In vivo e in vitro di adattatore-clatrina Interazione

Durante l'endocitosi mediata dalla clatrina, un reticolo poliedrico di clatrina è legato alle proteine di membrana o ai lipidi tramite proteine adattatrici leganti la clatrina come SL one, SL one lega la clatrina attraverso la sua variante clathrin box o VCB. In questo video, vengono utilizzati tre metodi per l'analisi delle interazioni SLA della clatrina. Le prime cellule di lievito che esprimono mutanti nativi marcati con GFP e mutanti VCB SLA one vengono visualizzate utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

I filmati time-lapse vengono quindi analizzati per determinare l'effetto della mutazione sulla cinetica dell'endocitosi. Gli estratti citosolici di secondo lievito vengono preparati da cellule di tipo selvatico come fonte di clatrina e vengono eseguiti saggi di pull down della proteina di fusione G-S-T-V-C-B per esaminare l'interazione VCB della clatrina in vitro. In terzo luogo, gli estratti totali sono preparati da cellule di lievito che esprimono mutanti nativi e VCB.

Le precipitazioni SLA one e coun vengono eseguite per esaminare la mutazione efficace sull'affinità del legame della clatrina SLA one in vivo. In definitiva, i dati ottenuti mostrano che la mutazione del VCB ritarda l'endocitosi e che il legame di SLA 1 alla clatrina viene perso. In questi mutanti, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla dinamica dell'adattatore sferragliante nell'endocitosi.

Può anche essere applicato ad altre interazioni proteiche proteiche all'interno delle vescicole nella via secretoria. In generale, gli individui sapevano che questo metodo avrebbe avuto difficoltà perché il fotosbiancamento può eliminare il segnale fluorescente dalla minore espressione di proteine marcate da un locus endogeno. Poiché questo protocollo combina l'analisi delle immagini con studi biochimici delle interazioni fisiche, è un approccio molto potente per studiare i meccanismi che controllano l'endocitosi Per studiare le interazioni dell'adattatore della clatrina durante l'endocitosi, vengono generati ceppi di lievito che esprimono il tag GFP, versioni native e mutanti della proteina adatto-clatrina SL uno prima Un tag GFP viene aggiunto al SL uno C terminale mediante ricombinazione omologa.

Successivamente, viene generato un ceppo intermedio di lievito interrompendo il gene SLA uno in modo selettivo utilizzando un frammento contenente il gene RA 3 con specifiche sequenze fiancheggianti SL uno per rigenerare un gene funzionale per l'espressione del mutante SL uno dal locus cromosomico. L'URA tre è sostituito da un frammento SL one contenente il motivo di legame della clatrina o VCB in cui sono state incorporate mutazioni puntiformi in VCB. I ceppi di lievito risultanti vengono quindi utilizzati per l'analisi microscopica della dinamica SLA one.

Nei siti endocitici, un approccio simile viene utilizzato per introdurre la mutazione VCB in ceppi SLA uno non marcati come TVY 6 1 14, che sono adatti per esperimenti biochimici. Inizia coltivando il ceppo di lievito SLA one GFP e il ceppo mutante SLA uno SLA uno A-A-A-G-F-P in quattro millilitri di terreno SD integrato a 30 gradi Celsius in un rotatore al buio. Una volta che il lievito raggiunge un OD 600 da 0,1 a 0,4, trasferire un millilitro di ciascuna coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 4.000 G per un minuto a temperatura ambiente dopo la centrifuga, scartare circa 950 microlitri di cellule di risospensione natante SUP nel liquido rimanente, che dovrebbe essere di circa 50 microlitri. Depositare tre microlitri della sospensione cellulare su un vetrino per microscopia e coprirlo con un vetrino coprioggetti.

Proteggere il campione dalla luce su un disco rotante al microscopio focale. Montare la slitta su un obiettivo a immersione in olio 100 x. Individuare il piano focale corretto utilizzando l'illuminazione a campo chiaro o un laser a 488 nanometri con filtri appropriati per eccitare e rilevare la GFP, acquisire immagini time-lapse di SLA, GFP e SLA, A-A-G-F-P in celle con un tempo di esposizione di 500 millisecondi a un intervallo di un'immagine al secondo per 150 secondi.

Punte marcate con GFP appariranno sulla superficie interna della membrana plasmatica. Persistere per alcuni secondi e spostarsi verso il centro della cella poiché il segnale scompare rapidamente indicando lo smontaggio del rivestimento. Utilizzando il software, selezionare una parte di un'immagine time-lapse di un SLA di tipo selvaggio una GFP in cui si vedono apparire delle macchie.

Rimani per alcuni secondi e sparisci. Ritaglia questa sezione dell'immagine per ogni fotogramma delle immagini time-lapse. Successivamente, utilizzare il software per generare un grafico del segnale acustico che rappresenta questa sezione in ogni fotogramma dell'immagine time lapse 152 allineando i fotogrammi lungo un asse corrispondente al tempo trascorso qui, questo è dimostrato utilizzando Adobe Photoshop.

Calcola il tempo di permanenza di ogni punto contando manualmente il numero di fotogrammi time lapse in cui è presente. Nel grafico del segnale acustico, registra i risultati in un foglio di calcolo. Si noti che ogni punto dovrebbe curvarsi verso l'interno della cella mentre sta scomparendo.

Endocitosi riflettente e smontaggio del mantello. Analizzare cinque punti per cella per circa 40 cellule. Quindi ripetere questo processo con SLA one A-A-A-G-F-P per ottenere estratti citosolici di lievito da utilizzare nei saggi di affinità proteica GST.

Inizia preparando tre litri del ceppo di lievito appropriato secondo le istruzioni nel testo allegato. Risospendere il pellet in tre-cinque millilitri di acqua sterile e pet su e giù fino a quando il pellet non è completamente risospeso. Successivamente, versare circa 150 millilitri di azoto liquido in un becher di plastica da 250 millilitri. Flash.

Congelare il lievito aggiungendolo goccia a goccia nell'azoto liquido in uno schema circolare. Per evitare la formazione di grumi, non lasciare che il pellet si scongeli, aggiungere altro azoto liquido Se necessario, versare l'azoto liquido in un contenitore del frullatore in acciaio inossidabile per raffreddarlo. Lasciare evaporare quasi completamente l'azoto liquido.

Quindi aggiungere i pellet di lievito congelati. Chiudere il frullatore con un tappo di gomma freddo e macinare i pellet di lievito per 10 secondi. Capovolgere tre o quattro volte per mescolare il contenuto e ripetere la fase di macinatura due volte il macinato.

Il lievito congelato avrà un aspetto simile alla polvere dell'imbuto del refrigeratore con un tubo conico da 50 millilitri con azoto liquido. Utilizzando l'imbuto freddo, trasferire il lievito macinato nel tubo. Il lievito macinato congelato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente.

Per ottenere un estratto citosolico, pesare tre grammi di lievito macinato congelato TV Y 6 1 4 in una provetta conica da 15 millilitri e sospendere in tre millilitri a temperatura ambiente. Tamponare un tappo da cocktail contenente inibitore della proteasi e capovolgere la provetta più volte fino a quando il contenuto non è completamente scongelato. Mettilo sul ghiaccio.

Ultracentrifugare l'estratto a quattro gradi Celsius per 20 minuti a 300.000 G.Dopo la centrifuga, utilizzare il perpet per trasferire con cura l'estratto di supinato o citosolico in un tubo conico su ghiaccio. Tagliare l'estremità di una punta da 200 microlitri, quindi utilizzarla per aggiungere all'estratto citosolico 100 microlitri di un impasto di glutatione sphero al 50% nel tampone A. Posizionare la provetta su un rotatore a quattro gradi Celsius dopo che il campione ha ruotato per 15 minuti.

Centrifugare le perle mediante centrifugazione a quattro gradi Celsius per due minuti A 1000 G.Trasferire lo snat, che è l'estratto citosolico, in una provetta fresca riserva di 50 microlitri per il campione di controllo in ingresso. A questo punto non è consigliabile il congelamento. Tenete sempre l'estratto in ghiaccio e continuate con l'esperimento.

Per eseguire i saggi di affinità delle proteine di fusione GST, aggiungere un millilitro di PBS 30 microlitri di un impasto di Sphero al 50% di glutatione nel tampone A e 50 microgrammi di G-S-T-G-S-T-V-C-B dializzato o G-S-T-V-C-B mutante alle provette fuge marcate. Ruotare la temperatura ambiente per 30 minuti per consentire la legatura. Lavare le perle due volte con PBS e una volta con tampone a centrifuga.

10 secondi a 5.000 g dopo ogni lavaggio, quindi aggiungere un millilitro di estratto citosolico di lievito. Posizionare la provetta su un rotatore a quattro gradi Celsius dopo che il campione ha ruotato per un'ora. Centrifugare le perle mediante centrifugazione a quattro gradi Celsius per 10 secondi A 5.000 G.Lavare le perle tre volte con il tampone A contenente lo 0,1% di tritton X 101 volte con il tampone A dopo ogni lavaggio, centrifugare a quattro gradi Celsius per 10 secondi.

A 5.000 g dopo l'ultima centrifuga. Utilizzare la punta di caricamento del gel per rimuovere quanto più liquido possibile. A questo punto, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius.

Per continuare in un secondo momento, aggiungere 15 millilitri di tampone campione di fecca di agnello due volte a ciascuna provetta. Posizionare i campioni su un blocco termico e incubare a 96 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi centrifugare i campioni per 10 secondi a 5.000 G per portare il campione sul fondo della provetta.

Analizzare i campioni mediante immuno blotting utilizzando un anticorpo contro la catena pesante della clatrina per ottenere estratti cellulari totali per esperimenti di coprecipitazione. Preparare campioni di lievito macinato congelati come prima di questa volta utilizzando il ceppo TVY six 14 che esprime SL di tipo selvatico uno, il ceppo SL one A A a un ceppo che porta una mutazione L-L-D-L-Q a A-A-A-L-Q in TY 6 14. Background e un ceppo SL one delta che porta una delezione del gene SL one come GPY 3 1 3 0 way.

Due grammi di lievito macinato congelato in tubi conici e reus. Sospenderli in due millilitri di tampone a temperatura ambiente contenente un cocktail di inibitori della proteasi e un tappo al 2% di tritone X 100 e capovolgere la provetta più volte fino a quando non è completamente scongelata e quindi incubare su ghiaccio per 10 minuti. Mescolando periodicamente per inversione.

Trasferire il materiale in provette da microcentrifuga e centrifugare a quattro gradi Celsius per 15 minuti a 16.000. G con cautela senza disturbare il pellet. Trasferire il sup, il natante o l'estratto di cellule totali in un tubo conico con ghiaccio.

Utilizzando una pipetta aggiungere 100 microlitri di una proteina al 50%, un impasto di sphero in tampone, e ruotare a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi centrifugare le perle per centrifugazione a quattro gradi Celsius per due minuti a 1000 G e trasferire il surnatante S in una provetta nuova. Riserva 50 microlitri di estratto per il controllo dell'input Per eseguire saggi di coimmunoprecipitazione.

Aggiungere un millilitro di PBS 30 microlitri di una proteina al 50%. Un liquame sphero nel tampone A e due microgrammi di un coniglio anti sla. Un anticorpo per provette da microcentrifuga marcate.

Ruotare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le perline due volte con PBS e una volta con tampone. A contenente l'1% di trittone X 100.

Aggiungere un millilitro di estratti di lievito totali. SLA uno, SLA uno A A A e SLA un delta. Ruotare per un'ora a quattro gradi Celsius.

Girare per 10 secondi a 5.000 G per pellettare le perline dopo la rotazione. Scartare il natante SUP e lavare rapidamente le perle tre volte con il tampone A contenente lo 0,1% di Tritan X 101 volte con il tampone. Centrifugare le perline ancora una volta e utilizzando una punta di caricamento in gel, rimuovere quanto più liquido possibile.

A questo punto, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Per continuare in un secondo momento, aggiungere 15 microlitri di tampone per campioni due volte laly in ciascuna provetta. Incubare a 96 gradi Celsius per cinque minuti e centrifugare per 10 secondi a 5.000 G.Analizzare i campioni mediante immunoblotting utilizzando un anticorpo contro la catena pesante della clatrina. Qui.

I risultati dell'imaging di cellule vive di SL wild type e mutante sono confrontati a sinistra. Una singola cellula di lievito è mostrata con SLA una regioni endocitiche positive alla periferia della cellula mostrate in verde. L'area tra le linee bianche corrisponde alla regione da cui sono stati generati i kraft mostrati sul luminoso.

Si noti che i siti endocitici nel mutante persistono significativamente più a lungo, circa 80 secondi rispetto al tipo selvatico, circa 30 secondi indicando un difetto nella formazione del mantello. L'interazione fisica tra la clatrina e la scatola della clatrina variante sla one è stata valutata mediante GST Fusion Protein. Saggi di affinità, GST fusi a SLA un frammento da AA 7 98 a 8 1 3 contenente la sequenza L-L-D-L-Q.

Il corrispondente mutante A-A-A-L-Q o GST da solo è stato legato al glutatione, alle perle di siero, e incubato con un estratto citosolico da cellule di lievito di tipo selvatico. Le proteine associate sono state alluse e analizzate mediante immuno blotting per la catena pesante della clatrina, come si vede qui. La clatrina lega il G-S-T-V-C-B per non GST o al mutante G-S-T-V-C-B, suggerendo che è necessaria una scatola di clatrina variante intatta per il legame SLA uno alla clatrina.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante lavorare sempre vicino alla fiamma per evitare la contaminazione delle colture GS Seguendo questa procedura. Il tagging di altre proteine fluorescenti come RFP può essere eseguito per esaminare la colocalizzazione di diverse proteine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare le interazioni proteico-proteiche utilizzando tecniche di imaging cellulare biochimico e fluorescente.