Name: Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo linfezione intraperitoneale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Scopri come monitorare l'uptake e il traffico di prioni da parte delle cellule immunitarie nel topo poche ore dopo l'infezione. Questo metodo utilizza prioni fluorescenti e citometria a flusso per identificare macrofagi e cellule dendritiche coinvolte.

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Ringraziamo McBryant Steve e Jeff Hansen aiuto per ultracentrifugazione e Patti Kiser aiuto per la gestione del mouse. L&#39;Istituto Nazionale di Malattie neurologici e colpo al National Institutes of Health, concedere 5R01NS056379-02 finanziato questo lavoro.

1. Purificante e etichettatura Rods prioni Questo protocollo è adattato da quello precedentemente pubblicato 18 <ol><li> Omogeneizzare 100 grammi di prioni infetti tessuto cerebrale in 900 ml di buffer di ghiaccio freddo omogeneizzazione (HB, 1X PBS contenente 320 mM saccarosio, 150 mM NaCl e 4mm EDTA) 1 min alla massima velocità in una pubblicità frullatore, poi 2 minuti sul ghiaccio. Ripetete tre volte. </li><li> Centrifuga omogenato per 10 min a 3000 xg e 4 ° C. Rimuovere il surnatante e sul ghiaccio. Risospendere pellet in 1L HB e ripetere i punti 1.1 e 1.2. </li><li> Surnatanti piscina e centrifugare per 60 minuti a 100.000 xg, 0 ° C. Gettare il surnatante. </li><li> Risospendere pellet in 100 ml di soluzione salina tamponata Tris 1X (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM NaCl, 1 mM EDTA) contenente 2% Triton X-100 (TBST). Stima concentrazione di proteine ​​da Bradford o test simili e regolare a 5 mg / ml in TBST. Freddo in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare per 30 min a 100.000 xg, 0 ° C. Gettare il surnatante e lavare pellet con 50 mL TBST poi 100 mL TBS. Risospendere pellet in 100 ml di PBS 1X contenente l'1% sarcosyl e cocktail inibitore della proteasi e mescolate per 120 minuti a 37 ° C. </li><li> Strato del campione su 900 ml di 320 mM saccarosio e centrifugare per 60 minuti a 100.000 xg, 10 ° C. Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml 2.3M NaCl, 5% sarcosyl. </li><li> Sonicare campione di 5 x 40 secondi alla potenza massima del 70% a intervalli di 1 min sul ghiaccio. </li><li> Aliquota 1 ml di campione in provette Eppendorf e centrifugare per quindici minuti a 13.000 xg, 4 ° C. Lavare pellet due volte con TBS e conservare @ -70 ° C o coniugato al fluorocromo al punto 1.9. </li><li> Coniugato 1 tubo di purificato aste dei prioni con 1 fiala di DyLight 649 fluorocromo secondo il protocollo del produttore. </li><li> Scambio DyLight tampone di etichettatura per PBS da dialisi o centrifugazione attraverso le colonne del filtro. Conservare in 20 microlitri aliquote a -70 ° C al riparo dalla luce fino al momento dell'uso. </li></ol> 2. Prioni inoculazione e recupero cellulare Questa sezione comprende l'inoculazione intraperitoneale prioni e il recupero di cellule dal peritoneo, linfonodi mediastinici e mesenterici e la milza. <ol><li> Diluire aste prioni fluorescenti 1:50 in PBS immediatamente prima dell'uso. Topo collottola dal collo di pelliccia dorsale con pollice e indice, delicatamente girare mouse per affrontare voi e frenare la coda con il dito mignolo. Supinazione del mouse, elevando torso posteriori sopra la testa e tenendolo un po 'a testa in giù. </li><li> Utilizzando una siringa per insulina 30G, iniettare 100 ml di aste prioni fluorescente 1 cm lateralmente alla linea mediana e 1-2 cm anteriormente alla sacroiliaca. Inserire l'ago 1 centimetro attraverso la pelle rivolta a 45 ° medialmente. L'uso diluizione 1:50 di perline fluorescenti o PBS solo come controlli. Incubare i topi per il tempo assegnato prima dell'analisi. </li><li> Euthanize topi secondo la cura degli animali approvato ed utilizzano protocolli commissione. Iniettare 10 ml di PBS nella cavità peritoneale con una siringa da 12 ml e ago 25G. Scuotere delicatamente carcassa longitudinalmente per un minuto. Recuperare sospensione cellulare dal peritoneo utilizzando la stessa siringa e un ago 16G in un tubo da 15 ml e riserva sul ghiaccio mentre dissezione della carcassa continua. </li><li> Bagnare la parte ventrale della carcassa accuratamente con etanolo al 70%. Sollevare la pelle sulla linea mediana appena sotto la gabbia toracica con una pinza e tagliate una piccola incisione attraverso la pelle con le forbici. A partire lì, fare una incisione lungo 3-5 centimetri tra la pelle in entrambe le direzioni a testa e la coda, poi due incisioni di 2 cm dalla linea mediana lateralmente da ciascuna estremità. Staccare la spina e pelle per rivelare la cavità peritoneale e toracica. Con attenzione tagliare le sottili membrane traslucide che circondano il peritoneo e riflettono il torace per rivelare il mediastino. </li><li> Individuare e rimuovere 2-4 linfonodi mediastinici, leggermente dorsale e lateralmente adiacente al timo, medialmente adiacente all'arteria brachiocefalica, vicino al lato ventrale della trachea. Individuare e rimuovere i nodi fino a sei linfonodi mesenterici, incorporati nel tessuto molle mesenterica bianco che ancora l'intestino alla parete addominale posteriore. Individuare e rimuovere la milza, un lungo organo rosso scuro situato laterale della linea mediana e dorsale per l'intestino nella parte sinistra dell'addome. Linfonodi riserva in 1 ml di RPMI 1640 medium in ghiaccio fino dissezione è completa. </li><li> Macerare e premere linfonodi attraverso un filtro di 40 micron in 3 mL di RPMI in una capsula di Petri di plastica con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Sciacquare il filtro con un ulteriore 2 ml di RPMI e trasferire i 5 ml di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Sciacquare la piastra Petri con altri 5 ml di RPMI e trasferimento al tubo stesso. Centrifugare 5 min a 250 xg, scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml FACS tampone (PBS 1X, 1% di albumina sierica bovina e 10 mM EDTA) e trasferire in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. </li></ol> ove_title "&gt; 3. colorazione della cellula e Citometria a Flusso Il seguente è un protocollo di colorazione tipica per identificare sottogruppi di cellule immunitarie utilizzando anticorpi fluorescenti contro marcatori cellulari ben caratterizzati immunitario di superficie. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in tampone FACS immediatamente prima dell'uso. <ol><li> Contare le celle e aliquota 10 6 cellule in provette Eppendorf. Cellule centrifuga (vedi 2.7) e lavare pellet 2X con 1 mL di tampone di FACS. </li><li> Incubare cellule di 20 minuti sul ghiaccio in 100 l di 2 ng / mL ratto anti-topo CD16/32 di bloccare i recettori Fc endogena. Pellet e le cellule lavare con tampone FACS. </li><li> Aggiungere 100 ml di 1NG / mL appropriati anticorpi fluorescenti (y) IES ad ogni campione e incubare in ghiaccio per un'ora. Aggiungere 100 ml di buffer di FACS solo alle cellule di controllo. Pellet e le cellule lavare due volte con tampone FACS. </li><li> Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di ACK (150 mm NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 e 0.1 mM EDTA) Incubare in ghiaccio per 1 min per lisare i globuli rossi. Pellet e le cellule lavare con tampone FACS. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di FACS. </li><li> Raccogliere i dati dalle cellule utilizzando un citometro a flusso multicolore capace di rilevazione e di analisi, tipicamente con laser 405 nm, 488 e 633 eccitazione e 09:55 rilevatori di emissioni di fluorescenza. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Siamo purificati da prioni aste greggio, prioni infetti omogenato cerebrale (figura 1) solubilizzazione Detergente e ultracentrifugazione del alce E2 cervello omogenato (corsie 1 e 2) notevolmente arricchito per aste dei prioni (confrontare corsie 1 e 3), che è stato anche proteasi K resistente (corsia 4). È interessante notare che non digerito aste dei prioni purificata mostrato un profilo di glycoform sorprendentemente simile a omogenato E2 digerito cervello, indicando arricchimento drammatico per i prioni. Identicamente trattati con omogenato di cervello normale non ha prodotto PK-resistente PrP C (corsie 5 e 6). Citometria a flusso di popolazioni di cellule specifiche dimostrare che le cellule presentanti l'antigene casa al peritoneo di due ore e conservare perline fluorescenti e bacchette prioni, come evidenziato dalla fluorescenza drammaticamente aumentata durante i controlli PBS iniettato (Figura 2). Nessun cellule raccolte dal peritoneo di PBS trattati con comandi visualizzati sopra fluorescenza di fondo (Fig. 2A-G), mentre le cellule da cordone (Fig. 2H-N) e prioni (Fig. 2O-U)-inoculato nei topi visualizzata fluorescenza significativo, soprattutto sui monociti (Fig. 2I e P), le cellule dendritiche (Fig. 2K e R) e macrofagi (Fig. 2L e S), e alcuni neutrofili (Figura 2J e Q) e un minor numero di cellule B (2T Figura). Perline e prioni portante monociti, le cellule dendritiche ei macrofagi sono stati trovati anche nei linfonodi mediastinici due ore dopo l'inoculazione (Fig. 2AD e AK, AF e AM e AN e AG, rispettivamente), mentre poche o nessuna PrP CWD-cuscinetto neutrofili , le cellule B o T sono stati trovati lì (fig. 2AE e AL, AH e AI e AG e AP, rispettivamente). Abbiamo rilevato nessun perline o aste dei prioni nella milza e nei linfonodi mesenterici (dati non riportati). In toto, questi dati dimostrano che le cellule immunitarie traffico prioni in modo molto simile agli antigeni altre particelle. <table border="1"><tbody><tr><td> REAGENTE </td><td> Fluorocromo </td><td> ECCITAZIONE LASER (nm) </td><td> Picco di emissione (nm) </td></tr><tr><td> Prioni aste </td><td> DyLight 649 </td><td> 633 </td><td> 674 </td></tr><tr><td> 1 perline micron </td><td> AlexaFluor 660 </td><td> 633 </td><td> 685 </td></tr><tr><td> Anticorpi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CD11b </td><td> eFluor 450 </td><td> 405 </td><td> 450 </td></tr><tr><td></td><td> Ficoeritrina-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> R-ficoeritrina </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td></td><td> Ficoeritrina-Cy7 </td><td> 488 </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Ly6C </td><td> Fluoroisothiocyante </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> Ly6G </td><td> R-ficoeritrina </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr><tr><td> CD21 </td><td> DyLight 488 </td><td> 488 </td><td> 518 </td></tr><tr><td> B220 </td><td> Allophycocyanin-Cy7 </td><td> 633 </td><td> 785 </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> R-ficoeritrina </td><td> 488 </td><td> 575 </td></tr></tbody></table>"&gt; Tabella 1. Proprietà spettrali di reagenti fluorescenti <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Purificazione di canne da prioni omogenato cerebrale infetto. Abbiamo usato un 10% omogenati cerebrali greggio da un CWD infetti cervo (E2, corsie 1 e 2) come materiale di partenza da cui ci purificati aste prioni aggregati (corsie 3 e 4). Entrambi i materiali grezzi e purificati hanno mostrato resistenza caratteristica a proteasi K trattamento (corsie 1 - 4), mentre omogenato cerebrale normale non (corsie 5 e 6). Marcatori peso molecolare sono riportate nella Kd a sinistra della macchia. BH, omogenato cerebrale. <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi di citometria a flusso di traffico di cellule immunitarie prioni dal peritoneo ai linfonodi mediastinici due ore dopo l'inoculazione. PBS (pannelli AG e V-AB), perline fluorescenti (HN e AC-AI) o di bacchette da prioni (OU, e AJ-AP) sono stati iniettate nel peritoneo di topi e le cellule raccolte dal liquido di lavaggio peritoneale (AU) o linfonodi mediastinici (V-AP), due ore dopo. Grafici nel prime cellule mostrano colonna da topi trattati con PBS (pannelli A e V), perline fluorescenti (pannello H e AC) e aste dei prioni (pannelli O e AJ). Cellule fluorescenti (punti rossi o verdi) e le cellule totale (punti grigi) vengono riportati per mostrare dimensione relativa (scatter in avanti), granularità (scatter lato) e la proporzione del totale delle cellule vive che fluorescenza. Un significativo numero di cellule caratteristico dei granulociti mantenuto perline fluorescenti e bacchette. Le cellule sono state anche colorate con anticorpi contro marcatori immunitari superficie cellulare e gated per LYG-Ly6C + monociti (pannelli B, I, P, W, AD e AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + neutrofili (C, J, Q, X, AE e AL), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + cellule dendritiche (D, K, R, Y, AF e AM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + macrofagi, (E, L, S, Z, AG e AN), CD3 -B220 + CD21 + cellule B (F, M, T, AA, AH e AO) e CD21-B220-cellule T CD3 + (G, N, U, AB, AI e AP). Monociti, le cellule dendritiche ei macrofagi mantenuto perline fluorescenti e aste dei prioni nella cavità peritoneale (pannelli di I e P, K e R e L e S, rispettivamente) e trasportati a linfonodi mediastinici (pannelli dC e AK, AF e AM e AG e AN, rispettivamente), dimostrando l'assorbimento simili e il traffico di queste due particelle. Neutrofili mantenuto una notevole quantità di perle (J) e un minor numero di aste (Q), ma non è riuscito a consegnarli ai linfonodi (AE e AL). Cellule B conservati e trasportati alcune aste (T e AO), ma praticamente nessun perle (M e AH). Le cellule T di traffico né perle né barre (N, U, AI e AP).

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<li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li>
<li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass%2C+biochemical+composition%2C+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui mostriamo un protocollo per il tagging e prioni monitoraggio in vivo che facilita notevolmente il monitoraggio eventi precoci nelle infezioni da prioni periferici. Questo protocollo migliora significativamente i tentativi passati a monitorare l&#39;assorbimento del prione in vitro 9 e in vivo da 3,12 pre-etichettatura inoculo prione altamente arricchito per inequivocabilmente lo differenziano da PrP C endogena. Poiché i prioni infettivi e PrP C c...

<table><tbody><tr><td>Cervello di alce infetto da CWD</td><td>Fattoria privata di alci in Colorado</td><td></td><td>Utilizzare qualsiasi cervello infetto da prioni non umani</td></tr><tr><td>Frullatore</td><td>Oster Professional Products</td><td>6694-015</td><td>Utilizzare qualsiasi frullatore commerciale</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Rotore SS34</td><td>Utilizzare qualsiasi centrifuga/rotore in grado di raggiungere 3000 x g e contenere volumi &amp;#8805; 500 ml</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Rotore 50.2 Ti</td><td>Utilizzare qualsiasi ultracentrifuga/rotore in grado di raggiungere 100.000 x g e contenere volumi &amp;#8805; 500 ml</td></tr><tr><td>Reagente di Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori delle proteasi mini</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Misonix</td><td>MP4000X</td><td>Utilizzare qualsiasi sonicatore a sonda o a corno impostato al ~70% della potenza massima</td></tr><tr><td>Kit di etichettatura anticorpale DyLight</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>53050</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>55430R</td><td>Utilizzare qualsiasi microcentrifuga refrigerata in grado di raggiungere 13.000x &lt;em&gt;g&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Colonne filtranti centrifughe</td><td>EMD Millipore</td><td>Microcon YM-100</td><td>Utilizzare qualsiasi filtro o membrana per dialisi con cutoff del peso molecolare di 100 Kd</td></tr><tr><td>Topi FVB di 8-40 settimane</td><td>Charles River Laboratories</td><td>207</td><td>Utilizzare qualsiasi ceppo di topi inbred</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti rosse da 1 &amp;mu;m</td><td>Phosphorex</td><td>2307</td><td>Utilizzare qualsiasi microsfera fluorescente &amp;#8804; 10 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Mezzo RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Setaccio cellulare da 40 &amp;mu;m</td><td>Falcon BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi fluorescenti</td><td>BD Biosciences</td><td>Vari</td><td>Utilizzare qualsiasi anticorpo fluorescente appropriato per la propria applicazione.</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>Dako</td><td>CyanADP</td><td>Utilizzare qualsiasi citometro a flusso in grado di rilevare fluorescenza multicolore</td></tr></tbody></table>

monitoraggio traffico di cellule immunitarie fluorescente rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presenza di una forma anomala di un host codifica della proteina prionica (PrPc) che è resistente alle proteasi, patologica e contagiosa che caratterizza le malattie da prioni come la sindrome del dimagrimento cronico (CWD) di cervidi e la scrapie nelle pecore. L&#39;ipotesi da prioni afferma che questo conformero anomala costituisce la maggior parte o tutti i prioni infettivi. Il ruolo del sistema immunitario in eventi precoci nella patogenesi dei prioni periferici è stata dimostrata in modo convincente per la malattia del dimagrimento cronico e scrapie 1-3. Transgeniche e studi farmacologici nei topi hanno rivelato un ruolo importante del sistema del complemento a mantenere e replicare i prioni presto dopo l&#39;infezione 4-6. In vitro e in studi in vivo hanno anche osservato la conservazione dei prioni da parte delle cellule dendritiche 7-10, anche se il loro ruolo nel traffico resta chiaro 11-16. I macrofagi sono similmente stati implicati nella patogenesi prioni presto, ma questi studi si sono concentrati sugli eventi che si verificano settimane dopo l&#39;infezione 3,11,17. Questi studi precedenti inoltre hanno il problema di distinguere tra endogena PrP C e prioni infettivi. Qui descriviamo una semiquantitativo, approccio imparziale per valutare l&#39;assorbimento del prione e il traffico dal sito di inoculazione da parte delle cellule immunitarie reclutate lì. Aste dei prioni aggregati sono stati purificati da omogenato cerebrale infetto da solubilizzazione di detergente non aggregata proteine ​​e ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio. Poliacrilammide gel elettroforesi, colorazione Coomassie blu e occidentale recupero blotting confermato di aste prioni altamente arricchito nella frazione pellet. Aste prioni sono stati marcati con fluorocromi intraperitoneale poi iniettato in topi. Due ore dopo, cellule immunitarie dal liquido di lavaggio peritoneale, nella milza e nei linfonodi mediastinici e mesenterici sono stati analizzati per la ritenzione del prione asta e sottoinsiemi di cellule identificate mediante citometria di flusso multicolore utilizzando marcatori per i monociti, i neutrofili, cellule dendritiche, macrofagi e delle cellule B e T. Questo test permette di monitorare in tempo prima diretta di cellule immunitarie acquisizione e il traffico di prioni in vivo poche ore dopo l&#39;infezione. Questo test inoltre differenzia chiaramente infettive, aggregati da prioni PrPC normalmente espressa sulle cellule ospite, che può essere difficile e portare a problemi di interpretazione dei dati nei sistemi di dosaggio altri. Questo protocollo può essere adattato alle altre vie di inoculazione (orale, endovenosa, intranervous e sottocutaneo, ad esempio) e gli antigeni (perline coniugato, agenti patogeni batterici, virali e parassitarie e proteine ​​dell&#39;uovo) pure.

Qui si descrive un nuovo metodo di analisi per monitorare l&#39;assorbimento del prione e del traffico da parte delle cellule immunitarie subito dopo l&#39;inoculazione intraperitoneale purificando e fluorescente etichettatura aste prioni aggregati da materiale cerebrale infetto allora monitoraggio loro adozione, e il movimento dal sito di iniezione e caratterizzare le cellule che mediano questi eventi.

Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l&#39;infezione intraperitoneale

Le malattie da prioni sono caratterizzate dalla presenza di una forma anomala della proteina prionica codificata dall'ospite (PrPC) che risulta resistente alle proteasi, patologica e infettiva...

L'obiettivo principale di questa procedura è monitorare l'assorbimento e il traffico dei prioni da parte delle cellule immunitarie entro poche ore dall'infezione. Per iniziare, purificare ed etichettare con fluorocromo i filamenti di prioni aggregati provenienti dal cervello infetto, quindi inoculare questi filamenti di prioni nella cavità peritoneale di topi. Dopo due ore, raccogliere le cellule dal peritoneo, dalla milza e anche dai linfonodi mediastinici e mesenterici. Infine, colorare le cellule recuperate con marcatori fenotipici immunitari e analizzarle per la ritenzione di PreOn.Ad esempio, i risultati della citometria a flusso possono essere utilizzati per dimostrare che i bastoncelli prionici sono trattenuti e trasportati principalmente da macrofagi e cellule dendritiche, secondariamente da monociti e in terza istanza da linfociti B. Questo sistema sperimentale è stato progettato per fare luce sui serbatoi dei prioni e sui potenziali bersagli terapeutici, rispondendo a domande fondamentali come quali cellule internalizzano i prioni immediatamente dopo l'infezione, dove li trasportano e con quale velocità arrivano a destinazione.Dimostreranno questa procedura Crystal, Mt. A

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