Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni elettrofisiologiche simultanee del potenziale d'azione di un neurone motore e della risposta sinaptica associata nel muscolo bersaglio. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto la pelle dal lato superiore del pesce. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'esporre il midollo spinale rimuovendo tutte le cellule muscolari dorsali sovrastanti.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'esporre il muscolo rapido bersaglio rimuovendo lo strato superiore di muscolo lento. L'ultimo passaggio della procedura è effettuare il blocco in corrente del neurone primario coddle o del neurone cap e il blocco in tensione del muscolo scheletrico bersaglio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le risposte sinaptiche nel muscolo associate alla generazione di potenziali d'azione del neurone motore, mediante il blocco in corrente simultaneo del neurone motore e il blocco in tensione del muscolo bersaglio.

LaVar Super Fish offriva una combinazione di vantaggi, che facilitano la registrazione accoppiata tra motoneuroni e muscolo scheletrico; la ridotta dimensione del muscolo permette un efficace clampaggio di tensione, e le caratteristiche stereotipate del motoneurone capitale ne consentono un facile riconoscimento e accesso. Ora illustrerò passo dopo passo le procedure necessarie per stabilire il patch clamp sia del neurone che del muscolo. Prima di iniziare la procedura, preparare cinque soluzioni fondamentali: soluzione di bagnamento, soluzione di bagnamento con Trica, soluzione di bagnamento con IDE, soluzione interna per neuroni e soluzione interna per muscoli.

Successivamente, raccogliere un singolo pesce zebra larvale di età compresa tra 72 e 96 ore e posizionarlo nella soluzione di bagnatura con trica. Entro un minuto dall'esposizione all'anestetico, il pesce non risponderà al contatto. Posizionare il pesce su una piastra di plastica e, utilizzando un microscopio stereoscopico, decapitarlo con una lametta a doppio taglio.

Trasferire il pesce in una camera di registrazione in vetro rivestita con sard e riempita con soluzione bass. Creare una falda cutanea vicino all'estremità rostrale del pesce utilizzando un perno che fornisca una presa adeguata per un paio di pinzette fini. Rimuovere la cute sovrastante afferrandola vicino al perno rostrale con un paio di pinzette fini.

Sbucciare lentamente nella direzione coddle per rimuovere la pelle. Trattare il pesce con tre millilitri di soluzione di bagno con form IDE per tre-cinque minuti per bloccare le contrazioni muscolari che potrebbero interferire con le registrazioni. Lavare cinque volte con soluzione di bagno normale.

Rimuovere parte dello strato superficiale muscolare su cinque-sei segmenti, raschiando delicatamente con il lato di un ago di tungsteno. Trasferire il pesce su un microscopio verticale posizionato all'interno di una gabbia di Faraday per schermare il rumore elettrico. Il microscopio è dotato di una piastra fissa con lunga distanza di lavoro, un obiettivo 40x e uno zoom compreso tra 0,5 e 4x.

Il microscopio è montato su un palchetto motorizzato per traslazioni XY. Per spostare il preparato tra nervo e muscolo con ingrandimento elevato, l'uso di ottiche a contrasto di interferenza differenziale consente di visualizzare i neuroni a un ingrandimento di 0,5x. Utilizzare una pipetta con orifizio largo da 15 micron per rimuovere il muscolo sovrastante ed esporre il midollo spinale.

Viene applicata una pressione negativa attraverso una siringa monouso da tre cc e le cellule muscolari vengono rimosse una alla volta. Questa procedura viene ripetuta per cinque o sei segmenti dorsali del muscolo scheletrico. La stessa pipetta larga viene utilizzata anche per rimuovere i due strati superiori del muscolo ventrale al fine di ottenere il muscolo scheletrico rapido bersaglio.

Questa operazione completa la preparazione per le registrazioni accoppiate e l'ingrandimento del microscopio viene aumentato a circa 1,6 x. I segmenti puliti vengono scansionati per individuare i neuroni del cappuccio. Ogni segmento HEMI del midollo spinale contiene un grande neurone motore del cappuccio con un diametro di 10 micron.

Questo soma di forma a goccia si trova in posizione superficiale al di sotto della Jira spinale, vicino all'estremità più distale del confine segmentale. Viene selezionato un neurone cap per la registrazione e viene esaminato il campo muscolare ventrale target associato al segmento coddle per verificarne l'integrità. Vengono posizionati due elettrodi per la registrazione, uno per il neurone e un secondo per il muscolo.

L'elettrodo superiore presenta un restringimento leggero per la penetrazione della dura spinale resistente e un'apertura alla punta di circa due micron. L'elettrodo inferiore ha un restringimento più accentuato per la registrazione in voltage clamp a bassa resistenza del muscolo scheletrico. Posizionare l'elettrodo per il neurone a un angolo di circa 30 gradi per penetrare la dura spinale.

Avanzare l'elettrodo utilizzando un manipolatore assiale circa metà segmento in direzione rostrale rispetto al neurone del cap scelto, applicando una pressione positiva continua e delicata di circa 60 millimetri di mercurio. Quando l'elettrodo penetra la dura madre, il neurone del cap può essere spostato dalla perfusione proveniente dall'elettrodo, richiedendo un aggiustamento del fuoco. Quando l'elettrodo tocca il SOMA del neurone del cap, la pressione positiva viene rilasciata e di solito si ottiene immediatamente la formazione di un sigillo giga.

Tuttavia, in alcuni casi in cui non si riesce a formare un sigillo, diventa necessario applicare una leggera pressione negativa. Dopo la formazione del sigillo, il potenziale dell'elettrodo viene regolato a meno 80 millivolt e l'applicazione di pressione negativa rompe la membrana cellulare. Il neurone capsulare è caratterizzato da una resistenza in ingresso compresa tra 140 e 180 megaohm e da un potenziale d'azione che supera i più 40 millivolt.

Questo viene verificato iniettando passaggi depolarizzanti progressivamente crescenti in condizioni di blocco della corrente fino a quando non viene generato il potenziale d'azione. Successivamente, il microscopio viene spostato sul muscolo ventrale utilizzando il traslatore motorizzato XY. A ingrandimento elevato, una cellula muscolare rapida viene selezionata dal campo bersaglio.

L'elettrodo muscolare viene avanzato verso la cellula muscolare bersaglio sotto pressione positiva, la quale, quando rilasciata, forma un sigillo giga; il potenziale dell'elettrodo viene regolato a meno 50 millivolt per inattivare i canali del sodio. E sotto un'aspirazione delicata, la membrana cellulare viene perforata. Una diminuzione della resistenza a 100-200 megaohm e la comparsa improvvisa di ampi segnali transitori capacitivi indicano l'ingresso nella cellula per il test della coppia.

Il neurone motore viene registrato mentre viene depolarizzato mediante iniezioni di corrente sempre maggiori fino a quando non viene generato un potenziale d'azione. A questo punto, dovrebbe essere generata una corrente di placca motrice nel muscolo; una stimolazione continua del neurone motore a un hertz determina correnti di placca motrice senza fallimenti. Quando la frequenza dello stimolo viene aumentata a 100 hertz, le correnti di placca motrice mostrano fluttuazioni nell'ampiezza e subiscono un esaurimento funzionale entro 10 secondi dalla stimolazione.

Tipicamente, la registrazione del neurone è stabile fino a un'ora, ma le cellule muscolari si deteriorano, come indicato da un aumento della resistenza in serie. Quando ciò accade, l'esperimento viene interrotto oppure viene effettuata una registrazione con patch clamp su un'altra cellula muscolare. Tutte le registrazioni devono essere completate entro un'ora.

Dopo aver acquisito un paio, la registrazione può essere completata in un tempo che va da un'ora a un'ora e mezza. È inoltre possibile ottenere uno o due paia aggiuntivi nei segmenti adiacenti. Una giornata tipica di registrazione produrrà da due a tre paia.

Le registrazioni accoppiate di motoneuroni e muscolo scheletrico offrono un'opportunità unica per esplorare il funzionamento fondamentale della trasmissione neuromuscolare. Quando utilizzate in combinazione con linee di pesci mutanti per la motilità, possono identificare la causa della disfunzione neuromuscolare e fornire nuove intuizioni sui meccanismi alla base di malattie umane come il sindrome metastatica.