Peptidi dalla libreria phage display modulare l'espressione genica nelle cellule mesenchimali e potenziare Osteogenesi in difetti ossei Unicortical

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare sequenze che potenziano la differenziazione delle cellule mesenchimali e promuovono la riparazione ossea. Il passo iniziale consiste nell'isolare mediante biop panning il fago che si lega all'osso. Procedere all'identificazione delle sequenze peptidiche che si legano alle cellule mesenchimali e determinare anche i successivi cambiamenti nell'espressione genica.

Eseguire esperimenti per determinare come le sequenze peptidiche possono essere consegnate all'osso per scopi rigenerativi. Come passo finale, esaminare istologicamente la riparazione ossea presa insieme, i risultati possono offrire importanti intuizioni sui meccanismi di differenziazione cellulare in vitro e di riparazione ossea in vivo. I vantaggi dell'utilizzo della tecnica di panning biop con una libreria di phage display sono che siamo stati in grado di identificare peptidi che colpiscono l'osso e possono essere utilizzati per stimolare la differenziazione delle cellule mesenchimali e potenziare la riparazione ossea.

In definitiva, queste sequenze peptidiche possono essere utili in modalità terapeutiche per la riparazione ossea e per il trattamento della perdita ossea come l'osteopenia e l'osteoporosi. Sulla base di uno studio in cui ULA e Pascal hanno dimostrato che il biop panning può essere utilizzato per isolare sequenze peptidiche che colpiscono i vasi sanguigni, abbiamo scelto di adattare questo metodo per interrogare i meccanismi nelle ossa. Per la procedura di biop panning in vivo, perfuso 10 volte fino alla 10a unità di esecuzione della placca della libreria di peptidi di visualizzazione dei fagi N-E-B-P-H-D 12 attraverso il cuore di un topo con valvola C di 10 settimane.

Dopo circa cinque minuti, sopprimere il topo, esporre e sezionare i femori, tagliare le estremità e rimuovere il midollo osseo. Sciacquare il femore sinistro sia all'interno che all'esterno con PBS 10 volte. Quindi aggiungere l'osso ai batteri ER 2 5 3 7.

Per rimuovere il fago non legato, utilizzare il 2% di latte scremato essiccato in una siringa con un ago calibro 21 per sciacquare il canale intermedio del femore destro 10 volte. Ora eluire il fago legato dal canale intermedio con tampone glicina di acido cloridrico. pH 2,2 neutralizzato con un mo la triss.

Per amplificare il fago, aggiungere EIT ai batteri ER 2 5 3 7 e coltivare per 4,5 ore. Trasferire con cura i surnatanti in provette fresche e precipitare il fago tre volte con l'aggiunta di polietilenglicole. Soluzione di cloruro di sodio, incubare le provette per una notte a quattro gradi Celsius.

Infine, risospendere il pellet in TBS con 0,02% di sodio azide. Placcare il fago su piastre per determinare le unità di formazione della placca degli EIT amplificati. Ripetere la procedura di bio panning in vivo sia per il fago eluso che per quello non eluito quattro volte.

Amplifica il fago aggregato nelle colture batteriche. Purificare e quantificare la sequenza di DNA, il DNA fagico finale utilizzando 98 primer forniti con il kit di visualizzazione dei fagi. È importante calcolare la frequenza di rappresentazione della sequenza del DNA dei fagi.

Ora sintetizza i peptidi incorporando un seme di sequenza di glicina glicina glicina sinusoidale lisina e amplifica le cellule D uno. Una linea cellulare stromale multipotenziale di midollo osseo di topo clonato sviluppata nel nostro laboratorio al 90% di confluenza. La tripsina è la cellula e la centrifuga per pellettare e contare per la colorazione dei peptidi le cellule della piastra su vetrini a pozzetto della camera rivestita di gelatina e coltura per 24 ore.

Lavare le celle con PBS e fissare con il 4% di paraldeide per 30 minuti. Ora eseguire incubazioni bloccanti con glicina seguite da BSA Aden e BBSA. Soluzioni bloccanti la biotina.

Aggiungere 100 micromolari di peptidi biotinilati L seven e R one. Procedere al lavaggio delle celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Aggiungere una diluizione da una a 1000 di LOR strippin cover e pellicola e incubare in un cassetto buio per 30 minuti.

Lavare le celle e montare i vetrini coprioggetti con lo scudo vettoriale Supporti di montaggio. Ora analizza i vetrini al microscopio a fluorescenza 24 ore prima dell'intervento. Immergere i cilindri di schiuma gel.

Trasferire i cilindri di schiuma di gel con 20 peptidi micromolari L sette o R uno o tampone PBS senza peptide in sterile 12. Coltivare bene i piatti e conservare in frigorifero per una notte a quattro gradi Celsius al momento dell'intervento chirurgico. Posizionare il composito gel per telefono sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

Utilizzando una fresa pneumatica sotto irrigazione salina, creare un grande difetto corticale unicorticale oblungo di tre millimetri di larghezza per otto millimetri di lunghezza. Trattare il difetto osseo con schiume gel preparate inserendo tutti gli scaffold impiantati utilizzando una picchiettatura delicata. Eutanasia dei ratti e raccolta della tibia in momenti definiti, controllo accurato del difetto osseo e fissazione della tibia prelevata in formalina tamponata neutra al 10% per la sezione della paraffina.

Infine colorare tutte le sezioni di tessuto con ematina eosina per marcare la matrice osteo. L'isotiocianato di fluoresceina marcato con Aden consente la rilevazione microscopica del legame dei peptidi su cellule coltivate in vitro. Qui, i peptidi si legano alle cellule mesenchimali in coltura per determinare l'effetto osteogenico dei peptidi sulle cellule.

Le cellule mesenchimali in vitro in coltura possono essere trattate con peptidi di prova per determinare i cambiamenti nella morfologia cellulare. Ad esempio, al quarto giorno, le cellule iniziano ad aggregarsi e gli aggregati si ingrandiscono con il tempo per formare noduli. È interessante notare che la sezione ossea è colorata con autofluorescenza h ed e sotto luce UV.

Questo maggiore contrasto tra tessuti ossei e non ossei facilita le analisi, quantificano la presenza di osso nelle sezioni per determinare la riparazione ossea nei difetti trattati con gelfoam più peptide. Rispetto al solo gelfoam qui, i difetti che sono stati riempiti con peptide plus hanno mostrato la maggiore quantità di riparazione corticale con il tempo durante il tentativo di questa procedura. È importante essere estremamente metodici nell'inserimento dei dati a causa del gran numero di campioni che si accumuleranno invariabilmente nel tempo fino a quando non si seleziona il gruppo finale di peptidi.

Lo sviluppo del biop panning in vivo come tecnica per identificare i peptidi che hanno come bersaglio l'osso significa che ora abbiamo potenziali farmaci che potrebbero essere utilizzati come terapia per la riparazione ossea e per la perdita ossea. Uno dei meccanismi che sta alla base della riparazione ossea è coinvolto anche nella perdita ossea. Comprendere questi meccanismi in modo più dettagliato e disporre di strumenti che potrebbero essere utilizzati per il trattamento di disturbi come le fratture ritardate e l'osteoporosi aiuterà a migliorare le terapie che possono essere ideate per l'assistenza sanitaria.