Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

I virus alfa sono virus a RNA nati dalle zanzare che infettano in modo persistente le cellule di zanzara sensibili con citopatologia minima. Questo protocollo mostra l'utilità dei sistemi di trasduzione del virus alfa infettivo che esprimono reporter fluorescenti per il rilevamento dell'infezione da vettore e della trasmissione del virus. Per prima cosa nutrire le zanzare femmine con un pasto di sangue contenente il virus alfa di interesse, quindi determinare l'efficienza dell'infezione da zanzara e selezionare solo le zanzare che esprimono il gene marcatore.

Successivamente, raccogli la saliva dalle zanzare infette e dimostra la trasmissibilità infettando le cellule di zanzara coltivate con la saliva raccolta. Risultati ottenuti mediante microscopia epi fluorescente. Visualizza un rapporto di proteine come la GFP e quindi monitora l'infezione da vettore e la trasmissione del virus da parte di specie di zanzare degli anni ottanta o QE.

I sistemi di espressione del virus alfa o ATS possono essere utilizzati per valutare rapidamente l'espressione genica e le zanzare vettrici sia per gli studi sugli arbovirus, sia prima di eseguire manipolazioni più difficili delle zanzare come la transgenesi delle zanzare. A dimostrare queste procedure saranno la dottoressa Irma Sanchez Vargas, il dottor Eric Mosel e Aaron Phillips del laboratorio del dottor Ken Olson. Al fine di produrre un virus TS in cellule Bhk 21, utilizzare un virus ricombinante symbis che esprime il reporter GFP dopo trascrizione in vitro, elettro-rateizzare l'RNA del sistema di trasduzione del virus alfa genomico in cellule bhk 21.

Quindi salva e amplifica il virus prima dell'infezione. Prime zanzare per un'efficiente alimentazione del sangue da un alimentatore artificiale mediante privazione di cibo. Rimuovere lo zucchero 24 ore e l'acqua 12 ore prima dell'alimentazione.

Sangue animale defibrillato o citrato miscelato ottenuto commercialmente con la coltura cellulare preparata derivata da una sospensione del virus TS per un'efficace infezione dell'intestino medio delle zanzare. Formulare da 10 a sette unità di formazione della placca per millilitro di titolo virale per il pasto di sangue per stimolare le zanzare a ingorgare. Aggiungere un TP a una concentrazione finale di 0,02 molari.

Posizionare una membrana intestinale con segno dei pori sopra la bocca dell'alimentatore di vetro incamiciato con acqua. Quindi, installa gli alimentatori con acqua circolante a 37 gradi Celsius. Quindi pipettare la farina nella camera e posizionare saldamente gli alimentatori sul cartone.

Dopo aver nutrito le zanzare per 10-30 minuti, selezionare le zanzare ad anestetismo freddo per i campioni gonfi di sangue per consentire la replicazione e la diffusione di un virus TS nelle zanzare selezionate. Incubarli a 28 gradi Celsius e 75% di umidità relativa per otto-10 giorni. Per immobilizzare le zanzare.

Posizionare il cartone porta carta a quattro gradi Celsius per circa 15 minuti. Ora, trasferisci da cinque a 10 zanzare su un tavolo di raffreddamento adattato per l'uso su un microscopio fluorescente. Esamina e ordina le zanzare in base alla presenza o all'assenza di fluorescenza.

Riporre le zanzare selezionate nel cartone di carta per utilizzarle come desiderato. A questo punto, determinare l'efficienza dell'infezione utilizzando l'intensità fluorescente come proxy. Infine, sezionare i tessuti come l'intestino medio, le ghiandole SIV e i corpi adiposi e monitorare la fluorescenza.

Questi organi e tessuti possono essere sezionati in tempi precedenti, se lo si desidera. Privare le zanzare della fonte di zucchero per 24 ore prima della poppata. Preparare un tubo capillare da 50 microlitri che è stato riscaldato, tirato e tagliato con tre o cinque microlitri di Cargill.

Olio da immersione di tipo B per garantire che le zanzare non fuoriperdano. Togliete loro le zampe e le ali. Ora inserisci i probos nel tubo.

Monitorare attentamente le goccioline di saliva che trasudano dai probos nell'olio da immersione. Se necessario, posizionare una goccia di pilocarpina all'1% sul torace della zanzara per aumentare la salivazione dopo 60-90 minuti, rimuovere le zanzare e conservarle per un futuro isolamento del virus. Ora per raccogliere la soluzione dal tubo capillare, espellere la miscela di olio salivare in un tubo contenente 500 microlitri di 20% F-B-S-P-B-S sterile.

Filtrare l'inoculo attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron e quindi utilizzare questo inoculo per infettare le cellule coltivate nelle cellule di zanzara. L'efficacia dell'infezione con cinque virus principali DS MRE 16 GFP è valutata mediante l'espressione di GFP. Nel corso del tempo, queste cellule sono state infettate dal virus con una molteplicità di infezione dello 0,01.

Un microscopio a epifluorescenza consente di visualizzare l'intero corpo della GFP nella zanzara infetta e nelle diverse parti del corpo qui a 10 giorni dall'infezione. L'espressione selettiva d'organo della GFP è indicativa di un'infezione disseminata. L'intestino medio di solito ha un'infezione da focolai distinti all'inizio dopo aver ingerito un pasto di sangue contenente un virus che si diffonde in tutto l'intestino medio posteriore nei momenti successivi all'infezione.

Questi eventi sono segnalati dai giornalisti di GFP e DS RED. Il test di trasmissione indica che cinque virus principali DS MRE 16 GFP esprimono stabilmente GFP durante il periodo di incubazione estrinseca. Nella zanzara qui, la GFP e la saliva della zanzara vengono rilevate già otto giorni dopo l'infezione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare per via orale un virus A TS a una zanzara, come valutare visivamente l'infezione virale in una zanzara e come valutare la trasmissione del virus dalla zanzara.