Monitoraggio Traffico di cellule immunitarie fluorescente Rods prioni ore dopo l'infezione intraperitoneale

L'obiettivo principale di questa procedura è monitorare l'assorbimento e il traffico dei prioni da parte delle cellule immunitarie entro poche ore dall'infezione. Per iniziare, purificare ed etichettare con fluorocromo i filamenti di prioni aggregati provenienti dal cervello infetto, quindi inoculare questi filamenti di prioni nella cavità peritoneale di topi. Dopo due ore, raccogliere le cellule dal peritoneo, dalla milza e anche dai linfonodi mediastinici e mesenterici. Infine, colorare le cellule recuperate con marcatori fenotipici immunitari e analizzarle per la ritenzione di PreOn.

Ad esempio, i risultati della citometria a flusso possono essere utilizzati per dimostrare che i bastoncelli prionici sono trattenuti e trasportati principalmente da macrofagi e cellule dendritiche, secondariamente da monociti e in terza istanza da linfociti B. Questo sistema sperimentale è stato progettato per fare luce sui serbatoi dei prioni e sui potenziali bersagli terapeutici, rispondendo a domande fondamentali come quali cellule internalizzano i prioni immediatamente dopo l'infezione, dove li trasportano e con quale velocità arrivano a destinazione.

Dimostreranno questa procedura Crystal, Mt. And Brady Michael, studenti laureati del mio laboratorio, per raccogliere le proteine PreOn. Omogeneizzare 100 milligrammi di tessuto cerebrale infetto da PreOn in 900 millilitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato per un minuto alla velocità massima in un frullatore commerciale, quindi porre immediatamente sul ghiaccio per due minuti. Ripetere questo processo tre volte per aumentare il rendimento proteico.

Centrifugare l'omogenato per 10 minuti a 3000 G e a quattro gradi Celsius. Rimuovere e conservare il sopranatante sul ghiaccio. Risospendere il pellet in un litro di hp e ripetere i passaggi di omogeneizzazione e centrifugazione.

Ora, unire il surnatante e centrifugare per 60 minuti a 100.000 ×g e a zero gradi Celsius. Scartare il soprannatante. Risospendere il pellet in 100 millilitri di TBST.

Stimare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford e regolare il volume a cinque milligrammi per millilitro di proteina in TBST. Raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare nuovamente per 30 minuti a 100.000 ×g e a zero gradi Celsius.

Scartare l'SNA e lavare il pellet prima con 50 millilitri di TBST. Quindi, risospendere il pellet ottenuto in 100 millilitri di 1x PBS contenente 1% sarcosil e cocktail di inibitori della proteasi, e agitare per 120 minuti a 37 gradi Celsius. Per eseguire un gradiente di saccarosio, sovrapporre il campione su 900 millilitri di saccarosio 320 millimolare e centrifugare per 60 minuti.

A 100.000 GS a 10 gradi Celsius. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di cloruro di sodio 2,3 M, 5% Sarco seal. Ora sottoporre il campione a sonicazione cinque volte per 40 secondi a una potenza massima del 70% a intervalli di un minuto.

Eluquizzare un millilitro di campione in provette EINOR e centrifugare per 15 minuti a 13.000 ×g a 4 °C. Lavare i pellet due volte con TBS e conservare le scorte a -70 °C. Coniugare un tubo di bastoncini PreOn purificati utilizzando un flaconcino di fluorocromo DITE 649 seguendo il protocollo del produttore.

Infine, sostituire il tampone di marcatura con PBS mediante centrifugazione attraverso colonne filtranti. Conservare in aliquote da 20 microlitri a meno 70 gradi Celsius, al riparo dalla luce, fino al momento dell'uso. Questa sezione comprende l'inoculazione intraperitoneale, il prione, e il recupero di cellule dal peritoneo, dai linfonodi mediastinici e mesenterici e dalla milza immediatamente prima dell'uso del prione fluorescente a D loop.

Tenere i topi con la pelliccia del collo dorsale in PBS con pollice e indice, catturandone da uno a 50. Ruotare delicatamente il topo in modo che sia rivolto verso di voi e bloccarne la coda con il mignolo. Supinare il topo, sollevando il tronco posteriore sopra la testa e tenendolo leggermente a testa in giù.

Utilizzando una siringa per insulina da 30 gauge, iniettare 100 microlitri di barre fluorescenti di pion, un centimetro lateralmente rispetto alla linea mediana e da uno a due centimetri in avanti rispetto al margine anteriore del legamento ileo-lombare. Inserire l'ago di un centimetro attraverso la cute, orientandolo a 45 gradi in direzione mediale; per i topi di controllo, utilizzare una diluizione da uno a 50 di microsfere fluorescenti o PBS da solo. In base al disegno sperimentale, incubare i topi per il tempo stabilito prima di iniziare le analisi.

Sopprimere i topi seguendo i protocolli approvati dal comitato per la cura e l'uso degli animali. Iniettare 10 millilitri di PBS nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 12 millilitri e un ago da 25 gauge. Oscillare delicatamente il topo in senso longitudinale per un minuto per proseguire con la dissezione del topo.

Inumidire completamente il lato ventrale del mantello del mouse con etanolo al 70%. Sollevare la pelle lungo la linea mediana appena al di sotto della gabbia toracica con una pinzetta ed effettuare una piccola incisione attraverso la cute con le forbici. Praticare un'incisione lunga da tre a cinque centimetri attraverso la pelle in entrambe le direzioni, verso la testa e la coda, rispetto a due.

Due incisioni di due centimetri dalla linea mediana verso la periferia da ciascuna estremità, sollevare e fissare la pelle per esporre le cavità peritoneale e toracica. Recuperare la sospensione cellulare dal peritoneo utilizzando la stessa siringa e un ago da 16 gauge. Versare l'esudato in un tubo conico da 15 millilitri e mantenere in ghiaccio.

Tagliare con attenzione la sottile membrana traslucida che circonda il peritoneo e riflettere il torace per esporre il mediastino. Individuare quindi e rimuovere da due a quattro linfonodi mediastinici, leggermente dorsali e adiacenti lateralmente al timo, adiacenti medialmente all'arteria brachiocefalica vicino al lato ventrale della trachea. Successivamente, individuare e rimuovere fino a sei linfonodi mesenterici immersi nel tessuto mesenterico bianco e molle che fissa l'intestino alla parete addominale posteriore.

Conservare i linfonodi in un millilitro di mezzo PMI 1640, tenendoli sul ghiaccio fino al completamento della dissezione. Infine, individuare e rimuovere la milza. Un organo di colore rosso scuro e allungato, situato appena laterale rispetto alla linea mediana e dorsale rispetto all'intestino, sul lato sinistro del topo.

Utilizzando lo stantuffo di una siringa da un millilitro, macerare e premere i linfonodi attraverso un setaccio da 40 micron in tre millilitri di PBS in una piastra di Petri di plastica. Risciacquare il setaccio con ulteriori due millilitri di PBS e trasferire la sospensione cellulare totale di cinque millilitri in un tubo conico da 15 millilitri. Inoltre, risciacquare la piastra di Petri con ulteriori cinque millilitri di PBS e trasferire il tutto nello stesso tubo.

Centrifugare il campione per cinque minuti a 250 ×g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare. Trasferire le cellule isolate in un tubo EOR da 1,5 millilitro con un millilitro di tampone fax.

Tipicamente, questo protocollo di colorazione può essere utilizzato per identificare sottoinsiemi di cellule immunitarie, utilizzando anticorpi fluorescenti diretti contro marcatori superficiali delle cellule immunitarie ben caratterizzati per mettere tutti gli anticorpi nel buffer fax. Immediatamente prima dell'uso, contare le cellule e aliquotare 10 alla sesta cellule in provette einor, centrifugare per formare il pellet cellulare e lavare il pellet due volte con un millilitro di buffer fax per bloccare i recettori FC endogeni.

Incubare le cellule in 100 microlitri di due nanogrammi per millilitro di ratto anti-US CD 1632 per 20 minuti sul pellet di ghiaccio e lavare le cellule con tampone fax. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di un nanogrammo per millilitro di anticorpo o anticorpi fluorescenti appropriati a ciascun campione e incubare sul ghiaccio. Per un'ora, aggiungere 100 microlitri di tampone fax da solo alle cellule di controllo, pellettare e lavare le cellule due volte con tampone fax.

Risospendere le cellule in un millilitro di buffer act, incubare sul ghiaccio per un minuto. Per lisare il pellet di globuli rossi e lavare le cellule, risospendere le cellule in un millilitro di buffer fax. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso, tipicamente con laser di eccitazione a 405, 488 e 633 nanometri e da cinque a dieci rivelatori di emissione fluorescente.

Il prione grezzo, omogeneato di cervello infetto, è fortemente arricchito in prioni. Il processo di purificazione prevede l'uso di detergenti, solubilizzazione e ultracentrifugazione dell'omogeneato di cervello di due alci. Il prodotto è una proteasi.

L'analisi FACS resistente al potassio di specifiche popolazioni cellulari dimostra che le cellule presentanti l'antigene raggiungono il peritoneo entro due ore e mantengono le microsfere fluorescenti e i bastoncini prionici. Le cellule provenienti da topi inoculati con microsfere e prioni mostravano una fluorescenza significativa, in particolare sui monociti, cellule dendritiche e macrofagi.

PreOn contenenti monociti, cellule dendritiche e macrofagi sono stati inoltre rinvenuti nei linfonodi mediastinici. Due ore dopo l'inoculazione, non abbiamo rilevato né perle né bastoncelli PreOn né nei linfonodi mesenterici né in altri. In questo esperimento, il video ha illustrato diverse procedure per purificare bastoncelli di prioni aggregati da cervello infetto, per eseguire iniezioni intraperitoneali, per identificare e isolare correttamente i linfonodi e, infine, per isolare e colorare le cellule immunitarie.