Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un incrocio genetico del parassita della malaria nei roditori Plasmodium yoelii, al fine di generare progenie ricombinante. Questo risultato si ottiene innanzitutto inoculando un gruppo di topi con un campione misto contenente le due linee parentali del parassita da incrociare. I topi infetti vengono quindi utilizzati per nutrire delle zanzare, all'interno delle quali i gameti di ciascun ceppo parentale si fondono formando uno zigote diploide; in questa fase, la divisione meiotica può portare alla ricombinazione genetica, producendo così progenie ricombinante.

Gli sporozoiti ottenuti vengono quindi raccolti dalle ghiandole salivari delle zanzare e re-iniettati in topi ricettori naïve al fine di ottenere parassiti della fase ematica, tra cui singoli cloni ricombinanti che possono essere isolati mediante diluizione limitata. In un esperimento di successo, dal 5 al 10% delle linee clonate saranno ricombinanti, caratterizzabili mediante genotipizzazione per marcatori genetici appropriati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla malaria, come ad esempio quali sono i determinanti genetici della resistenza ai farmaci e della trasmissibilità nella malaria?

Parassiti a temperatura ambiente per due provette contenenti lo stadio ematico congelato, parassiti malarici da incrociare. In questo esempio, i due ceppi di parassiti malarici di roditore utilizzati sono Plasmodium yoelii e Plasmodium yoelii nigeriensis. Montare su una siringa un ago da 22 a 30 gauge e aspirare 400 microlitri di PBS pH 7,4 utilizzando la stessa siringa.

Aspirare 100 microlitri di sangue infetto da Thor, capovolgere la siringa su e giù fino a quando il contenuto non è mescolato omogeneamente. Durante questa dimostrazione, verranno utilizzati animali anestetizzati al fine di minimizzare dolore e stress. L'anestesia viene eseguita iniettando 50 microlitri di un cocktail anestetico contenente 82,5 milligrammi per chilogrammo di chetamina e 7,5 milligrammi per chilogrammo di xilazina nel peritoneo di un topo.

Monitorare i topi per verificare la profondità dell'anestesia e prevenire la mortalità. Con questa procedura, i topi rimarranno sotto anestesia per 20-30 minuti. Prima del risveglio, iniettare 200 microlitri di soluzione contenente parassiti direttamente nel peritoneo di un topo.

Al termine, smaltire la siringa in un contenitore per materiali taglienti. Utilizzando questo metodo, infettare due topi con ciascuno dei due parassiti da incrociare da tre a cinque giorni dopo le iniezioni. I parassiti della fase ematica si svilupperanno nei topi infetti.

Tagliare con forbici sterili l'estremità della coda del topo dei topi donatori infettati con ceppi parassitari diversi. Raccogliere una goccia di sangue dalla coda del topo su un vetrino e preparare strisci sottili. Colorare lo striscio sottile di sangue con la colorazione di giemsa.

Il colorante Guillem SA non colorerà i globuli rossi non infetti a causa delle cellule non infette. La mancanza di un nucleo em SAI colorerà il nucleo del parassita nei parassiti dei globuli rossi infetti; i globuli rossi appaiono sotto forma di stadi a anello, trofozoiti ski ons e maites in rottura. Una volta che l'anemia parassitaria raggiunge dall'1 al 5% in entrambi i topi, i parassiti dello stadio ematico possono essere raccolti per l'infezione con clone misto.

Tagliare la punta della coda del topo nei topi donatori infettati con i diversi parassiti. Strizzare con forbici sterili come descritto in precedenza. Raccogliere un microlitro di sangue dalla coda del topo utilizzando una capillare di vetro in un millilitro di PBS sterile; utilizzare 20 microlitri della sospensione di sangue per analizzare la densità dei globuli rossi con cell ome.

Utilizzando la densità degli eritrociti e le misurazioni para, diluire i campioni di sangue in una soluzione salina citrata fisiologica in modo da ottenere una concentrazione di eritrociti infetti pari a un milione ogni 100 microlitri. Combinare un campione di sangue infetto proveniente dai due donatori in rapporto uno a uno per ottenere un inoculo di clone misto. Successivamente, iniettare 100 microlitri del campione misto nel peritoneo di ciascun topo da infettare.

Utilizzare due topi per infezioni con singolo clone, in modo da poter confermare la trasmissione riuscita di ciascun ceppo parentale. Le fasi sessuali del parassita, chiamate gametociti maschili e femminili, dovrebbero iniziare ad apparire nel sangue dei topi circa quattro giorni dopo l'infezione. Iniziare a monitorare i topi quotidianamente per rilevare la comparsa dei gametociti, prelevando sangue dalla coda come descritto in precedenza e preparando strisci sottili ematici dalla coda.

I citi maschili e femminili sono riconoscibili a causa della presenza di granuli o pigmenti di grandi dimensioni. Il citoplasma dei citi gato maschili è rosa, mentre il citoplasma dei citi TER femminili è blu. Solo i citi gato maturi presentano una grande vacuolo.

Una volta rilevati gli oociti maturi di entrambi i sessi, i topi possono essere utilizzati per nutrire le zanzare. Iniettare 50 microlitri di soluzione anestetica a base di chetamina e xilazina nel peritoneo di ciascun topo infetto. Una volta anestetizzati i topi, posizionarne uno con la pancia verso il basso sulla sommità di una gabbia contenente da 50 a 100 zanzare femmine Anis defense enzyme private dell’alimentazione zuccherina da 24 ore e permettere alle zanzare di nutrirsi per 30 minuti senza interruzioni.

Eutanasia umanamente i topi immediatamente dopo il periodo di alimentazione. Se la trasmissione ha successo, nove giorni dopo l'alimentazione, i gametociti assunti dalle zanzare si saranno fusi in zigoti diploidi che maturano in oocisti, visibili nell'intestino medio degli insetti. Maggiore è il numero di oocisti rilevati, maggiori sono le probabilità che siano stati generati parassiti ricombinanti.

Utilizzare un aspiratore per raccogliere da cinque a dieci zanzare infette dalla gabbia e trasferire le zanzare in un contenitore piccolo. Anestetizzare le zanzare utilizzando gas anidride carbonica e trasferirle in una capsula di Petri di vetro su ghiaccio. I maschi, le cui antenne sono visibilmente più folte rispetto a quelle delle femmine, devono essere scartati.

Riempire due siringhe con PBS ed equipaggiarle con aghi da 26 gauge lunghi mezzo pollice. Depositare circa 100 microlitri di PBS da una siringa su un vetrino. Trasferire da cinque a dieci zanzare femmine anestetizzate sulla goccia di PBS e posizionare il vetrino su un microscopio stereoscopico utilizzando gli aghi.

Rimuovere le ali e le zampe di ciascun insetto, quindi tenere l'insetto al torace e all'addome posteriore. Tirare il corpo fino a quando l'intestino medio, un organo simile a una sacca bianca, non viene rilasciato. Staccare l'intestino medio e scartare il resto del corpo durante le dissezioni.

Assicurarsi di mantenere umidi i midgut utilizzando il PBS dalle aghi per dissezione. Posizionare un coprioggetto sui midgut una volta completata la dissezione. Esaminare i midgut al microscopio ottico con un ingrandimento di 100 volte.

Gli OOS saranno riconoscibili come strutture circolari a parete spessa che si trovano sulla superficie esterna dei midgut. Contare il numero di OOS in ciascun midgut. Diciassette giorni dopo l’assunzione, gli sporozoiti rilasciati dal sistema dovrebbero aver migrato verso le ghiandole salivari delle zanzare, ovvero gli sporozoiti dei parassiti della malaria.

Cellule sottili a forma di fuso per raccogliere gli sporozoiti. Per prima cosa, preparare una provetta di raccolta utilizzando forbici pulite. Tagliare il coperchio di una piccola provetta einor da 500 microlitri.

Riscaldare la punta di un ago sterile da 19 gauge e forare il fondo del tubo. Riempire un terzo del tubo con parete di vetro per creare un filtro. Inserire il tubo filtro all'interno di un tubo einor più grande da 1,5 millilitri.

Una volta che l'apparecchio per filtrazione è pronto, raccogliere e anestetizzare le zanzare come descritto in precedenza. Montare le zanzare a secco per la dissezione come in precedenza ed eliminare le zanzare, le teste, le ali, le zampe e gli addomi. Solo il torace contiene le ghiandole salivari infette.

Utilizzando pinzette fini, trasferire il torace in un omogeneizzatore da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di PBS. Omogeneizzare il torace sul ghiaccio per rilasciare gli sporozoiti dalle ghiandole salivari e, mediante una pipetta di vetro, trasferire gli omogenati nell'apparato di filtrazione. Centrifugare il tubo del filtro per 10-20 secondi a 1000 giri al minuto.

Dopo aver centrifugato gli omogenati, raccogliere il flusso passante utilizzando una siringa dotata di un ago da 22 a 30 gauge. Iniettare da 100 a 500 microlitri della sospensione di sporozoiti nel peritoneo di un topo. Iniziare a monitorare la parassitemia e la densità dei globuli rossi nei topi a partire da tre giorni dopo l'infezione.

Scegliere un topo che presenta una parassitemia compresa tra lo 0,1 e l'1% e i cui globuli rossi infetti contengano principalmente parassiti singoli, come donatore per la procedura di clonaggio. Prelievarne una quantità adeguata di sangue in PBS, diluendo il sangue della coda in una soluzione fredda uno a uno di siero di vitello e soluzione di Ringer per mammiferi, in modo da ottenere una concentrazione compresa tra 0,6 e un globulo rosso infetto ogni 100 microlitri, e conservare l'inoculo sul ghiaccio. Disinfettare il sito di iniezione sulla coda con etanolo per via endovenosa.

Iniettare 100 microlitri di sangue infetto diluito in ciascuno dei 100 topi. In questo modo, ogni singolo topo dovrebbe ricevere uno o zero parassiti. In un esperimento di successo, dal 20 al 50% dei topi mostrerà una parassitemia dello 0,1-0,5% all'ottavo giorno.

Cinque a sette giorni dopo, analizzare i topi alla ricerca di parassiti in fase ematica esaminando strisci sottili di sangue fissati. I parassiti progenie dell'incrocio possono quindi essere sottoposti a genotipizzazione mediante PCR del DNA, estratto da campioni di sangue della coda, utilizzando marcatori genetici su diversi cromosomi, come microsatelliti e polimorfismi a singolo nucleotide. I parassiti i cui loci genetici indipendenti derivano dalle due linee parentali sono cloni ricombinanti.

Il sangue degli animali infettati con parassiti ricombinanti può essere crioconservato per un uso futuro. In un esperimento di successo, dal cinque al dieci per cento dei topi totali avrà prole ricombinante indipendente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre un processo genetico nella malaria.

Parassita più mezzo yoi. Questo metodo può essere ugualmente applicabile ad altre specie di parassiti.