Name: In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Scopri le interazioni tra adattatore Sla1p e clatrina in lievito mediante microscopia confocale a disco rotante e saggi di pull-down. Questo metodo combina imaging cellulare e analisi biochimica per studiare la cinetica dell'endocitosi mediata da clatrina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DF è supportato da una Bridges NSF per la borsa di dottorato. Il microscopio utilizzato in questo lavoro è sostenuto in parte dal Microscope Imaging infrastrutture di rete core di concedere Colorado State University. Il lavoro sugli adattatori clatrina in laboratorio l&#39;autore s è supportato da CSU start-up e fondi americani premio Heart Association 09SDG2280525 a SD

1. Inserimento di un tag GFP e marcatore nel gene SLA1 Applicare il metodo Longtine 17 per fondere un tag GFP direttamente alla fine del 3 'del telaio SLA1 lettura gene aperto (Sla1p C-terminale) e contemporaneamente segnare il gene con la E. coli kan r gene che consente la selezione G418. <ol><li> Genera un frammento di DNA mediante PCR utilizzando come modello il plasmide pFA6a-GFP (S65T)-kanMX6 18 e seguenti primer: in avanti, 5'-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 ', e reverse, 5'-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TCC TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT GAA AAT TTC GAG CTC GTT TAA AC-3'. La sequenza ha sottolineato corrisponde al segmento SLA1 gene specifico immediatamente precedente (forward primer) e seguendo il codone di stop (primer reverse). Isolare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio seguita da purificazione del DNA. </li><li> Preparare una da 50 ml cultura S. SEY6210 ceppo Saccharomyces (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, TRP1-Δ901, lys2-801, suc2 Δ9-GAL-MEL) 19 in YPD, crescendo a presto fase logaritmica (OD 600 = 0,2-0,6). Spin a temperatura ambiente per 3 min a 2.000 xg, lavare due volte con acqua sterile. </li><li> Trasformare il frammento di PCR ottenuto al punto 1 nelle cellule utilizzando la procedura di acetato di litio 20. Lavare le cellule con 1 ml di acqua sterile, aggiungere 1 ml YPD e incubare per 4 ore a 30 ° C in uno shaker. </li><li> Stendere le celle YPD-G418 piastre di selezionare per trasformanti G418 resistenti, incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli colonie e strisciare li YPD-G418 piatti. </li><li> Utilizzando colonia-PCR, identificare trasformanti in cui la GFP-kan modulo è stato opportunamente integrato con la SLA1 sequenze geniche per ricombinazione omologa. Utilizzare un primer forward che annealing all'interno della cornice SLA1 lettura aperta e un primer reverse annealing che all'interno della GFP-kan modulo. Identificare le colonie che i prodotti di PCR sono le dimensioni previste e verificare mediante sequenziamento. </li><li> Schermo le colonie al microscopio a fluorescenza per confermare che hanno fluorescenza GFP. </li></ol> 2. Mutazione della scatola variante clatrina (VCB) nel gene SLA1 <ol><li> Introdurre un LLDLQ AAALQ ad una mutazione nel gene SLA1 (nucleotidi 2407-2415), seguendo un approccio in due fasi 15. </li><li> In primo luogo, amplificare SLA1 nucleotidi 1207-1410 e 2427-2589 mediante PCR e clonare i frammenti all'interno di siti Noti / BamHI e EcoRI / Sali di pBluescriptKS, rispettivamente. </li><li> Sottoclone nel BamHI / EcoRI siti contenente un frammento di PCR URA3. </li><li> Incalzare il plasmide risultante con Noti / Sali, isolare il frammento URA3 da purificazione gel, e introdurlo mediante la trasformazione di acetato di litio nel Sla1-GFP ceppo generato nella parte 1, o in TVY614 (Mata ura3 leu2-52-3112-his3 Δ200 TRP1 -Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4:: LEU2 prb1:: HISG prc1:: HIS3) 21. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca l'uracile. Confermare con colonia-PCR e sequenziamento che il + colonie Ura contenere URA3 adeguatamente integrato sostituendo il frammento VCB. </li><li> In una seconda fase, sottoclone SLA1 nucleotidi 1207-2589 in Noti / Sali siti di pBluescriptKS. Utilizzando il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutano i residui VCB LLDLQ a AAALQ. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Incalzare il costrutto risultante con BsgI / AgeI, e isolare il VCB mutante contenente frammento di purificazione gel. Cotransform il BsgI / AgeI frammento con pRS313 (HIS3) 22 nel ceppo ricavato nella parte 2.3. </li><li> Stendere le celle integrate piastre SD manca istidina. La sua replica-piastra + colonie su terreno agarizzato contenente acido 5-fluorotic per identificare le cellule in cui le sequenze mutanti sostituito URA3, rigenerando così il sla1 gene contenente la mutazione di LLDLQ AAALQ (sla1 AAA). Confermare con colonia-PCR e sequenziamento. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Crescere i ceppi di lievito Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP generati nelle parti 1 e 2 in 4 ml di SD integrato dei media a 30 ° C in un rotatore al buio fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 0,1-0,4. Spin 1 ml di cultura in microcentrifuga a 4.000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare ~ 950 ml di sopranatante. Risospendere le cellule del liquido residuo (~ 50 ml). </li><li> Deposito 3 ml di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e coprire con un coprioggetto di vetro. Proteggere il campione dalla luce. </li><li> Montaggio di diapositive su un 100x ad immersione in olio obiettivo di una filatura-disco microscopio confocale. </li><li> Individuare corretta sul piano focale di cellule utilizzando illuminazione campo chiaro o 488 nm laser con filtri appropriati per eccitare e rilevare la fluorescenza di GFP. </li><li> Cattura time-lapse immagini di Sla1-GFP e sla1 AAA-GFP in cellule con tempo di esposizione di 500 ms (o il valore del caso) ad unn intervallo di un'immagine al secondo per 150 secondi. Risultato atteso: punctae GFP etichetta apparirà sulla superficie interna di limitare membrana della cellula, persistono per alcuni secondi, e spostare verso il centro della cellula, come il segnale scompare rapidamente (indicando cappotto smontaggio). </li><li> Selezionare una porzione di un'immagine in cui si vedono macchie di apparire, rimangono per alcuni secondi, e sparire. Ritaglia questa sezione dell'immagine per ogni fotogramma del time-lapse immagini. </li><li> Generare un chimografo rappresenta questa sezione dell'immagine in ogni fotogramma del secondo 150 time-lapse immagine allineando le cornici lungo un asse corrispondente al tempo trascorso. </li><li> Calcolare la durata di ogni luogo in base a quanti secondi (time-lapse frames) i punti è presente nel chimografo. Si noti che ogni punto dovrebbe "curva" verso l'interno della cellula come sta scomparendo, riflettendo endocitosi e lo smontaggio del mantello. </li><li> Confronta tipo selvatico Sla1-GFP con sla1 AAA-GFP. Ripetere l'operazione per determinare se i risultati sono statisticamente significativi. Risultato atteso: sla1 AAA-GFP macchie persistono significativamente più lunga (~ 80 sec) di tipo selvatico (~ 30 sec) che indicano un difetto nella formazione del mantello 15. </li></ol> 4. Preparazione di estratto di lievito citosolica ed estrarre cellule totale <ol><li> Inoculare 3 litri di YPD con un ceppo di lievito appropriato, come TVY614 21, e crescere a 30 ° C in un incubatore shaker fino a raggiungere un diametro esterno 600 = 1-2. </li><li> Centrifugare la cultura lievito a temperatura ambiente per 20 minuti a 3.700 x g. Eliminare il supernatante, aggiungere 3-5 ml di acqua sterile, e pipetta su e giù fino a quando il pellet è completamente risospeso. </li><li> Versare circa 150 ml di azoto liquido in un becher da 250 ml di plastica. Flash-congelare il lievito, aggiungendo goccia a goccia in azoto liquido in un modello circolare per evitare di agglutinazione del pellet congelato. Non lasciate che il disgelo pellets, aggiungere azoto liquido più se necessario. </li><li> Raffreddare un contenitore in acciaio inox frullatore versando azoto liquido in esso. Consentire l'azoto liquido per far evaporare quasi completamente. Aggiungere il lievito pellet congelato al contenitore freddo frullatore. Chiudere il contenitore frullatore con un tappo di gomma fredda e macinare il pellet di lievito per 10 secondi. Invertire i tempi contenitore 3-4 a mescolare i contenuti e ripetere la fase della macinatura due volte. Il lievito terreno ghiacciato avrà una polvere-come l'apparenza. </li><li> Freddo un imbuto e un tubo da 50 ml coniche con azoto liquido. Utilizzando l'imbuto freddo, trasferire il lievito di terra al tubo. Il lievito terreno ghiacciato può conservare a -80 ° C o utilizzato immediatamente. </li><li> Per ottenere un estratto citosolico per la GST-fusione dosaggio di proteine ​​affinità (parte 5), peso 3 g di terreno ghiacciato TVY614 lievito in un tubo da 15 ml e risospendere in 3 ml di tampone a temperatura ambiente A (10 HEPES mM, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) cocktail contenenti inibitori della proteasi (Sigma). </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi messo in ghiaccio. </li><li> Ultracentrifuga l'estratto a 4 ° C per 20 min a 300.000 x g. Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto citosolico) ad un tubo conico con una pipetta senza disturbare il pellet. Mantenere l'estratto citosolico sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 100 ml di un (v / v) 50% glutatione-Sepharose liquami in tampone A. E 'conveniente tagliare l'estremità della punta in modo da facilitare pipeting le perline. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e trasferire i (estratto citosolico) surnatante in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li><li> Per ottenere estratti cellulari totali per il co-immunoprecipitazione esperimenti (punto 6) utilizzare ceppo TVY614 (WT SLA1), il ceppo sla1 AAA che trasporta un LLDLQ ad una mutazione AAALQ generato nella parte 2 a TVY614 sfondo, e un ceppo sla1 portando una cancellazione del SLA1 gene come GPY3130 23. Peso 2 g di lievito corrispondente terreno ghiacciato in tubi conici e risospendere in 2 ml di tampone a temperatura ambiente A, contenente cocktail inibitore delle proteasi (Sigma) e il 2% Triton X-100. </li><li> Tappo e capovolgere il tubo più volte fino a quando completamente scongelati e poi incubare in ghiaccio per 10 minuti, mescolando periodicamente per inversione. </li><li> Trasferire il materiale in tubi da microcentrifuga e far girare a 4 ° C per 15 minuti a 16.000 xg (velocità massima in microcentrifuga). Con attenzione trasferire il sopranatante (estratto totale della cella) in una provetta conica sul ghiaccio con una pipetta senza disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 100 ml di una proteina al 50% (v / v) A-Sepharose liquami in tampone A. Ruota a 4 ° C per 15 minuti, spin-down le perle per centrifugazione a 4 ° C per 2 min a 1.000 xg, e il trasferimento il surnatante (estratto in totale) in una nuova provetta. Riserva del 50 ml di estratto per il controllo di input. </li></ol> 5. Proteina di fusione GST-test affinità <ol><li> Amplificare mediante PCR un frammento containing la variante Sla1p clatrina-box (VCB) (residui 803-807), si clone in pGEX-5X per ottenere pGEX-5X-VCB. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Utilizzando pGEX-5X-VCB come modello e il QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene), mutare il VCB residui LLDLQ per AAALQ di ottenere pGEX-5X-vCBmut. Verificare mediante sequenziamento. </li><li> Esprimere GST e le proteine ​​di fusione GST-VCB e GST-vCBmut in E. coli (BL21 DE3), purificare utilizzando glutatione-Sepharose, eluire dalla perline con glutatione ridotto, Dializzare contro PBS, e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Etichetta 3 tubi da microcentrifuga: GST, GST-VCB, e GST-vCBmut, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) glutatione-Sepharose liquami in tampone A, e 50 mcg di dialized GST, GST -VCB, o GST-vCBmut proteine ​​di fusione. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire vincolanti. </li><li> Lavare le perle 2 volte con PBS e 1 volta con tampone A. Aggiungere 1 ml di estratto di lievito citosolica - preparato come descritto nella parte 4 - ad ogni provetta. </li><li> Ruotare i tubi di 1 ora a 4 ° C, rotazione 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con tampone A contenente 0,1% di tempo Triton X-100, e 1 con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: si lega clatrina a GST-VCB ma non per GST o GST-vCBmut. Anche analizzare i campioni da SDS-PAGE per confermare carico simile di proteine ​​di fusione GST. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitazione test <ol><li> Etichetta 3 tubi microcentrifuga: WT (tipo selvaggio SLA1), sla1 AAA, e sla1Δ, e aggiungere 1 ml di PBS, 30 ml di un 50% (v / v) di proteina A-Sepharose liquami in tampone A, e 2 mg di coniglio anti-Sla1p anticorpi. </li><li> Ruota a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare le perle due volte con PBS e 1 volta con tampone A contenente 1% Triton X-100. </li><li> Aggiungere 1 ml di estratti di lievito corrispondente totale preparato Parte 4: SLA1, sla1 AAA, e sla1Δ. Ruota 1 ora a 4 ° C. </li><li> Spin 10 sec a 5.000 xg per far sedimentare le perline, scartare il surnatante e lavare rapidamente le perle 3 volte con un tampone contenente 0,1% Triton X-100, e 1 volta con tampone A. </li><li> Spin giù le perle ancora una volta e con una punta di carico gel rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C per continuare in un secondo momento. </li><li> Aggiungere 15 ml di tampone 2x campione Laemmli a ciascuna provetta, incubare a 96 ° C per 5 minuti, e spin 10 sec a 5.000 x g. </li><li> Analizzare i campioni da immunoblotting utilizzando un anticorpo alla catena clatrina pesante. Risultati attesi: clatrina co-immunoprecipitati con Sla1p wild-type, ma non con sla1 AAA, o nel campione sla1Δ. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analisi di adattatore Sla1p clatrina nei siti endocitico mediante microscopia a fluorescenza delle cellule vive. Un fotogramma (a sinistra) da un video e kymographs corrispondente (a destra) di cellule di lievito che esprimono Sla1-GFP o sla1 AAA-GFP che trasporta un LLDLQ alla mutazione AAALQ. Sia di tipo selvatico e mutante Sla1-GFP sono stati espressi dal endogeno SLA1 locus. Siti endocitico sono osservati come punti luminosi distribuiti nella periferia cellulare (immagini a sinistra). L'area tra le linee bianche corrisponde alla regione da cui sono stati generati kymographs. I film sono stati presi ad un frame rate di 1 frame / sec. Si noti la maggiore durata di Sla1-GFP nel LLDLQ a AAALQ mutante (sla1 AAA) rispetto al wild-type (SLA1). <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Interazione fisica tra clatrina e la Sla1p variante box clatrina. GST fusa Sla1p frammento aa798-813 contenente la sequenza LLDLQ (GST-VCB), il corrispondente AAALQ mutante (GST-vCBmut), da soli o GST (GST) sono stati tenuti a glutatione-Sepharose perline e incubate con un estratto citosolico da wild- tipo di cellule di lievito. Le proteine ​​associate sono stati eluiti ed analizzati mediante immunoblotting (IB) per clatrina catena pesante.

<ol><li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+taken%3A+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li>
<li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+assembly+and+endocytosis%3A+from+yeast+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li>
<li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Traub, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+for+sorting+of+transmembrane+proteins+to+endosomes+and+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes.</a> Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).</li>
<li>Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+clathrin-mediated+membrane+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding.</a> Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Clathrin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).</li>
<li>Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+basket+weaving%3A+formation+and+function+of+clathrin-coated+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).</li>
<li>Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptors+for+clathrin+coats%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptors for clathrin coats: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+AP-3+adaptor+complex+with+clathrin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin.</a> Science. 280, 431-434 (1998).</li>
<li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-binding+proteins%3A+got+a+motif%3F+Join+the+network%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!</a> Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).</li>
<li>Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic-lethal+interactions+identify+two+novel+genes%2C+SLA1+and+SLA2%2C+that+control+membrane+cytoskeleton+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).</li>
<li>Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sla1p+serves+as+the+targeting+signal+recognition+factor+for+NPFX%281%2C2%29D-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis.</a> J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).</li>
<li>Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i, Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Sla1p+homology+domain+1+and+interaction+with+the+NPFxD+endocytic+internalization+motif%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif.</a> EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).</li>
<li>Pietro, S. M. D. i, Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+clathrin+adaptor+function+in+endocytosis%3A+A+novel+role+for+the+SAM+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain.</a> EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123, 305-320 (2005).</li>
<li>Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-9561 (1998).</li>
<li>Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+HIS3+marker+and+GFP+reporter+modules+for+PCR-targeting+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 13, 1065-1075 (1997).</li>
<li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li>
<li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Clatrina rivestite vescicole (CCV) partecipare endocitosi e trasporto dal trans Golgi rete e endosomi, percorsi conservate che sono fondamentali per la biologia delle cellule eucariotiche. Gli approcci descritti in questo documento i metodi sono utili per studiare i meccanismi molecolari responsabili della formazione CCV, in particolare le interazioni tra proteine ​​adattatore e clatrina. GST-fusione affinità proteine ​​e co-immunoprecipitazione test permettono di prova per l&#39;associazione fisica tra un adat...

<table border="1"><th> Materiale </th><th> Azienda </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL mutagenesi sito-diretta kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> inibitore della proteasi cocktail </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo e in vitro di adattatore-clatrina interazione

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Un percorso importante endocitico inizia con la formazione di vescicole rivestite clatrina (CCV), che il trasporto merci dalla superficie cellulare di endosomi 1-6. CCV sono caratterizzati da un reticolo poliedrico di clatrina che ricopre la membrana delle vescicole e serve come un dispositivo meccanico patibolo. Cappotti clatrina sono assemblati durante la formazione delle vescicole da individuo clatrina triskelia, la forma solubile di clatrina composta da tre subunità luce pesanti e tre catene 7,8. Poiché il triscele non ha la capacità di legarsi alla membrana direttamente, clatrina vincolante adattatori sono fondamentali per collegare il reticolo che formano clatrina alla membrana attraverso l&#39;associazione con i lipidi e / o di proteine ​​di membrana 9. Adattatori anche il pacchetto di proteine ​​transmembrana carico, come i recettori, e possono interagire tra loro e con altri componenti della formazione CCV macchinari 9. Oltre venti adattatori clatrina sono stati descritti, molti sono coinvolti in clatrina endocitosi mediata e altri localizzare al Golgi trans rete o endosomi 9. Con l&#39;eccezione di HIP1R (lievito Sla2p), tutte le schede noto clatrina legarsi al N-terminale-elica dominio della catena clatrina pesante 9. Adattatori clatrina sono proteine ​​modulare composto da domini piegato collegati da non strutturati linker flessibile. All&#39;interno di queste regioni linker, brevi motivi vincolanti mediare le interazioni con la clatrina dominio N-terminale o altri componenti della formazione di vescicole macchinari 9. Due distinti clatrina vincolanti motivi sono stati definiti: la clatrina-box e il W-box 9. La clatrina-box sequenza consenso è stato originariamente definito come L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varianti, ma sono stati successivamente scoperti 11. Il W-box è conforme al PWxxW sequenza (dove x è qualsiasi residuo). Sla1p (letale sintetico con Actina binding protein-1) è stato originariamente identificato come una proteina actina associata ed è necessaria per la normale struttura del citoscheletro di actina e le dinamiche in siti endocitico in cellule di lievito 12. Sla1p si lega anche il segnale NPFxD ordinamento endocitico ed è fondamentale per endocitosi di carico porta il segnale NPFxD 13,14. Più recentemente, è stato dimostrato Sla1p legare clatrina attraverso un motivo simile alla finestra di clatrina, LLDLQ, definita una variante clatrina-box (VCB), e di funzionare come un adattatore endocitico clatrina 15. Inoltre, Sla1p è diventato un indicatore ampiamente usato per il cappotto endocitico negli studi di microscopia a fluorescenza delle cellule vive 16. Qui usiamo Sla1p come modello per descrivere approcci per l&#39;adattatore-clatrina studi di interazione. Ci concentriamo sulla microscopia a fluorescenza delle cellule vive, GST-pull down, e co-immunoprecipitazione metodi.

Clatrina endocitosi mediata dipende da proteine ​​adattatrici che coordinano la selezione delle merci e montaggio cappotto clatrina. Qui si descrivono le modalità di studio adattatore clatrina interazione fisica e l&#39;imaging di cellule in vivo approcci utilizzando come modello il lievito endocitico Sla1p proteina adattatore.

In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

Una delle principali vie endocitiche inizia con la formazione di vescicole rivestite di clatrina (CCV), che trasportano il carico dalla superficie cellulare agli endosomi1-6. Le CCV ...

Durante l'endocitosi mediata da clatrina, un reticolo poliedrico di clatrina è collegato a proteine o lipidi della membrana tramite proteine adattatrici leganti la clatrina come SLA1; SLA1 lega la clatrina attraverso la sua variante della "clathrin box" o VCB. In questo video, vengono utilizzati tre metodi per l'analisi delle interazioni tra clatrina e SLA1. Innanzitutto, cellule di lievito che esprimono SLA1 nativo e mutante VCB marcato con GFP vengono osservate mediante microscopia confocale a disco rotante.Vengono quindi analizzati filmati a intervalli per determinare l'effetto della mutazione sulla cinetica dell'endocitosi. In secondo luogo, vengono preparati estratti citosolici di lievito da cellule di tipo selvaggio come fonte di clatrina e vengono eseguiti saggi di precipitazione con proteina fusa G-S-T-V-C-B per esaminare l'interazione tra clatrina e VCB in vitro. In terzo luogo, vengono preparati estratti totali da cellule di lievito che esprimono forme native e mutanti di VCB.Le analisi di coimmunoprecipitazione di SLA1 vengono eseguite per esaminare l'effetto della mutazione sull'affinità del legame di SLA1 con la clatrina in vivo. In definitiva, i dati ottenuti mostrano

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e...

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Transmembrana della fibrosi cistica regolatore conduttanza (CFTR), un canale cloruro epiteliale, è stata riportata per interagire con varie proteine ​​e regolano importanti processi cellulari, tra i quali i CFTR PDZ motivo mediate da interazioni sono stati ben documentati. Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo sviluppato per assemblare un PDZ-dipendente macromolecolare CFTR segnalazione...

L&#39;analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

Un alto contenuto di metodo di screening per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni...

Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

L'oligomerizzazione del recettore della rianodina, un canale ionico omo-tetramerico che media il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, è fondamentale per la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Qui, presentiamo metodi complementari in vivo e in vitro per rilevare l'autoassociazione proteica e determinare la stechiometria omo-oligomera.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Scopri le interazioni tra adattatore Sla1p e clatrina in lievito mediante microscopia confocale a disco rotante e saggi di pull-down. Questo metodo combina imaging cellulare e analisi biochimica per studiare la cinetica dell'endocitosi mediata da clatrina.

In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

Esplora altri video