Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

Le cellule immunitarie infiltrano il sistema nervoso centrale durante infezioni, traumi, autoimmunità o neurodegenerazione. Mentre gli approcci istochimici possono essere utilizzati per determinare la localizzazione delle cellule infiltranti e analizzare la patologia associata, queste tecniche sono limitate dal numero di anticorpi che possono essere impiegati contemporaneamente. Di seguito viene illustrato un metodo per l'isolamento rapido di cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale, in cui il tessuto dissezionato viene prima omogeneizzato.

Successivamente, viene impostato un gradiente al percol e, dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate vengono raccolte dall'interfaccia. Infine, le cellule vengono lavate e marcate con anticorpi. Mediante analisi di citometria a flusso, le cellule ematogene e la microglia di sorveglianza vengono distinte e le loro proporzioni relative durante stati patologici possono essere determinate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il gradiente Aris o la istochimica, è che richiede meno tempo.

Questo consente di elaborare più tessuti contemporaneamente. A dimostrazione dell'allestimento del gradiente, interverrà Palino A, un tecnico del mio laboratorio. Preparare i reagenti necessari per questo protocollo. Iniziare con quattro millilitri di percoll isotono stock, indicato come SIP, per cervello.

Per fare ciò, mescolare nove parti di perol con una parte di HBSS 10× senza calcio e magnesio, miscelando per inversione. Successivamente, preparare il 70% di per cellula mescolando il SIP preparato con HBSS 1× senza calcio e magnesio. Quindi, distribuire due millilitri della soluzione al 70% di per cellula in un tubo conico polipropilenico da 15 millilitri per raccogliere il tessuto.

Per questa procedura, posizionare i cervelli e i midolli spinali di tutti i topi oggetto dello studio in becher contenenti 10 millilitri di RPMI su ghiaccio. Successivamente, trasferire il tessuto in un omogenizzatore da 7 o 15 millilitri contenente tre millilitri di HBSS 1x con un pestello di dimensione larga. Con un pestello delicatamente creare una sospensione cellulare, quindi passare a un pestello di dimensione stretta B e ulteriormente dissociare i tessuti.

Dopo aver omogeneizzato il tessuto, aggiungere RPMI o HBSS 1x fino a un volume finale di sette millilitri e procedere al preparazione del gradiente per il gradiente percoco. Iniziare aggiungendo tre millilitri di SIP alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di PERCOCO del 30%. Tenere presente che il perol deve essere utilizzato a temperatura ambiente. Se utilizzato freddo, le cellule tendono ad aggregarsi e la separazione cellulare risulta meno efficiente.

Successivamente, utilizzando il nostro ausilio per pipetta in modalità gravità, stratificare lentamente la sospensione cellulare di 10 millilitri sulla soluzione di SIP al 70%. Evitare di mescolare le soluzioni al 70% e al 30%. Questo è il passaggio più critico della procedura.

Deve essere visibile una linea piatta molto netta al giunto tra il 70% e il 30%. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché la terza soluzione e quella al 70% si mescoleranno durante la sovrapposizione. Passaggio successivo, compromettendo l'interfaccia, centrifugare per 30 minuti a 500 G a 18 gradi Celsius.

Assicurarsi che la centrifuga si fermi con un arresto minimo o nullo in modo da non disturbare l'interfaccia. Dopo la centrifugazione dei gradienti, uno strato spesso e viscoso di detriti dovrebbe accumularsi nella parte superiore del tubo. Il successivo strato è quello giallastro al 30% per core, che a volte contiene detriti.

Successivamente si trova l'interfaccia tra il 70 e il 30, che dovrebbe presentare un alone bianco ben definito e contiene le cellule mononucleate. Infine, nella parte inferiore del tubo, si trova lo strato chiaro di Percol al 70%. Se non si osserva alcuna interfaccia, la resa cellulare sarà probabilmente molto bassa, rendendo ulteriori analisi estremamente difficili.

Pertanto, a questo punto potrebbe essere necessario un sospensione cellulare fresca per ridurre la contaminazione. Rimuovere con attenzione lo strato di detriti sulla parte superiore del tubo e scartarlo. Quindi, utilizzando una pipetta di plastica, prelevare i primi il 30% dello strato centrale e raccogliere da due a tre millilitri dell'interfase 70-30, trasferendoli in un tubo conico pulito contenente otto millilitri di HBSS una volta.

Mescolare alcune volte le interfacce diluite capovolgendo il tubo, quindi centrifugare per sette minuti a 500 GS a 18 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri con un millilitro di buffer per la colorazione cellulare e lavarla ancora una volta.

Utilizzare una microcentrifuga a 10.000 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius prima di procedere con la colorazione anticorpale; risospendere i pellet in 50 microlitri di anti-US CD16, CD32 purificato, diluito 1:200 in buffer per la colorazione cellulare, al fine di bloccare i siti di legame Fc. Come per qualsiasi procedura di colorazione, è fondamentale che tutti gli anticorpi siano adeguatamente titolati; incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Durante l'incubazione, prelevare due-cinque microlitri di cellule e contarle utilizzando un emocitometro.

I tessuti combinati di cervello e midollo spinale naïve dovrebbero fornire circa da tre a cinque volte 10 alla cinque cellule per topo. I cervelli infiammati conterranno un numero variabile di cellule infiammatorie, a seconda del punto temporale in cui vengono raccolti e del modello di malattia. Dopo l'incubazione con CD 16 e CD 32, aggiungere 50 microlitri di una miscela specifica di anticorpi per cellule immunitarie. La miscela utilizzata in questo esempio contiene anticorpi contro CD 45, CD 4 e CD 19; incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

È importante che ogni anticorpo venga prima titolato. Per valutare la diluizione ottimale, utilizzare combinazioni appropriate di fluorocromi scelte in base alle capacità dei laser e delle impostazioni dei filtri del proprio citometro a flusso. Dopo aver colorato le cellule, lavarle in buffer per la colorazione cellulare aggiungendo un millilitro di buffer per la colorazione cellulare e centrifugandole per un minuto.

A 10.000 G dopo la centrifugazione, eliminare il sopranatante, quindi risospendere i pellet in 100-200 microlitri di buffer per la colorazione cellulare per un'immediata analisi in citometria a flusso o per analisi successive. Risospendere nuovamente le cellule in formaldeide al 2% preparata in PBS e conservare durante la notte a quattro gradi Celsius. Qui sono mostrate cellule mononucleate ottenute e incubate con bloccante FC, seguite da anticorpi anti-CD45, CD4 e CD19.

In accordo con il protocollo dimostrato mediante citometria a flusso, la colorazione per CD45 separa chiaramente le cellule ematogene CD45 ad alta intensità dalle microglia di sorveglianza CD45 dim. Questa figura confronta le cellule isolate da un cervello naïve e da un cervello infiammato di un topo indotto a sviluppare encefalomielite autoimmune sperimentale. L'intensità del segnale CD45 APC è riportata sull'asse Y, dove si osservano tre popolazioni distinte nel cervello naïve.

Vengono rilevate solo pochissime cellule CD45 high. Solitamente meno del 2% della popolazione totale isolata. In confronto, i cervelli di topi affetti da EAE mostrano un massiccio afflusso di cellule ematiche reclutate nel cervello.

L'aggiunta di altri marcatori della superficie cellulare, come CD11b, CD4, CD8, ecc., permette una caratterizzazione ulteriore della popolazione CD45 high. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che gli approcci istologici in combinazione con il fenotipaggio immunitario mediante citometria a flusso sono fondamentali per caratterizzare pienamente la composizione degli infiltrati infiammatori del SNC.