Name: Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri la mutagenesi sito-specifica in cellule di zanzara Anopheles mediante oligonucleotidi LNA modificati. Questo metodo consente la sostituzione precisa di singoli nucleotidi per studiare la funzione genica nei vettori di malattie.

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Vorremmo ringraziare Abbie Spinner presso il Centro nazionale di ricerca sui primati della California per la sua assistenza con citometria a flusso. Questo studio è stato sostenuto da un finanziamento dell&#39;Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID) dei National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 e AI078183.

<ol><li> Prima di iniziare il protocollo, è importante stabilire che le cellule zanzara usati nell'esperimento sono sani e alla confluenza ~ 80% se aderente (Figura 1). Cellule ricoperte o insalubri si tradurrà in bassa efficienza di trasfezione e daranno risultati inconsistenti. </li><li> Scaldare tutti i media prima di utilizzare in un bagno d'acqua ° 28 C per 30 minuti. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 cellule richiedono E5 medio: MEM, Earle w / glutammina, 5% FCS inattivato con il calore, lo 0,2% di D-glucosio, 1% di penicillina-streptomicina antibiotico, e 1% di aminoacidi non essenziali. </li><li> A. gambiae cellule SUA5B richiedono S2 medio: Schneider Drosophila medium, 5% FCS inattivato con il calore, e 1% di penicillina-streptomicina antibiotico </li></ol></li><li> Scongelare e conservare tutti i materiali reagenti di trasfezione, plasmidi e oligonucleotidi su ghiaccio. </li><li> Tutte le procedure devono essere effettuate in una cappa di coltura di tessuti con tecnica sterile. </li><li> Per le cellule aderenti (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirare fuori i vecchi media senza disturbare le cellule, aggiungere un volume equivalente di mezzi freschi che è stato riscaldato a 28 ° C, e poi risciacquare le cellule dal fondo della beuta con una pipetta. </li><li> La concentrazione di cellule deve essere determinata e regolata per una concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. Le celle possono essere conservati a temperatura ambiente durante la preparazione di materiali reagenti di trasfezione. </li><li> Aggiungere 1 ml di cellule di zanzara (1x10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto di un 6-pozzetti. Impostare un piatto per ogni condizione sperimentale (vedi sotto). Tabella I è un sistema di pipettaggio per una trasfezione generale. Tabella II illustra cinque condizioni per testare la mutagenesi di successo di un singolo nucleotide con BFP specifici LNA-ons. I primi due, pGFP e pBFP, sono controlli positivi e negativi, rispettivamente. I restanti sono le condizioni sperimentali di pBFPs con concentrazioni crescenti di BFP specifici LNA-ons. In passaggi da 8 a 12, aggiungere volumi adeguati di conseguenza per ogni reagente condizione. </li><li> Trasferimento di DNA plasmidico ad un tubo sterile 1,5 ml microcentrifuga e aggiungere volume adeguato di tampone CE. <ol class="lalpha"><li> Per 1 microlitri di DNA plasmidico (1 mg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE. </li><li> Per 1 pGFP microlitri (1μg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE. </li><li> Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL), aggiungere 99 ml di tampone CE. </li><li> Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 1 ml ON (mg / mL), aggiungere 98 ml di tampone CE. </li><li> Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 5 microlitri ON (1μg / mL), aggiungere 94 ml di tampone CE. </li><li> Per 1 pBFP microlitri (1μg / mL) e 10 L ON (1μg / mL), aggiungere 89 ml di tampone CE. </li></ol></li><li> Poi aggiungere lentamente Enhancer per 1 mg di DNA utilizzato. <ol class="lalpha"><li> Per 1 microlitri di DNA plasmidico, aggiungere 8 microlitri Enhancer. </li><li> Per 1 pGFP microlitri, aggiungere 8 microlitri Enhancer. </li><li> Per 1 pBFP microlitri, aggiungere 8 microlitri Enhancer. </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, aggiungere 16 microlitri Enhancer. </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 48 microlitri Enhancer. </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere 88 microlitri Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex DNA / buffer / Enhancer miscela per 1 sec e assicurarsi che tutta la soluzione è nella parte inferiore del tubo. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere il reagente Effectene per 1 mg di DNA plasmidico e vortex per 10 sec. Verificare che tutta la soluzione è in fondo del tubo e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min. <ol class="lalpha"><li> Per 1 microlitri di DNA plasmidico, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella I). </li><li> Per 1 pGFP microlitri, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri, Effectene aggiungere 10 microlitri (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, Effectene aggiungere 20 microlitri (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 60 microlitri Effectene (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere 110 microlitri Effectene (Tabella II). </li></ol></li><li> Portare ogni tubo ad un volume finale di 1000 ml con l'aggiunta dei media riscaldato goccia a goccia al DNA / buffer / Enhancer / Effectene miscela. DNA può precipitare a questo punto se il supporto è aggiunto troppo velocemente. Mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte. <ol class="lalpha"><li> Per 1 microlitri di DNA plasmidico, aggiungere contenuti multimediali 882 microlitri (Tabella I). </li><li> Per 1 pGFP microlitri, aggiungere contenuti multimediali microlitri 882 (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri, aggiungere contenuti multimediali microlitri 882 (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 1 ml ON, aggiungere 864 microlitri dei media (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 5 microlitri ON, aggiungere 792 microlitri dei media (Tabella II). </li><li> Per 1 pBFP microlitri e 10 L su ON, aggiungere contenuti multimediali 702 microlitri (Tabella II). </li></ol></li><li> Prossimo aggiungere lentamente 1 mL di DNA appropriato / Enhancer / Effectene miscela in ciascun pozzetto una goccia alla volta. </li><li> Agitare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e la miscela di trasfezione. Incubatcellule e in normali condizioni colturali. </li><li> Un giorno dopo la transfezione, delicatamente aspirato fuori media e lentamente sostituire con un volume equivalente di media appena riscaldato. E 'importante non disturbare gli strati di cellule al fondo dei pozzetti durante questa operazione. </li><li> Due giorni dopo la transfezione esaminare le cellule di controllo positivo transfettate con pGFP al microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasfezione (Figura 2). </li><li> SUA5B cellule crescono molto rapidamente e sarà invaso. Quattro giorni dopo la transfezione sottile queste cellule aspirando i vecchi media e aggiungendo lentamente un volume equivalente di media appena riscaldato. </li><li> Dopo l'aggiunta di nuovi media per i pozzi, staccare tutte le cellule dal fondo di ogni bene pipeting su e giù, scartare la metà del volume (1 mL) della miscela di cellule e aggiungere 1 ml di fresca mezzi riscaldato per portare il volume finale a 2 mL. </li><li> Controllare le cellule al giorno per assicurarsi che siano sani e non troppo lunghi, sottili, se necessario. </li><li> Permettono alle cellule di crescere in condizioni normali per 5-7 dopo trasfezione giorni prima della loro raccolta per l'analisi. </li><li> Alle 06:55 dopo trasfezione giorni, raccogliere le cellule aspirando i vecchi media in tutti i pozzi e l'aggiunta di 1 ml di PBS sterile a temperatura ambiente in ogni pozzetto. </li><li> Staccare le cellule dal fondo del pozzo pipettando su e giù e il trasferimento miscela di cellule a 5 tubi ml tappo a scatto e subito analizzare le cellule mediante citometria a flusso. </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Untransfected A. sano stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B), le cellule a circa 80% confluenza. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) e A. gambiae SUA5B (B) cellule trasfettate con GFP controllo positivo che esprime plasmide. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Citometria a flusso di dati a conferma di conversione di BFP per GFP attraverso mutagenesi di un singolo nucleotide dopo trasfezione con BFP specifici bloccati acido nucleico modificati oligonucleotidi (LNA-ons). SUA5B cellule sono state transfettate con un plasmide che esprime GFP (pGFP) come controllo positivo, con un plasmide che esprime BFP (pBFP) come controllo negativo, o con pBFP e concentrazioni crescenti di BFP specifici LNA-ons. (A) strategia di gating per i dati di citometria a flusso che mostrano da sinistra a destra: scatter in avanti rispetto a lato di cellule vive, propidio ioduro (PI), le cellule negative, e le cellule GFP positive cinque giorni dopo la transfezione. (B) Grafico della percentuale di cellule GFP positive mostrato in (A) dopo trasfezione con pBFP e concentrazioni crescenti di LNA-ons. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella I. Transfection condizioni. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabella 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 2"> Tabella II. Condizioni Transfection utilizzato nella Figura 1.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+SNPs+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotyping SNPs with molecular beacons.</a> Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui vi presentiamo un metodo in vitro e prove per la conversione mirata di un singolo nucleotide in un gene bersaglio episomiale dopo la transfezione di LNA-ons in A. stephensi e A. gambiae cellule. LNA-ON-mediata conversione genica richiede l&#39;induzione di un sito specifico per la risposta di riparazione del DNA, i nostri dati indicano che le cellule di zanzare in grado di supportare questo meccanismo di mutagenesi sito-specifici. Mentre il metodo qui presentato è basato sulla conversione ...

<table><tbody><tr><td>Reagente per trasfezione Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide controllo GFP (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide BFP (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>In dono dal Dott. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs </td><td></td><td></td><td>In dono dal Dott. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s con glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Serum fetale bovino (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; di Schneider&amp;rsquo;s</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio al 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

trasfezione e mutagenesi di geni bersaglio in cellule mosquito da locked nucleic acid modificati oligonucleotidi

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Parassiti Plasmodium, l&#39;agente eziologico della malaria, sono trasmessi attraverso la puntura di zanzare anofele con conseguente oltre 250 milioni di nuove infezioni ogni anno. Nonostante decenni di ricerca, non esiste ancora un vaccino contro la malaria, evidenziando la necessità di strategie di controllo romanzo. Un approccio innovativo è l&#39;uso di zanzare geneticamente modificati per il controllo dei parassiti in modo efficace la trasmissione della malaria. Alterazioni deliberate delle vie di segnalazione cellulare nella zanzara, tramite mutagenesi mirata, sono stati trovati a regolare parassita sviluppo 1. Da questi studi, possiamo cominciare a identificare gli obiettivi gene potenziale di trasformazione. Mutagenesi mirata è tradizionalmente invocata la ricombinazione omologa tra un gene target e una molecola di DNA di grandi dimensioni. Tuttavia, la costruzione e l&#39;uso di tali molecole di DNA complesse per la generazione di linee cellulari stabilmente trasformate è costoso, richiede tempo e spesso inefficiente. Pertanto, utilizzando una strategia chiuso acido nucleico modificati oligonucleotidi (LNA-ons) fornisce una valida alternativa per l&#39;introduzione artificiale sostituzioni di singoli nucleotidi in obiettivi DNA episomiale e cromosomiche gene (recensione in 2). LNA-ON-mediata mutagenesi previsioni è stato utilizzato per introdurre mutazioni puntiformi nei geni di interesse in cellule in coltura sia di lieviti e topi 3,4. Mostriamo qui che LNA-on può essere utilizzato per introdurre un cambiamento singolo nucleotide in un obiettivo transfettate episomiale che si traduce in un passaggio dal blu proteina fluorescente (BFP) espressione di proteina fluorescente verde (GFP) espressione in entrambe le Anopheles gambiae e Anopheles cellule stephensi . Questa conversione dimostra per la prima volta che la mutagenesi efficace di geni bersaglio in cellule di zanzara può essere mediata da LNA-on e suggerisce che questa tecnica può essere applicabile a mutagenesi di obiettivi cromosomiche in vitro e in vivo.

Oligonucleotidi possono essere utilizzati per il sito specifico sostituire un singolo nucleotide dei geni bersaglio transfettate in entrambe le<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; E<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Cellule.

Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi

I parassiti del genere Plasmodium, agenti eziologici della malaria, vengono trasmessi attraverso le punture di zanzare Anopheles infette, causando oltre 250 milioni di nuovi...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una nuova strategia di mutagenesi mirata in cellule di zanzara anomale. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando cellule coltivate sane per la trasfezione. Successivamente, le cellule vengono trasfettate con i DNA di controllo e di prova appropriati mediante l'aggiunta di reagenti per la trasfezione.Il passaggio successivo della procedura consiste nel monitorare le cellule di controllo per la fluorescenza e nel ridurre la densità delle cellule sperimentali. Infine, le frequenze di conversione genica possono essere determinate nelle cellule sperimentali mediante citometria a flusso a cinque-sette giorni dal transfezionamento. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano una mutagenesi direzionata in un bersaglio genico episomale attraverso la riparazione del DNA indotta da oligonucleotidi di acido nucleico bloccato.Ciao, sono la dottoressa Nazy Pacor del laboratorio della dottoressa Shirley Lockhart del Dipartimento di Microbiologia Medica e Immunologia dell'Università della California di Davis. Oggi vi mostreremo un nuovo metodo per la mutagenesi mirata di cellule di zanzare anomale. Utilizziamo questo metodo per studiare la funzione dei geni della risposta immunitaria innata delle zanzare mediante mutagenesi mirata.Iniziamo. Prima di iniziare il protocollo, procurarsi cellule di zanzara sane e con una confluenza di circa l'80%. Se le cellule sono aderenti, troppo cresciute o non sane, si otterrà un'efficienza di trasfezione bassa e risultati non riproducibili.Questo protocollo viene dimostrato utilizzando cellule B Ananais Gambier SUA five. Tuttavia, possono essere utilizzate anche cellule Ananais ensi MS Q4 three. Iniziare l'allestimento della trasfezione riscaldando il mezzo S due in un bagno d'acqua a 28 gradi Celsius per 30 minuti.Tutti i materiali del reagente per la trasfezione, il plasmide e gli oligonucleotidi vanno tenuti sul ghiaccio. Utilizzando una tecnica sterile all'interno di una cappa per colture cellulari, aspirare il vecchio mezzo senza disturbare le cellule e sostituirlo con un volume equivalente di mezzo fresco preriscaldato, quindi risciacquare le cellule dal fondo della fiala. Utilizzando una pipetta, la concentrazione delle cellule deve essere quindi determinata e aggiustata a una concentrazione finale di 1 × 10⁶ cellule per millilitro.Dopo aver aggiustato la concentrazione finale, aggiungere un millilitro di cellule di zanzara in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Mentre le piastre con le cellule possono essere mantenute a temperatura ambiente durante la preparazione dei reagenti per la trasfezione, trasferire il DNA plasmidico per la trasfezione in provette sterili per microcentrifuga. Qui, un plasmide che esprime la proteina fluorescente verde viene utilizzato come controllo positivo, mentre un plasmide che esprime la proteina fluorescente blu viene utilizzato come controllo negativo.Il DNA di prova include anche il plasmide che esprime la BFP, ma con concentrazioni crescenti di acido nucleico bloccato (LNA) specifico per la BFP, oligonucleotidi modificati o LNA os. Dopo aver aliquotato il DNA, aggiungere 99 microlitri di kage e tampone EC per ogni microgrammo di DNA plasmidico e di L-N-A-O-N. Quindi aggiungere lentamente otto microlitri di enhancer per ogni microgrammo di DNA utilizzato, quindi vortexare la miscela di DNA, tampone ed enhancer.Per un secondo, centrifugare brevemente la soluzione e incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti; aggiungere 10 microlitri di reagente attivatore per ogni microgrammo di DNA plasmidico e vortexare per 10 secondi. Centrifugare brevemente la soluzione sul fondo delle provette, quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, portare il volume finale di ogni provetta a 1000 microlitri aggiungendo lentamente il mezzo fresco riscaldato alla miscela di DNA con buffer potenziatore. A questo punto il DNA potrebbe precipitare se il mezzo viene aggiunto troppo rapidamente; mescolare delicatamente mediante pipettaggio su e giù per tre o quattro volte.Infine, aggiungere lentamente un millilitro della miscela appropriata di potenziatore del DNA a ciascun pozzetto contenente cellule, una goccia alla volta. Ruotare delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e della miscela di transfezione.Incubare le cellule in condizioni normali di crescita un giorno dopo la trasfezione, aspirare delicatamente il mezzo dalle cellule e sostituirlo lentamente con un volume equivalente di mezzo fresco preriscaldato. Avere cura di non disturbare gli strati cellulari sul fondo delle pozzette. Due giorni dopo la trasfezione, esaminare le cellule di controllo positivo trasfettate con un plasmide esprimente GFP al microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasfezione.Quattro giorni dopo la trasfezione s uua, le cinque cellule B devono essere diluite poiché crescono molto rapidamente e potrebbero diventare sovraconfluenti. Per fare ciò, aspirare il vecchio terreno dalle cellule e aggiungere lentamente un volume equivalente di terreno fresco preriscaldato. Dopo aver aggiunto il nuovo terreno nei pozzetti, staccare tutte le cellule dal fondo di ciascun pozzetto pipettando su e giù, scartare metà del volume della sospensione cellulare e aggiungere un millilitro di terreno fresco preriscaldato per portare il volume finale a due millilitri.Controllare le cellule ogni giorno per assicurarsi che siano sane e non sovraffollate, diradandole se necessario. Lasciare crescere le cellule in condizioni normali per cinque o sette giorni dopo la trasfezione prima di raccoglierle per l'analisi.A cinque a sette giorni dopo la trasfezione, raccogliere le cellule aspirando il vecchio mezzo e aggiungendo un millilitro di PBS sterile a temperatura ambiente a ciascun pozzetto. Staccare le cellule dal fondo di ogni pozzetto aspirando e dispensando ripetutamente con una pipetta. Infine, trasferire la sospensione cellulare in provette da cinque millilitri con tappo a scatto e analizzare immediatamente le cellule mediante citometria a flusso.Un occhio difensivo. Le cellule MS Q4 tre e un gambiere UA cinque B sono state trasfettate con un plasmide positivo controllo GFP che esprime GFP. Le cellule sono mostrate in microscopia ottica e fluorescente e come immagine emergente, i dati di citometria a flusso confermano la conversione di BFP in GFP tramite mutagenesi di un singolo nucleotide dopo la trasfezione con LNAO ns specifico per BFP. Le cellule UA cinque B BFP sono state trasfettate con il plasmide esprimente GFP come controllo positivo, con un plasmide esprimente BFP come controllo negativo o con il plasmide esprimente BFP e concentrazioni crescenti di LNAO ns specifico per BFP.La strategia di gating per i dati di citometria a flusso mostra lo scatter anteriore rispetto a quello laterale delle cellule vitali, delle cellule negative per l'ioduro di propidio e delle cellule positive per GFP a cinque giorni dal transfezionamento; la percentuale di cellule positive per GFP dopo il transfezionamento con un plasmide esprimente BFP e concentrazioni crescenti di LNAO NS è visibile qui in forma grafica, confermando la conversione di BFP in GFP da parte di L aos. Vi abbiamo appena mostrato una nuova procedura per la mutagenesi sito-diretta di anomalie in cellule di zanzara. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di verificare che le cellule siano sane e alla densità corretta prima del transfezionamento.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Segnaliamo che utilizzando un'artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l'infezione larvale.

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Il sistema bipartito GAL4-UAS è uno strumento versatile per la modifica dell'espressione genica in modo spaziotemporale controllato che consente l'analisi genetica funzionale in Anopheles gambiae. Le procedure descritte per l'utilizzo di questo sistema sono una strategia di clonazione semi-standardizzata, sexing e screening delle pupe per marcatori proteici fluorescenti e fissazione dell'embrione.

Utilizzo del sistema GAL4-UAS per la genetica funzionale in Anopheles gambiae

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

I protocolli qui riportati illustrano tre modi alternativi per valutare le prestazioni delle zanzare geneticamente modificate destinate al controllo dei vettori in studi in piccole gabbie contenute in laboratorio. Ogni protocollo è adattato alla modifica specifica che il ceppo di zanzara porta (gene drive o non gene drive) e ai tipi di parametri misurati.

Prove di laboratorio su piccole gabbie di zanzare anofelino geneticamente modificate

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per la rapida identificazione degli indel indotti da CRISPR / Cas9 e la selezione delle linee mutanti nella zanzara Aedes aegypti utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione.

Rilevamento Indel a seguito della mutagenesi CRISPR/Cas9 mediante analisi della fusione ad alta risoluzione nell'aegittito di Mosquito Aedes

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

Somministrazione efficace di interferenza orale dell'RNA (RNAi) alle zanzare Anopheles gambiae adulte

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Scopri la mutagenesi sito-specifica in cellule di zanzara Anopheles mediante oligonucleotidi LNA modificati. Questo metodo consente la sostituzione precisa di singoli nucleotidi per studiare la funzione genica nei vettori di malattie.

Trasfezione e Mutagenesi di geni bersaglio in cellule Mosquito da Locked Nucleic Acid modificati Oligonucleotidi

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