Name: Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Impara un protocollo rapido per isolare cellule mononucleari da cervello e midollo spinale di topo usando gradienti Percoll discontinui. Questo metodo consente l'analisi fenotipica dettagliata mediante citometria a flusso.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Nazionale Sclerosi Multipla (TA 3021-A1 / T per AEC) e l&#39;Università del Texas a San Antonio.

Preparazione dei reagenti Preparare magazzino isotonica Percoll (SIP), 4 ml al cervello, mescolando 9 parti di Percoll con una parte di HBSS 10X senza Ca + + e Mg + +. Preparare SIP al 70% in 1X HBSS senza Ca + + e Mg + +, 2 ml al cervello dispensato in un tubo da 15 ml in polipropilene. Nota: Si raccomanda di Percoll dovrebbe essere usato a temperatura ambiente, se usato a freddo, le cellule tendono a raggrupparsi e la separazione delle cellule è meno efficiente. Tessuto di raccolta e omogeneizzazione Anestetizzare topi e profumato attraverso il ventricolo sinistro con HBSS 1X ghiacciata. Sezionare il cervello e il midollo spinale e mantenere in RPMI senza rosso fenolo fino a quando tutti i topi vengono sacrificati. Tessuti posto in 7 o 15 ml dounce omogeneizzatore contenente 3 ml di RPMI, gentilmente fare una sospensione cellulare con una linea morbida pestello (Una dimensione) seguito da un Tigh-montaggio pestello (dimensione B) per dissociare ulteriormente i tessuti. Completa il volume della sospensione cellulare a 7 ml con RPMI. Gradiente impostato Aggiungere 3 ml di SIP alla sospensione cellulare per fare un SIP finale del 30% Lentamente lo strato di sospensione cellulare 10 ml sulla parte superiore della SIP 70%. Questa è la fase più critica della procedura, utilizzare una pipetta-aiuto al modo di gravità evitando la miscelazione del 70% e il 30% delle soluzioni. Una linea molto chiara piatto dovrebbe essere visibile al 70% -30% di giunzione. Centrifugare 30 min a 500G 18 ° C. Assicurarsi centrifuga si ferma con freno minimo o nessun modo che l'interfase non è disturbato. Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere delicatamente lo strato di detriti dalla parte superiore del tubo e raccogliere 2,0-3,0 ml di 70% -30% interfase in una provetta pulita conica contenente 8 ml di 1X HBSS. Assicurarsi che il Percoll contenente l'interfase viene diluita a circa tre volte, mescolare un paio di volte per inversione e centrifugre 7 min a 500G a 18 ° C. Risospendere il pellet in 1 ml di buffer di colorazione della cellula e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml e lavare ancora una volta utilizzando un micro-centrifuga a 10.000 G 1 min a 4 ° C. Anticorpi colorazione Pellet Risospendere in 50 ml di purificato antimouse CD16/CD32 diluito 1:200 in tampone di colorazione delle cellule per bloccare i siti di legame Fc. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere 50 ml di miscela di anticorpi cocktail e incubare in ghiaccio per 30 min. Ogni anticorpo deve essere il primo titolato a valutare la diluizione ottimale. Uso appropriato combinazioni fluorocromo scelti in base alla capacità di laser e impostazioni del filtro del citofluorimetro particolare. Lavare le cellule in tampone di colorazione della cellula, pellets risospendere in 100-200 ml di buffer di colorazione della cellula e di analizzare immediatamente nel citometro, o in alternativa le cellule possono essere risospese in 2% paraformaldeide (PFA), preparati in PBS e conservato durante la notte a 4 ° C . Rappresentante dei risultati: Dopo avere girato le pendenze, il 70% -30% interfase dovrebbe avere definito un alone bianco, e la quantificazione delle cellule recuperate da un mouse ingenuo deve cedere 3-5 x10 5 celle per il mouse (cervello più midollo spinale). Cervello infiammato potrebbe avere i numeri che variano a seconda delle cellule infiammatorie del sistema nervoso centrale insulto o modello di malattia (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Isolamento di cellule mononucleate, da ingenuo e EAE-cervello a malattia di picco. Le cellule cerebrali sono stati separati sospensioni più discontinuo del 70% / pendenze Percoll 30%. Macchiato le cellule sono state incubate con Fc-block seguiti da anticorpi anti-CD45 per 30 minuti sul ghiaccio. Le cellule sono state lavate in tampone di colorazione della cellula, e fissato nel 2% PFA prima acquisizione in un LSR-II. CD45 intensità è misurata in asse Y, dove tre popolazioni distinte sono visualizzati. Un'ulteriore caratterizzazione del fenotipo CD45 delle cellule immunitarie di alta infiltrazione è implementata utilizzando anticorpi aggiuntivi e successivamente analizzati mediante citometria di flusso.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
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<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
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<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le analisi di marcatori cellulari di superficie nei leucociti sistema nervoso centrale dai tessuti del mouse normale e infiammata è stata utilizzata per decenni 1-3. Protocolli di isolamento si basano nella separazione della microglia e leucociti da 4 densità centrifugazione. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace di isolare leucociti sistema nervoso centrale mediante gradienti di Percoll discontinuo. Dopo l&#39;isolamento delle cellule, colorazione con anticorpi diversi come ad esempio-ma no...

Omogeneizzazione dei tessuti e gradienti <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> Sale 10X Hanks &#39;soluzione equilibrata, senza calcio e magnesio (Gibco) </li><li> RPMI Media 1640, senza rosso fenolo (Gibco) </li><li> 7-ml o 15 ml Dounce Tissue Smerigliatrici (VWR) </li></ul> Citometria a flusso <ul><li> Buffer di colorazione delle cellule (Biolegend) </li><li> Rat purificato CD16/CD32 anti-topo (mouse BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Emocitometro (Fisher) </li><li> Anti-topo CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend </li><li> Soluzione salina tamponata con fosfato 10X, senza calcio e magnesio (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldeide (Sigma Aldrich) </li><li> Analisi di citometria a flusso eseguita con un II LSR (BD Biosciences) </li></ul>

isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale uso dei gradienti percoll

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolamento di cellule immunitarie che si infiltrano nel sistema nervoso centrale (SNC) durante l&#39;infezione, traumi, malattie autoimmuni o neurodegenerazione, è spesso necessaria per definire la loro fenotipo e funzioni effettrici. Approcci istochimiche sono strumentali per determinare la posizione delle celle di infiltrarsi e di analizzare il sistema nervoso centrale associata patologia. Tuttavia, in situ e tecniche di colorazione istochimica immunofluorescenza sono limitati dal numero di anticorpi che possono essere usati in una sola volta a caratterizzare sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Pertanto, gli approcci istologici in collaborazione con immuno-fenotipo mediante citometria di flusso sono fondamentali per caratterizzare completamente la composizione del locale infiltrazione sistema nervoso centrale. Questo protocollo si basa sulla separazione del sistema nervoso centrale sospensioni cellulari più discontinue gradienti di Percoll. L&#39;articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per l&#39;identificazione delle varie popolazioni di cellule immunitarie in un singolo campione mediante citometria di flusso.

L&#39;articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per le analisi di citometria a flusso.

Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

L'isolamento delle cellule immunitarie che infiltrano il sistema nervoso centrale (SNC) durante infezioni, traumi, malattie autoimmuni o processi neurodegenerativi è spesso richiesto...

Le cellule immunitarie infiltrano il sistema nervoso centrale durante infezioni, traumi, autoimmunità o neurodegenerazione. Mentre gli approcci istochimici possono essere utilizzati per determinare la localizzazione delle cellule infiltranti e analizzare la patologia associata, queste tecniche sono limitate dal numero di anticorpi che possono essere impiegati contemporaneamente. Di seguito viene illustrato un metodo per l'isolamento rapido di cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale, in cui il tessuto dissezionato viene prima omogeneizzato.Successivamente, viene impostato un gradiente al percol e, dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate vengono raccolte dall'interfaccia. Infine, le cellule vengono lavate e marcate con anticorpi. Mediante analisi di citometria a flusso, le cellule ematogene e la microglia di sorveglianza vengono distinte e le loro proporzioni relative durante stati patologici possono essere determinate. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il gradiente Aris o la istochimica, è che richiede meno tempo.Questo consente di elaborare più tessuti contemporaneamente. A dimostrazione dell'allestimento del gradiente, interverrà Palino A, un tecnico del mio laboratorio. Preparare i reagenti necessari per questo protocollo. Iniziare con quattro millilitri di percoll isotono stock, indicato come SIP, per cervello.Per fare ciò, mescolare nove parti di perol con una parte di HBSS 10× senza calcio e magnesio, miscelando per inversione. Successivamente, preparare il 70% di per cellula mescolando il SIP preparato con HBSS 1× senza calcio e magnesio. Quindi, distribuire due millilitri della soluzione al 70% di per cellula in un tubo conico polipropilenico da 15 millilitri per raccogliere il tessuto.Per questa procedura, posizionare i cervelli e i midolli spinali di tutti i topi oggetto dello studio in becher contenenti 10 millilitri di RPMI su ghiaccio. Successivamente, trasferire il tessuto in un omogenizzatore da 7 o 15 millilitri contenente tre millilitri di HBSS 1x con un pestello di dimensione larga. Con un pestello delicatamente creare una sospensione cellulare, quindi passare a un pestello di dimensione stretta B e ulteriormente dissociare i tessuti.Dopo aver omogeneizzato il tessuto, aggiungere RPMI o HBSS 1x fino a un volume finale di sette millilitri e procedere al preparazione del gradiente per il gradiente percoco. Iniziare aggiungendo tre millilitri di SIP alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di PERCOCO del 30%. Tenere presente che il perol deve essere utilizzato a temperatura ambiente. Se utilizzato freddo, le cellule tendono ad aggregarsi e la separazione cellulare risulta meno efficiente.Successivamente, utilizzando il nostro ausilio per pipetta in modalità gravità, stratificare lentamente la sospensione cellulare di 10 millilitri sulla soluzione di SIP al 70%. Evitare di mescolare le soluzioni al 70% e al 30%. Questo è il passaggio più critico della procedura.Deve essere visibile una linea piatta molto netta al giunto tra il 70% e il 30%. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché la terza soluzione e quella al 70% si mescoleranno durante la sovrapposizione. Passaggio successivo, compromettendo l'interfaccia, centrifugare per 30 minuti a 500 G a 18 gradi Celsius.Assicurarsi che la centrifuga si fermi con un arresto minimo o nullo in modo da non disturbare l'interfaccia. Dopo la centrifugazione dei gradienti, uno strato spesso e viscoso di detriti dovrebbe accumularsi nella parte superiore del tubo. Il successivo strato è quello giallastro al 30% per core, che a volte contiene detriti.Successivamente si trova l'interfaccia tra il 70 e il 30, che dovrebbe presentare un alone bianco ben definito e contiene le cellule mononucleate. Infine, nella parte inferiore del tubo, si trova lo strato chiaro di Percol al 70%. Se non si osserva alcuna interfaccia, la resa cellulare sarà probabilmente molto bassa, rendendo ulteriori analisi estremamente difficili.Pertanto, a questo punto potrebbe essere necessario un sospensione cellulare fresca per ridurre la contaminazione. Rimuovere con attenzione lo strato di detriti sulla parte superiore del tubo e scartarlo. Quindi, utilizzando una pipetta di plastica, prelevare i primi il 30% dello strato centrale e raccogliere da due a tre millilitri dell'interfase 70-30, trasferendoli in un tubo conico pulito contenente otto millilitri di HBSS una volta.Mescolare alcune volte le interfacce diluite capovolgendo il tubo, quindi centrifugare per sette minuti a 500 GS a 18 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri con un millilitro di buffer per la colorazione cellulare e lavarla ancora una volta.Utilizzare una microcentrifuga a 10.000 ×g per un minuto a quattro gradi Celsius prima di procedere con la colorazione anticorpale; risospendere i pellet in 50 microlitri di anti-US CD16, CD32 purificato, diluito 1:200 in buffer per la colorazione cellulare, al fine di bloccare i siti di legame Fc. Come per qualsiasi procedura di colorazione, è fondamentale che tutti gli anticorpi siano adeguatamente titolati; incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Durante l'incubazione, prelevare due-cinque microlitri di cellule e contarle utilizzando un emocitometro.I tessuti combinati di cervello e midollo spinale naïve dovrebbero fornire circa da tre a cinque volte 10 alla cinque cellule per topo. I cervelli infiammati conterranno un numero variabile di cellule infiammatorie, a seconda del punto temporale in cui vengono raccolti e del modello di malattia. Dopo l'incubazione con CD 16 e CD 32, aggiungere 50 microlitri di una miscela specifica di anticorpi per cellule immunitarie. La miscela utilizzata in questo esempio contiene anticorpi contro CD 45, CD 4 e CD 19; incubare sul ghiaccio per 30 minuti.È importante che ogni anticorpo venga prima titolato. Per valutare la diluizione ottimale, utilizzare combinazioni appropriate di fluorocromi scelte in base alle capacità dei laser e delle impostazioni dei filtri del proprio citometro a flusso. Dopo aver colorato le cellule, lavarle in buffer per la colorazione cellulare aggiungendo un millilitro di buffer per la colorazione cellulare e centrifugandole per un minuto.A 10.000 G dopo la centrifugazione, eliminare il sopranatante, quindi risospendere i pellet in 100-200 microlitri di buffer per la colorazione cellulare per un'immediata analisi in citometria a flusso o per analisi successive. Risospendere nuovamente le cellule in formaldeide al 2% preparata in PBS e conservare durante la notte a quattro gradi Celsius. Qui sono mostrate cellule mononucleate ottenute e incubate con bloccante FC, seguite da anticorpi anti-CD45, CD4 e CD19.In accordo con il protocollo dimostrato mediante citometria a flusso, la colorazione per CD45 separa chiaramente le cellule ematogene CD45 ad alta intensità dalle microglia di sorveglianza CD45 dim. Questa figura confronta le cellule isolate da un cervello naïve e da un cervello infiammato di un topo indotto a sviluppare encefalomielite autoimmune sperimentale. L'intensità del segnale CD45 APC è riportata sull'asse Y, dove si osservano tre popolazioni distinte nel cervello naïve.Vengono rilevate solo pochissime cellule CD45 high. Solitamente meno del 2% della popolazione totale isolata. In confronto, i cervelli di topi affetti da EAE mostrano un massiccio afflusso di cellule ematiche reclutate nel cervello.L'aggiunta di altri marcatori della superficie cellulare, come CD11b, CD4, CD8, ecc., permette una caratterizzazione ulteriore della popolazione CD45 high. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che gli approcci istologici in combinazione con il fenotipaggio immunitario mediante citometria a flusso sono fondamentali per caratterizzare pienamente la composizione degli infiltrati infiammatori del SNC.

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Immunologia e Infezioni

In questo video ci mostrano come isolare le cellule mononucleate del sistema nervoso centrale di topi con encefalomielite autoimmune sperimentale.

Isolamento di cellule mononucleate dal Sistema Nervoso Centrale di ratti con EAE

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

In questo video, eseguiamo l'isolamento di cellule mononucleate dal cervello di un topo utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità. La sospensione di cellule mononucleate isolate può essere utilizzata per ulteriori analisi a valle.

Isolamento di cellule mononucleate dal cervello di topo: una tecnica di centrifugazione a gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate residenti nel cervello

In questo video descriviamo un protocollo passo-passo per isolare i neuroni del midollo spinale da un topo neonatale per studi in vitro.

Isolamento dei neuroni del midollo spinale: una procedura di gradiente di densità per isolare i neuroni del midollo spinale neonatale per studi in vitro

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

Il video dimostra la preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da un tessuto cerebrale murino. Prevede la digestione enzimatica per rilasciare le cellule dal tessuto cerebrale, seguita dalla centrifugazione in gradiente di densità per isolare le cellule immunitarie in base alla loro densità per ottenere la sospensione di una singola cellula.

Preparazione di una sospensione unicellulare di cellule immunitarie da tessuto cerebrale murino

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule gliali miste primarie da tessuto del midollo spinale di topo adulto. Il protocollo prevede la digestione enzimatica del tessuto, seguita dalla rimozione delle membrane cellulari rotte e dei detriti mielinici per ottenere una popolazione unicellulare. Le cellule vengono quindi coltivate in terreni ottimizzati per la crescita di cellule gliali miste.

Stabilire colture primarie di cellule gliali miste da un midollo spinale di topo

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Impara un protocollo rapido per isolare cellule mononucleari da cervello e midollo spinale di topo usando gradienti Percoll discontinui. Questo metodo consente l'analisi fenotipica dettagliata mediante citometria a flusso.

Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

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