Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

Le cellule immunitarie si infiltrano nel sistema nervoso centrale durante infezioni, traumi, autoimmunità o neurodegenerazione. Mentre gli approcci istochimici possono essere utilizzati per determinare la posizione delle cellule infiltranti e per analizzare la patologia associata, queste tecniche sono limitate dal numero di anticorpi che possono essere utilizzati contemporaneamente. Qui viene mostrato un metodo per l'isolamento rapido di cellule mononucleate dal cervello e dai tessuti del midollo spinale in cui il tessuto sezionato viene prima omogeneizzato.

Successivamente, viene impostato un gradiente di perolo e, dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate vengono raccolte dall'interfaccia. Infine, le cellule vengono risciacquate e colorate con anticorpi Attraverso l'analisi della citometria a flusso, vengono distinte le cellule ematogene e la microglia di sorveglianza e possono essere determinate le loro proporzioni relative durante gli stati patologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il gradiente di Aris o in tale istochimica, è che richiede meno tempo.

Ciò consente di elaborare più tessuti contemporaneamente. A dimostrare la configurazione del gradiente sarà palino Un tecnico del mio laboratorio Preparare i reagenti che saranno necessari per questo protocollo. A partire da quattro millilitri di perolo isotonico di serie indicato come SIP per cervello.

Per fare questo, combina nove parti di perolo con una parte 10 volte HBSS senza calcio e magnesio mescolati per inversione. Quindi, preparare il 70% per chiamata mescolando il SIP preparato con una volta HBSS senza calcio e magnesio. Quindi erogare due millilitri del 70% per cole in un tubo conico di polipropilene da 15 millilitri per raccogliere il tessuto.

Per questa procedura, posizionare il cervello sezionato e il midollo spinale di tutti i topi oggetto di studio in becher contenenti 10 millilitri di RPMI su ghiaccio. Quindi, trasferire il tessuto in un omogeneizzatore di piumino da sette o 15 millilitri contenente tre millilitri di HBSS una volta con una dimensione di vestibilità ampia. Un pestello crea delicatamente una sospensione cellulare, quindi passa a un pestello di taglia B aderente e dissocia ulteriormente i tessuti.

Una volta omogeneizzato il tessuto, aggiungere RPMI o una volta HBSS a un volume finale di sette millilitri e procedere all'impostazione del gradiente per impostare il gradiente percoco. Iniziare aggiungendo tre millilitri di SIP alla sospensione cellulare fino a una concentrazione finale di PERCOCO del 30%Tenere presente che il perolo deve essere utilizzato a temperatura ambiente. Se viene utilizzato a freddo, le cellule tendono a raggrupparsi e la separazione delle celle è meno efficiente.

Quindi, utilizzando la modalità di gravità per l'impostazione della pipetta, sovrapporre lentamente la sospensione cellulare da 10 millilitri sopra il SIP al 70%. Evitare di mescolare le soluzioni al 70% e al 30%. Questa è la fase più critica della procedura.

Una linea piatta molto chiara dovrebbe essere visibile all'incrocio tra il 70 e il 30%. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la terza soluzione e il 70% si mescoleranno durante la stratificazione. Il passo successivo, compromettendo l'interfaccia Centrifuga 30 minuti da 500 Gs a 18 gradi Celsius.

Assicurarsi che la centrifuga si fermi con un'interruzione minima o nulla in modo che l'interfaccia non venga disturbata. Dopo aver ruotato i gradienti, uno strato spesso e viscoso di detriti dovrebbe accumularsi nella parte superiore del tubo. Lo strato successivo è il 30% giallastro per strato centrale, che a volte contiene detriti.

La prossima è l'interfaccia da 70 a 30, che dovrebbe avere un alone bianco definito e contenere le celle mononucleate. Infine, sul fondo del tubo c'è lo strato trasparente di perolo al 70%. Se non si osserva alcuna interfaccia, la resa delle celle sarà probabilmente molto bassa, rendendo estremamente difficile un'ulteriore analisi.

Pertanto, a quel punto, potrebbero essere necessarie sospensioni cellulari fresche per ridurre la contaminazione. Rimuovere con cautela lo strato di detriti dalla parte superiore del tubo e gettarlo. Quindi, utilizzando una pipetta di plastica, passare attraverso il 30% superiore per strato di nucleo e raccogliere due o tre millilitri dell'interfase 70 30 e trasferirlo in una provetta conica pulita contenente otto millilitri di una volta HBSS.

Mescolare le interfacce diluite alcune volte per inversione, quindi centrifugare per sette minuti a 500 GS a 18 gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere il supena e risospendere il pellet. In un millilitro di tampone di colorazione cellulare, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 millilitri e lavarla ancora una volta.

Utilizzando una microcentrifuga a 10.000 GS per un minuto a quattro gradi Celsius prima di procedere con la colorazione degli anticorpi per eseguire la colorazione degli anticorpi, risospendere i pellet in 50 microlitri di CD 16, CD 32 purificato anti-USA, diluito da uno a 200 in tampone di colorazione cellulare per bloccare i siti di legame delle FC. Come per qualsiasi procedura di colorazione, è imperativo che tutti gli anticorpi siano adeguatamente titolati e incubino su ghiaccio per 10 minuti. Durante l'incubazione, rimuovere da due a cinque microlitri di cellule e contarle utilizzando un emocitometro.

I tessuti combinati naive del cervello e del midollo spinale dovrebbero produrre da tre a cinque volte da 10 a cinque cellule per topo. I cervelli infiammati avranno un numero variabile di cellule infiammatorie a seconda del momento in cui vengono raccolte e del modello di malattia Dopo l'incubazione con CD 16 e CD 32, aggiungere 50 microlitri di cocktail di anticorpi specifici per le cellule immunitarie. La miscela utilizzata in questo esempio contiene anticorpi contro CD 45, CD 4 e CD 19 incubati su ghiaccio per 30 minuti.

È importante sottolineare che ogni anticorpo deve essere prima titolato. Per valutare la diluizione ottimale, utilizzare combinazioni di fluorocromo appropriate scelte in base alle capacità del laser e alle impostazioni del filtro del flusso specifico. Il citometro, dopo aver colorato le cellule, le lava nel tampone di colorazione cellulare aggiungendo un millilitro di tampone di colorazione cellulare e le fa girare per un minuto.

A 10.000 g dopo la centrifuga, scartare l'agente supino, quindi risospendere i pallet in 100-200 microlitri di tampone di colorazione cellulare per l'analisi citofluorimetrica immediata per l'analisi successiva dell'analisi. Reus sospendere le cellule in 2% di formaldeide preparata in PBS e conservare per una notte a quattro gradi Celsius. Qui sono mostrate cellule mononucleate ottenute e incubate con blocco FC, seguite da anticorpi anti CD 45, CD 4 e CD 19.

In conformità con il protocollo dimostrato dalla citometria a flusso, la colorazione CD 45 separa bene le cellule ad alta ematogena CD 45 da CD 45, microglia di sorveglianza DIM. Questa figura mette a confronto le cellule isolate da un cervello naïve e uno infiammato da un topo indotto a sviluppare un'encefalomielite autoimmune sperimentale. CD 45 Un'intensità di PC è mostrata sull'asse Y dove tre popolazioni distinte sono visualizzate nel cervello naïve.

Vengono rilevati pochissimi numeri di celle alte CD 45. Di solito meno del 2% della popolazione totale isolata. In confronto, i cervelli dei topi affetti da EAE mostrano un massiccio afflusso di cellule del sangue reclutate nel cervello.

L'aggiunta di altri marcatori di superficie cellulare come CD 11 b, CD quattro, CD otto, eccetera, consente un'ulteriore caratterizzazione dell'alta popolazione di CD 45 Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Durante la partecipazione a questa procedura, è importante ricordare che gli approcci istologici in combinazione con la fenotipizzazione immunitaria mediante citometria a flusso sono fondamentali per caratterizzare completamente la composizione degli infiltrati infiammatori del SNC.