parte superiore preme contro la superficie superiore del coprioggetto. Posizionare il supporto per camera sul portapreparati del microscopio invertito utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 40x e un'illuminazione a campo chiaro.Trova un campo di cellule e metti a fuoco. Posiziona l'elettrodo di riferimento al cloruro di argento nell'ambiente. Quindi allinea un sistema di perfusione multicanale a gravità posizionando la punta del tubo di ingresso a 45 gradi rispetto al vetrino, vicino al campo visivo; il tubo di aspirazione viene inserito nella parte superiore del supporto della camera.Ruotare la parte superiore del supporto della camera fino a quando il tubo di aspirazione si trova opposto al tubo di ingresso per eseguire il canale corretto. Le registrazioni della corrente iniziano aprendo la valvola del sistema di perfusione per perfondere la camera di registrazione con soluzione priva di calcio. Soluzione bat numero uno contenente 3 millimolari di magnesio, integrata con 0,5-1 micromolare di AP argon per 8-10 minuti al fine di bloccare la pompa circa.Questo passaggio esaurisce la riserva di calcio. Successivamente, utilizzare un microcaricatore einor con una pipetta ad aria a spostamento P 20. Per riempire la pipetta con la soluzione, inserirla nel supporto sulla piattaforma dell'amplificatore qui.Un dispositivo personalizzato per pressione e aspirazione viene collegato all'aria pressurizzata e alle linee del vuoto. Per generare una pressione positiva o negativa in una pipetta per il patch, applicare una leggera pressione positiva di circa tre pollici di colonna d'acqua all'interno della pipetta collegando la pipetta all'uscita del dispositivo per pressione e aspirazione tramite il tubo di collegamento. Fare clic sul tasto di controllo della configurazione nella finestra del patch clamp EPC 10 sullo schermo del computer.Per eseguire la macro di configurazione. Individuare una cellula rotonda di dimensioni medie con una superficie esterna liscia, ben aderente al vetrino coprioggetto. Successivamente, abbassare l'elettrodo per il patch nel bagno sotto controllo visivo tramite il microscopio nella finestra dell'oscilloscopio.La corrente che scorre attraverso la pipetta può essere osservata dopo aver immerso la pipetta nella soluzione di bagnetto. Un cambiamento a gradino nell'ampiezza della corrente è provocato dall'impulso di tensione di prova di cinque millivolt applicato alla pipetta tramite la macro di configurazione. Il software calcola automaticamente la resistenza della pipetta e la visualizza nella finestra della resistenza della membrana.Sullo schermo del computer, la resistenza della pipetta è solitamente compresa tra cinque e sei megaohm. Fare clic sul tasto di controllo automatico nella finestra dell'amplificatore sullo schermo del computer per correggere il potenziale di offset generato tra la pipetta e l'elettrodo di riferimento. La corrente di base si sposterà a un livello di corrente zero.Utilizzare il micromanipolatore per portare la punta della pipetta a contatto con la membrana cellulare. Una volta stabilito il contatto, si osserverà una diminuzione dell'ampiezza della corrente evocata dall'impulso di prova. Applicare una pressione negativa compresa tra 20 e 40 pollici di acqua alla pipetta per il patch. Monitorare la formazione del giga-seal nella finestra dell'oscilloscopio. L'ampiezza della corrente evocata dall'impulso di prova dovrebbe diminuire gradualmente all'aumentare del valore della resistenza della pipetta fino a superare i cinque gigaohm. Di solito il contatto del giga-seal si forma rapidamente, ma può richiedere da uno a due minuti per ottenere un giga-seal stabile.Una volta ottenuto il sigillo giga, scollegare il porta-pipetta dal dispositivo di aspirazione a pressione rimuovendo il tubo di collegamento dall'uscita. Fare clic sul tasto di controllo onsell sullo schermo del computer per eseguire la macro onsell, precedentemente impostata prima dell'esperimento. Secondo il manuale EPC 10, compensare la capacità della pipetta facendo clic sul tasto di controllo automatico nella finestra cfat.Nella finestra dell'oscilloscopio, il transitorio di corrente scomparirà e il valore della capacità della pipetta verrà visualizzato nella finestra cfat per rompere la membrana cellulare. All'interno della pipetta, collegare la pipetta a una siringa da 20 centimetri cubici tramite il tubo di collegamento e tirare indietro lo stantuffo per applicare una pressione negativa aggiuntiva alla pipetta. Quando la membrana cellulare all'interno della pipetta si rompe, appariranno due transitori di corrente che caricano la membrana cellulare a un nuovo livello di tensione. Fare clic sul tasto di controllo della modalità "whole cell" sullo schermo del computer per eseguire la macro preimpostata per la modalità "whole cell".Quindi, impostare il potenziale di mantenimento a più 30 millivolt nella finestra V membrana; un potenziale di mantenimento positivo aiuta a prevenire l'attivazione del canale dello crack dipendente dal calcio. Successivamente, fare clic sul tasto auto controllo nella finestra C lenta. Per compensare la capacità cellulare nella finestra dell'oscilloscopio, il transitorio di corrente scomparirà.I valori di capacità cellulare e resistenza in serie appariranno rispettivamente nelle finestre C lenta e R serie. La resistenza in serie è tipicamente compresa tra sette e venti megaohm. I valori di C lenta, che corrispondono alla capacità cellulare, sono generalmente nell'intervallo da 1,5 a 2,5 picofarad.Nelle cellule T umane a riposo, fare clic sul tasto di controllo rampa uno nella finestra dell'oscilloscopio per applicare una serie di rampe di tensione con una frequenza di 0,5 hertz. Questo eseguirà il protocollo di stimolazione generato e salvato in precedenza nella finestra dell'oscilloscopio. Verranno mostrate le correnti evocate dalle rampe di tensione. Registrare.Queste tracce di corrente in soluzione priva di calcio numero uno contenente tre millimolari di magnesio. In questa soluzione, la corrente del canale CRAC è molto piccola a causa della scarsa permeabilità dei canali CRAC al magnesio. Utilizzare queste tracce nelle analisi future come correnti di perdita.L'ampiezza assoluta della perdita a meno 100 millivolt dovrebbe essere uguale o inferiore a cinque picoampere. Se la cellula è permeabile, interrompere l'esperimento e ricominciare con una nuova pipetta per il patch e una nuova cellula.Successivamente, per registrare la corrente del calcio attraverso i canali CRAC, commutare le valvole di perfusione in modo da sostituire la soluzione di bagnatura numero uno con la soluzione di bagnatura numero due contenente 20 millimolare di calcio. Questo consente agli ioni calcio di fluire attraverso i canali CRAC e di produrre una corrente entrante nella finestra dell'oscilloscopio. Una corrente del calcio rettificante entrante attraverso i canali CRAC sviluppa un'ampiezza di corrente a potenziali negativi, continuando ad aumentare per circa un minuto a causa della potenziamento dipendente dal calcio della corrente CRAC.Fare clic sul tasto di controllo rampa due nella finestra dell'oscilloscopio per eseguire un protocollo di stimolazione preimpostato, che modifica la frequenza di stimolazione mediante rampe di tensione con un aumento di cinque hertz nella frequenza di stimolazione, utile per registrare la corrente sodica massimale attraverso i canali crack, di natura transitoria. Successivamente, commutare nuovamente le valvole di perfusione per sostituire la soluzione di bagno numero due con la soluzione numero tre contenente sodio e priva di cationi bivalenti nella finestra dell'oscilloscopio. Si sviluppa una corrente sodica transitoria di maggiore ampiezza con rettificazione entrante attraverso i canali crack.Una volta terminato l'esperimento, chiudere il file: ciò consente di salvare le tracce di corrente registrate per un'analisi successiva. Per analizzare i dati, recuperare i record di corrente salvati nel software di analisi. In questo caso, si utilizza il software Pulse, impiegando coppie di cursori nella finestra dell'oscilloscopio del programma Pulse. Misurare le ampiezze di corrente all'inizio e alla fine delle rampe di tensione.Le ampiezze della corrente vengono misurate a meno 100 millivolt e a più 100 millivolt. Esportare i valori delle ampiezze della corrente in un programma grafico come il software Origin per grafici e analisi scientifici. Per ulteriori analisi e rappresentazioni grafiche, le correnti di crack sono state misurate in cellule T di riposo CD3 positive provenienti da un soggetto umano sano utilizzando il metodo qui descritto; questa figura mostra l'andamento temporale delle correnti di crack registrate in configurazione di voltage clamp in tutta la cellula a meno 100 millivolt, indicati dai cerchi pieni, e a più 100 millivolt, indicati dai cerchi vuoti.Prima della formazione del giga-ohm seal, la cellula è stata pre-incubata per circa 10 minuti nella soluzione da bagno numero uno priva di calcio e contenente 3 millimolari di magnesio con 0,5 micromolari di ortogon dopo il break-in. Le soluzioni sono state applicate in sequenza nel seguente ordine: soluzione da bagno numero uno priva di calcio e contenente 3 millimolari di magnesio, seguita dalla soluzione da bagno numero due contenente 20 millimolari di calcio, seguita dalla soluzione da bagno numero tre priva di cationi bivalenti, seguita nuovamente dalla soluzione da bagno numero due contenente 20 millimolari di calcio. La cellula è stata stimolata con una serie di rampe di tensione da meno 120 millivolt a più 100 millivolt come mostrato qui.Ramp di tensione sono stati applicati ogni 200 millisecondi, ovvero a una frequenza di cinque hertz, nella soluzione di bat numero tre priva di cationi bivalenti, e ogni due secondi, ovvero a una frequenza di 0,5 hertz, in tutte le altre soluzioni. Si noti lo sviluppo lento della corrente del calcio attraverso i canali crack dopo l'applicazione della soluzione di bat numero due contenente 20 millimolari di calcio, e lo sviluppo rapido e transitorio della corrente del sodio attraverso i canali crack nella soluzione di bat numero tre priva di cationi bivalenti. Questa figura mostra tracce di corrente rappresentative registrate durante i ramp di tensione in assenza di calcio.Soluzione bat numero uno contenente magnesio 3 mM, soluzione bat numero due contenente calcio 20 mM e soluzione bat libera da cationi bivalenti. Numero tre, i tracciati della corrente di calcio e di sodio durante le singole rampe di tensione possono essere ottenuti sottraendo le correnti registrate nella soluzione bat numero uno priva di calcio e contenente magnesio 3 mM dalle correnti registrate nella soluzione bat numero due contenente calcio 20 mM e nella soluzione bat priva di cationi bivalenti numero tre. I tracciati di corrente risultanti mostrano relazioni corrente-tensione tipiche delle correnti di calcio e sodio attraverso canali crack. Tali tracciati sono visibili qui.Una volta padroneggiata questa tecnica e una volta eseguiti correttamente tutti i passaggi della procedura, è possibile registrare correnti di canale di crack da cinque a dieci cellule al giorno. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare correnti di correzione a riposo in linfociti T umani. Seguendo questa procedura, si dovrebbe essere inoltre in grado di registrare correnti corrette in altre cellule del sistema immunitario, come linfociti T umani attivati, monociti, macrofagi e anche linee cellulari. Elettrofisiologico.La registrazione delle correnti ioniche nei canali delle cellule del sistema immunitario potrebbe consentire ai ricercatori di chiarirne il ruolo nell'omeostasi del calcio nelle cellule immunitarie.

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