Peptidi dalla libreria phage display modulare l'espressione genica nelle cellule mesenchimali e potenziare Osteogenesi in difetti ossei Unicortical

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare le sequenze che potenziano la differenziazione delle cellule mesenchimali e promuovono la riparazione ossea. Il primo passo consiste nell'isolare mediante biopanning il fago che si lega all'osso. Procedere quindi all'identificazione delle sequenze peptidiche che si legano alle cellule mesenchimali e alla determinazione dei successivi cambiamenti nell'espressione genica.

Effettuare esperimenti per determinare in che modo le sequenze peptidiche possono essere veicolate nell'osso a scopi rigenerativi. Come passaggio finale, esaminare istologicamente la riparazione ossea; considerati insieme, i risultati possono fornire informazioni importanti sui meccanismi di differenziazione cellulare in vitro e sulla riparazione ossea in vivo. I vantaggi dell'utilizzo della tecnica di biopanning con una libreria di phage display sono che siamo stati in grado di identificare peptidi che bersagliano l'osso e che possono essere utilizzati per stimolare la differenziazione delle cellule mesenchimali e potenziare la riparazione ossea.

In definitiva, queste sequenze peptidiche potrebbero rivelarsi utili in modalità terapeutiche per la riparazione ossea e per il trattamento della perdita ossea, come nell'osteopenia e nell'osteoporosi. Sulla base di uno studio in cui ULA e Pascal hanno dimostrato che il biopanning può essere utilizzato per isolare sequenze peptidiche che bersagliano i vasi sanguigni, abbiamo deciso di adattare questo metodo per indagare i meccanismi nell'osso. Per la procedura di biopanning in vivo, sono state perfuse 10 volte 10 alla 10a unità formanti placca della libreria di esposizione peptidica N-E-B-P-H-D 12 attraverso il cuore di un topo valve C di 10 settimane di età.

Dopo circa cinque minuti, eutanasia il topo, esponi ed disseca i femori, taglia le estremità e rimuovi il midollo osseo. Risciacqua il femore sinistro sia all'interno che all'esterno con PBS per 10 volte. Quindi aggiungi l'osso ai batteri ER 2 5 3 7.

Per rimuovere il fago non legato, utilizzare il 2% di latte scremato in polvere in una siringa con ago da 21 gauge per risciacquare il canale intermedio del femore destro per 10 volte. Ora eluire il fago legato dal canale intermedio con tampone di glicina acido cloridrico a pH 2,2, neutralizzato con una mole di tris.

Per amplificare il fago, aggiungere EIT ai batteri ER 2 5 3 7 e coltivare per 4,5 ore. Trasferire con attenzione i soprannatanti in provette fresche e precipitare il fago tre volte mediante l'aggiunta di polietilene glicole. Soluzione di cloruro di sodio, incubare le provette tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Infine, risospendere il pellet in TBS con azide di sodio 0,02%. Piastrare il fago su piastre per determinare le unità formanti placche degli EIT amplificati. Ripetere la procedura di bio-panning in vivo sia per il fago eluito che per quello non eluito per quattro volte.

Amplificare il fago in colture batteriche. Purificare e quantificare la sequenza di DNA, il DNA finale del fago, utilizzando il primer 98 fornito con il kit di phage display. È importante calcolare la frequenza di rappresentazione della sequenza di DNA del fago.

Ora sintetizzare peptidi che incorporano una sequenza di tre glicine seguita da lisina come innesco e amplificare le cellule D1, una linea cellulare clonata di cellule stromali midollari multipotenti del topo sviluppata nel nostro laboratorio al 90% di confluenza. Usare la tripsina sulle cellule, centrifugare per ottenere il pellet e contare le cellule per la colorazione peptidica; piastrare le cellule su vetrini con camere rivestite di gelatina e coltivare per 24 ore.

Lavare le cellule con PBS e fissarle con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Eseguire ora incubazioni di bloccaggio con glicina, seguite da Aden BSA e BBSA. Soluzioni di bloccaggio per la biotina.

Aggiungere 100 micromolar di peptidi biotinilati L sette e R uno. Procedere con il lavaggio delle cellule per tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Aggiungere una diluizione uno a 1000 del rivestimento LOR strippin, coprire con pellicola e incubare in un cassetto al buio per 30 minuti.

Lavare le cellule e montare i coprioggetti con il mezzo di montaggio Vector Shield. Analizzare quindi i preparati al microscopio fluorescente 24 ore prima dell'intervento chirurgico. Immergere i cilindri di schiuma gelatinosa.

Trasferire i cilindri di schiuma gel contenenti il peptide a 20 micromolari, sia L sette che R uno, oppure tampone PBS senza peptide, in piatti da coltura sterili a 12 pozzetti e refrigerare tutta la notte a quattro gradi Celsius al momento dell'intervento chirurgico. Mantenere il composito di schiuma gel sul ghiaccio fino all'uso.

Utilizzando un trapano pneumatico con irrigazione salina, creare un ampio difetto monocorticale oblungo di tre millimetri di larghezza per otto millimetri di lunghezza. Trattare il difetto osseo con schiume gel preparate inserendo tutti gli scaffold impiantati mediante leggeri colpetti. Eutanasia i ratti e raccogliere le tibie in tempi definiti, controllando attentamente la presenza del difetto osseo e fissando le tibie raccolte in formalina neutra tamponata al 10% per la sezione in paraffina.

Infine, colorare tutti i preparati istologici con ematossilina-eosina per evidenziare la matrice osteoide. L'adenina marcata con isotiocianato di fluoresceina consente la rilevazione al microscopio dell'associazione di peptidi su cellule coltivate in vitro. In questo caso, i peptidi si legano alle cellule mesenchimali in coltura per determinare l'effetto osteogenico dei peptidi sulle cellule.

I mesenchimi in coltura possono essere trattati con peptidi sperimentali per determinare le variazioni nella morfologia cellulare. Ad esempio, al quarto giorno le cellule iniziano ad aggregarsi e gli aggregati aumentano di dimensioni nel tempo formando noduli. Curiosamente, la sezione ossea colorata con ematossilina ed eosina mostra autofluorescenza sotto luce UV.

Questo maggiore contrasto tra tessuto osseo e tessuti non ossei facilita le analisi per quantificare la presenza di osso nelle sezioni al fine di determinare la riparazione ossea nei difetti trattati con gelfoam più peptide. Rispetto al gelfoam da solo, in questo caso i difetti riempiti con il peptide hanno mostrato la maggiore quantità di riparazione corticale nel tempo. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale essere estremamente metodici nell'inserimento dei dati a causa del gran numero di campioni che inevitabilmente si accumuleranno nel tempo, fino a quando non si sarà selezionato il gruppo finale di peptidi.

Lo sviluppo del biopanning in vivo come tecnica per identificare peptidi che bersagliano l'osso ha portato a potenziali farmaci utilizzabili come terapia per la riparazione ossea e per la perdita ossea. Uno dei meccanismi alla base della riparazione ossea è coinvolto anche nella perdita ossea. Comprendere questi meccanismi in modo più dettagliato e disporre di strumenti che potrebbero essere utilizzati per il trattamento di disturbi come fratture ritardate e osteoporosi contribuirà a migliorare le terapie che possono essere ideate per l'assistenza sanitaria.