Name: Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Impara a produrre incroci genetici del parassita della malaria Plasmodium yoelii utilizzando topi e zanzare. Questo metodo genera progenie ricombinanti per studiare i determinanti genetici della resistenza ai farmaci.

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Ringraziamo il Dr. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare e Tovi Lehman per la lettura critica di manoscritti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Intramurale della Divisione di ricerca intramurale, Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive, National Institutes of Health, e dal Programma nazionale di ricerca di base 973 della Cina, # 2007CB513103. Ringraziamo NIAID intramurale editor di Rae Brenda Marshall per l&#39;assistenza.

Tecniche asettiche devono essere applicati a tutti i materiali che saranno somministrati in animali al fine di evitare l'introduzione accidentale di agenti infettivi esogeni in topi che possono confondere i risultati sperimentali. 1. L'infezione di topi da laboratorio con sangue stadio parassiti della malaria <ol><li> A temperatura ambiente, disgelo due fiale contenenti il ​​sangue congelato parassiti della malaria stadio da attraversare. In questo esempio, due ceppi di roditori parassita della malaria da Plasmodium utilizzati sono yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii. </li><li> Montare una siringa con un calibro 22-30 (G) l'ago e redige 400 ml di sterile, di grado farmaceutico PBS (pH 7,4). </li><li> Utilizzando la stessa siringa, elaborare 100 l di sangue infetto scongelati; invertire la siringa su e giù fino a quando il contenuto è omogeneo misto. (Opzionale: una pipetta può essere utilizzato per trasferire PBS e il sangue infetto in un tubo di raccolta prima di trasferire in una siringa per iniezione). </li><li> Iniettare 200 ul di parassita che contiene la soluzione direttamente nel peritoneo di un mouse. Al termine, scartare la siringa in un contenitore taglienti. (Vedi anche Materiali complementari per la manutenzione di topi di laboratorio). In generale, la dimensione standard del inoculo è compresa tra 100-500 microlitri, a seconda dei livelli di infezioni parassita nei materiali originali congelato. </li><li> Iniettare i due ceppi di parassiti da attraversare in due topi ciascuno. I topi saranno positivi microscopicamente 3 a 5 giorni dopo le iniezioni. Quando parasitemias raggiungere tra 1-5%, passare alla fase successiva. </li></ol> 2. Clone infezione mista di topi <ol><li> Prima di infezione clone misti, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l'esame microscopico di strisci colorati Giemsa fluidificare il sangue (Fig. 3), e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate) . </li><li> Calcolare il volume di una soluzione fisiologica (1,5% w / v citrato trisodico biidrato, 0,85% w / v di cloruro di sodio) e il sangue del mouse necessario per produrre una miscela di inoculo, utilizzando la parassitemia e rosso sangue le misurazioni della densità delle cellule ottenute in precedenza. </li><li> Regolare la soluzione parassita ad una concentrazione finale di un milione di cellule infette rossi del sangue per 100μl. </li><li> Combina il sangue infetto da due donatori in un rapporto 1:1 per ottenere un misto clone di inoculo. Quando i due cloni parentali si differenziano per il tasso di crescita, regolare le proporzioni di una più rapida crescita dei genitori ad una crescita lenta clone dei genitori per 1:2 o 1:5. </li><li> Iniettare 100 ul del campione misto nel peritoneo di ogni topo di essere infetti. (Vedi anche punto 3,9 a determinare il numero di topi da iniettare) </li><li> Utilizzando questo metodo, infettare ogni due mouse con i ceppi singoli genitori. Il singolo-clone infezioni consentirà di determinare la trasmissione di successo dei due ceppi parentali. </li></ol> 3. Le zanzare di alimentazione <ol><li> Preparare tre gabbie contenenti 300-500 adulti (maschi e femmine) le zanzare anofele stephensi ciascuno, età 5-7 giorni dopo l'emergere di pupe. I contenitori sono coperti con una rete sicura da un coperchio di plastica o metallo. Due gabbie sono per l'alimentazione sui cloni dei genitori; la gabbia terzo è per la preparazione di un incrocio. </li><li> A partire quattro giorni dopo la mixed-clone di infezione, preparare Giemsa macchiato di sottili strisci di sangue dalla coda dei topi infetti. </li><li> Esaminare il strisci sotto un microscopio attraverso la scansione di almeno 50 campi microscopici ad ingrandimento 1000x e determinare se gametociti maschili e femminili sono presenti. </li><li> Gametociti maschili e femminili sono riconoscibili per la presenza di grandi granuli vacuolo e di grandi dimensioni (Fig. 3). Gametociti maschili e femminili hanno citoplasma rosa e blu, rispettivamente. Se gametociti sono presenti, seguire passo 3.6. </li><li> Se gametociti sono assenti, continuare a monitorare ogni giorno fino a che non appaiono. Se gametociti sono presenti, continuare il passo successivo. </li><li> Iniettare 50 ml di cocktail di farmaci anestetici contenenti 33 mg / ml di ketamina e 3 mg / mL di xylazina nel peritoneo di un mouse per anestetizzare ogni topo infetto (per 20 grammi di peso corporeo del mouse). Ultima dose di ketamina e xilazina è 82,5 e 7,5 mg / kg, rispettivamente. </li><li> Posizionare i topi a faccia in giù sulla cima di una gabbia contenente adulto zanzare Anopheles stephensi che sono stati affamati di approvvigionamento di zucchero per 24 ore e consentono di alimentare le zanzare per 30 minuti senza interruzioni. </li><li> Mantenere le zanzare in una insectary in condizioni standard (temperatura è mantenuta tra 24-26 ° C; vedere anche Metodi supplementare per la manutenzione del laboratorio di zanzare). </li><li> Utilizzare un mouse infetti per ogni 50-100 zanzare femmine. Euthanize i topi immediatamente dislocazione cervicale dopo l'alimentazione, mentre i topi sono ancora sotto anestesia. </li></ol> 4. Mosquito Midg dissezioneUTS e oocisti di conteggio <ol><li> Nove giorni dopo la poppata, le zanzare saranno esaminate per oocisti in midgut dell'insetto. La presenza di oocisti nelle zanzare che si nutrono di topi infettati singolo clone indica che gametociti dei due ceppi parentali sono infettive. </li><li> Di sezionare un midgut zanzara, utilizzare un aspiratore collegato ad un piccolo contenitore per raccogliere 5-10 zanzare infette dalla gabbia. </li><li> Utilizzando gas CO 2, anestetizzare le zanzare e trasferirli in un piatto di vetro Petri sul ghiaccio. Separare ed eliminare le zanzare maschio. Le antenne dei maschi sono notevolmente più folta rispetto alle femmine. </li><li> Riempire due siringhe con PBS e in forma con 26 calibro mezzo pollice (G ½) aghi. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino. </li><li> Trasferimento 5-10 zanzare femmina anestetizzato sulla goccia di PBS e il luogo di diapositive su un microscopio da dissezione. </li><li> Utilizzando gli aghi stesso, togliere le ali ogni zanzara e gambe, poi, tenendo l'insetto al torace e l'addome posteriore, estrarre il corpo senza fino alla midgut, un bianco sac-come corpo, viene rilasciato. Staccare il midgut e scartare il resto del corpo. </li><li> Aggiungere più PBS sulla midgut se le diapositive sono asciutte. Il midgut degenererà se lascia secca. Posizionare un vetrino sulla midguts. </li><li> Esaminare il midguts sotto un microscopio ottico con un ingrandimento 100x. Contare il numero di oocisti in ogni midgut (Fig. 3). Oocisti sono riconoscibili come strutture circolari spesse pareti che si trovano sulla superficie esterna del midguts. </li><li> Al termine, disporre di siringhe, aghi e far scorrere in un contenitore taglienti. </li><li> Se oocisti sono assenti nel midguts, mangimi zanzare con i topi infettati con il maggior numero di gametociti e dare un tempo più lungo di alimentazione. La temperatura è fondamentale per questo passaggio. Assicurarsi che la temperatura è impostata a 24 a 26 ° C. </li></ol> 5. Raccolta sporozoiti da zanzare per centrifugazione <ol><li> Preparare provette sporozoite come segue: tagliare il coperchio di una pulizia di 0,5 ml di tubo di centrifuga, un buco (0,1-0,2 mm di diametro) nella parte inferiore del tubo con una fiammata 19 ago G. </li><li> Riempire 1 / 3 del tubo con lana di vetro. Inserire il tubo in un filtro da 1,5 mL tubo di raccolta (un tubo è sufficiente per sporozoiti raccolto da circa 100 zanzare) </li><li> Il giorno 17 di alimentazione messaggio, raccogliere le zanzare (Fase 4) dalle gabbie in un piccolo contenitore con un aspiratore. </li><li> Utilizzare gas CO 2 per anestetizzare le zanzare. </li><li> Separare le femmine dalle zanzare maschio. Trasferire le zanzare femmine anestetizzato dal contenitore per un piatto di vetro Petri sul ghiaccio. </li><li> Preparare due siringhe con aghi 26 G ½ pieno di PBS. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino. </li><li> Trasferire le zanzare su un vetrino da microscopio. Togliere la testa le zanzare ', ali, gambe, addome e sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Utilizzando punta fine pinze trasferire i toraci in 0,5 ml di PBS in un 1,5 mL omogeneizzatore (mortaio e pestello). Conservare il toraci su ghiaccio (sporozoite rimane infettivi per 2-3 h). </li><li> Omogeneizzare la toraci sul ghiaccio per liberare sporozoiti dalle ghiandole salivari (vedi figura 3), e trasferire i lisati (omogenati) nel tubo riempito di lana di vetro (Fase 5,1-5,2) usando una pipetta di vetro. </li><li> Centrifugare per 10 a 20 sec a 1000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il flow-through (la sospensione sporozoite purificato) utilizzando una siringa con un ago 22-30 G. (Opzionale: calo 10-50 microlitri della flow-through su un vetrino da microscopio, posizionare una copertura antiscivolo e visualizzare gli sporozoiti vivere sotto un microscopio ottico standard, ingrandimento 400X, vedi anche Fig. 3) </li><li> Iniettare ip 0,1-0,5 mL di sospensione sporozoite in topi (fino a 200.000 parassiti può essere raccolto da una zanzara, vedi rif 12). In un caso di successo, l'animale si infetta 72 ore dopo l'iniezione. </li></ol> 6. Clonazione Progeny si utilizza la diluizione limitata <ol><li> Settantadue ore dopo le iniezioni sporozoite, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l'esame microscopico dopo colorazione di Giemsa strisci di sangue sottile e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate). </li><li> Scegli un mouse visualizzando una parassitemia 0,1-1% e le cui cellule infette globuli rossi contengono parassiti per lo più single, come donatore per la procedura di clonazione. Ripetere il passo 6,1 giorno successivo, se i topi sono microscopicamente negativi. Se gli animali non sono infetti entro 14 giorni, ripetere il passo 2 a 5 e determinare la presenza di sporozoiti al punto 5.11). </li><li> Diluire il sangue coda raccolte in un freddo 1:01 soluzione di Ringer siero di vitello e dei mammiferi (2,7 mM di cloruro di potassio, 1,8 mM di cloruro di calcio, cloruro di sodio 154 mM) in modo da raggiungere una truffaconcentrazione da 0,6 a 1 cella di sangue infetto rosso per 100 l, e memorizzare l'inoculo sul ghiaccio. In questo modo, la maggior parte del mouse individuo dovrebbe ricevere uno o zero parassiti. </li><li> Per via endovenosa iniettare 100 ml di sangue infetto diluito in ogni da 50 a 100 topi. </li><li> Cinque a sette giorni dopo, sullo schermo i topi per la presenza di parassiti fase sangue esaminando Giemsa-macchiate strisci di sangue sottile. In un esperimento riuscito, 20-50% dei topi infettati e mostrerà parassitemia del 0,1-5,0% al giorno 8 l'infezione. </li></ol> 7. Caratterizzazione di Progeny utilizzando marcatori genetici <ol><li> Colleziona 20-40 l di sangue del mouse in una coda di 1,5 mL provetta contenente 0,2 ml di acqua refrigerata soluzione di citrato fisiologica salina, mescolare brevemente nel vortex e centrifugare per 3 min a 3000 rpm a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Estrarre il DNA immediatamente o tenere il pellet a -80 ° C. </li><li> Preparare DNA parassita utilizzando qualsiasi metodo di estrazione del DNA. Per l'isolamento rapido di DNA, utilizzare un modello ad alta Pure PCR preparazione kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Ricombinante progenie vengono identificati dopo genotipizzazione mediante microsatelliti (MS) o singoli polimorfismi nucleotidici (SNP) su cromosomi diversi che possono differenziare i due ceppi parentali della croce genetica. Un metodo semplificato utilizzando una singola primer fluorescente marcato per MS genotipizzazione di P. yoelii può essere utilizzato (vedi rif 8,9). </li></ol> 8. Crioconservazione di sangue allo stadio parassiti della malaria <ol><li> Raccogliere 0,5-1 ml di sangue infetto mediante puntura cardiaca da un mouse anestetizzati con parassitemia del 5-20% in 5-10 ml di soluzione fisiologica salina fredda. </li><li> Centrifugare per 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gettare il surnatante. </li><li> Aggiungere goccia a goccia il volume di 2x Glycerolyte 57 soluzione (Fenwal Laboratories) sul pellet di sangue e mescolare bene. </li><li> Trasferire la sospensione in cryotubes (0,2-0,5 ml per provetta). </li><li> Conservare il sangue criopreservati a -80 ° C (fino a 1 mese) o in azoto liquido. </li></ol> 9. Rappresentante dei risultati: In un esperimento riuscito, il 5-10% delle linee clonato sarà indipendente progenie ricombinante. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una rappresentazione schematica del ciclo di vita e gli eventi di ricombinazione genetica nel corso di un incrocio. Eventi di ricombinazione genetica si svolgono durante la fase iniziale di sviluppo nella zanzara. Dopo la fecondazione di "aploidi" gameti maschili e femminili di diverse origini genetiche nel midgut della zanzara, "diploide" zigoti sono formate. Lo zigote rappresenta l'unica tappa diploide del ciclo di vita dei parassiti; meiosi segue entro 12 ore dalla fecondazione, e tutte le fasi successive nella zanzara e mammiferi rimangono aploidi. Gli zigoti risultanti si sviluppano in ookinetes e oocisti. Crescita e la divisione mitotica di ogni oocisti produce migliaia di sporozoiti, che vengono rilasciati in hemoceal zanzare '. Quelli sporozoiti che migrano verso le ghiandole salivari sono in grado di essere trasmessi a un ospite mammifero, dove lo sviluppo del fegato e globuli rossi fasi avviene. Nel corso dei cicli di globuli rossi, alcuni parassiti possono differenziarsi in maturare gametociti maschili e femminili. Il ciclo di vita del parassita si completa quando questi gametociti sono prese da un altro la trasmissione zanzara, perpetuando. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ereditarietà dei geni nucleari in parassiti della malaria e la produzione di progenie ricombinante. Ricombinazione genetica può essere generato attraverso il riassortimento dei cromosomi o da eventi di crossover. Progenie omozigote prodotto da autofecondazione tra gameti del clone stessi genitori 1 o 2 (A e D), rispettivamente. B) progenie eterozigote prodotto dalla fertilizzazione incrociata tra gameti di due diversi cloni dei genitori, nuclei ricombinante (ovali blu) che è costituita da riassortimento cromosomiche solo. C) progenie eterozigote prodotta da fertilizzazione incrociata tra gameti di due cloni differenti genitore, nuclei ricombinante (ovali rosso) è formata da incroci tra il non-sorella cromatidi dei cromosomi omologhi. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Morfologia della malaria roditore parassita Plasmodium yoelii. A) fase anello, B) trofozoite, C) schizonte, D) merozoiti, E) immaturi gametocyte maschile, F) gametocyte maturo maschio, G) immaturi gametocyte femminile, H) gametocyte Donna matura, I) midgut oocisti con il 10 ° giorno dopo alimentazione (oocisti mature indicato dalle frecce; ingrandimento 200x), J) zanzara ghiandole salivari (ingrandimento 100x), K) sporozoiti (ingrandimento 400x).

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Dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio nella malaria da Plasmodium yoelii roditore, che è applicabile anche alla produzione di croci genetica in malarie altri roditori. Infezioni di topi con singoli cloni dei genitori sono di solito eseguite per determinare la trasmissione di successo dei parassiti dei genitori per garantire che i genitori sono competenti nel produrre gameti funzionali prima di eseguire una croce. Trasmissione di successo attraverso una zanzara è i...

SUPPLEMENTARI MATERIALI: <ul><li> Mantenimento di topi di laboratorio </li><li> Manutenzione di laboratorio zanzare </li><li> L&#39;esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa </li><li> Misura della densità dei globuli rossi </li></ul> Mantenimento di topi di laboratorio Femmine di ceppo inbred topo di laboratorio BALB / c, dai 5 agli 8 settimane di età, sono utilizzati nello studio. I topi sono alloggiati in uno standard a fondo compatto gabbia in policarbonato con filo-bar coperchio, dotato di alimentatore e una bottiglia d&#39;acqua. I topi sono mantenute ad una temperatura costante (25 ± 1 ° C) ore 12:12 luce: ciclo scuro. I topi sono autorizzati a nutrirsi 2018S Harlan Teklad globale del 19% di proteine ​​dieta dei roditori estruso (sterilizzabile; da Harlan-Teklad) e dotate di bere ad libitum acidificato acqua. Gli esperimenti sugli animali sono eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso l&#39;Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive sotto protocollo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Manutenzione di laboratorio zanzare Le zanzare sono da un laboratorio di razza colonia di Anopheles stephensi. Gli adulti sono mantenuti in gabbie di nylon tenuti in una temperatura e umidità controllate camera (23 a 25 ° C per Plasmodium yoelii e Plasmodium chabaudi, e 19 a 21 ° C per Plasmodium berghei; 80-95% di umidità; sul 12:12 ore di luce: ciclo scuro). Zanzare adulte sono alimentati con il 10% di glucosio e 2,00% para-aminobenzoico (PABA) soluzione di acqua integrato. Per ottenere alta qualità adulti, 500 larve si sviluppano in una condizione di bassa densità in 1 L di acqua distillata in un 1.000 cm 3 piatto aperto fornito con circa 1 mg di bicarbonato di sodio. Dopo la schiusa, le larve sono dati TetraMin polvere (PETCO) fino a quando si sviluppano in fase di pupa e sono trasferiti al gabbie zanzara adulta per emergenti. L&#39;esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa Con forbici pulite tagliare la punta (1,0 mm) della coda del topo infetto. Porre una goccia (0.5-1.0 mL) di sangue coda su un vetrino pulito. Topo sangue si fermerà in 1-2 min. Posizionare un vetrino pulito diffusore sulla parte superiore della goccia di sangue, mantenendola ad un angolo di 45 ° rispetto alla diapositiva campione, e permettere al sangue di assorbire per tutta la larghezza del diffusore. Tenere il vetrino e spingere in avanti il ​​vetrino diffusore rapidamente e senza intoppi per la produzione di uno striscio sottile. Lasciare che il film di sangue secco, e poi immergere i vetrini in metanolo assoluto. Lasciare che il vetrino asciugare ancora una volta prima di coprire con Giemsa (10% Giemsa colorante in acqua distillata). Dopo l&#39;incubazione del film fluidificare il sangue per 10-15 minuti a temperatura ambiente, risciacquare con cura i vetrini con acqua di rubinetto e lasciare asciugare all&#39;aria. Esaminare il numero di globuli rossi infetti (iRBC; vedi Figura 3 per la morfologia di RBC infetti) sotto un microscopio ottico con olio di immersione con ingrandimento 1000x (con lente obiettivo 100x) e calcolare parassitemia (il numero di iRBC per 100 RBC contati). Diversi ceppi di parassiti della malaria variare del tasso di crescita e la patogenicità. Monitoraggio della fase parasitaemias sangue può essere eseguita 24 ore dopo le iniezioni, a seconda della dose dei parassiti della malaria nel sangue stadio. Per esempio, i topi saranno microscopicamente positivo 24 ore quando iniettato con 10 7 globuli rossi infetti intraperitoneale o 10 6 RBC infetti per via endovenosa. Misura della densità dei globuli rossi Come i livelli di parasitaemias, globuli rossi (RBC) densità in topi infettati varia nel corso dell&#39;infezione. Densità RBC deve essere misurato entro 1-2 ore prima dell&#39;inizio della singola infezione e mixed-clone e gli esperimenti di clonazione. Ci sono due metodi di misura della densità di RBC: un conteggio manuale utilizzando Neubauer emocitometro e un conteggio automatico utilizzando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). In entrambi i metodi, prelevare 1 ml di sangue del mouse coda utilizzando un capillare di vetro (VWR) e diluire in 10 ml di PBS e mescolare bene. Per utilizzare un emocitometro Neubauer, carico 20 l di sospensione sul emocitometro. Posizionare il emocitometro su un microscopio ottico, con lenti dell&#39;obiettivo 10x. Il emocitometro contiene una griglia suddivisa in 9 grandi piazze, e 4 grandi piazze in un angolo sono ulteriormente suddivisi in 16 piccoli quadrati. Contare il numero totale di cellule in ciascuna delle 16 piccole piazze nelle quattro piazze d&#39;angolo. Per evitare il pregiudizio o il conteggio delle cellule che si sovrappongono una linea della griglia, conta una cella come &quot;in&quot; se si sovrappone le linee superiore o destro e &quot;out&quot; se si sovrappone le linee di basso o sinistra. Stimare il numero di celle per una piazza piccola e dividere per 0,00625 (il volume di una piccola piazza è 6,25 nL). Questo restituisce il numero di cellule per microlitro (&amp;mu, L). Da questi dati, calcolare la densità finale delle cellule rosse del sangue moltiplicando con 10.000 (un fattore di diluizione). Sciacquare il vetrino e la camera di conteggio con acqua distillata e 70% di etanolo, aria secca. In alternativa, caricare 20 l di sospensione su un vetrino da camera Cellometer conteggio. Inserire il vetrino in una camera scivolo Cellometer (il lettore). Avviare il software Cellometer, selezionare l&#39;opzione &quot;globuli rossi&quot; opzione e immettere un fattore di diluizione di 10.000. Registrare la densità di RBC.

protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variazione di risposta ai farmaci antimalarici e della patogenicità dei parassiti della malaria è di importanza biologica e medica. Mappatura collegamento ha portato alla identificazione di successo di geni o loci sottostante vari tratti di parassiti della malaria di roditori 1-3 e gli esseri umani 4-6. Il parassita della malaria Plasmodium yoelii è una delle specie di malaria molti isolato da roditori selvatici africani ed è stato adattato a crescere in laboratorio. Questa specie riproduce molte delle caratteristiche biologiche dei parassiti della malaria umana; marcatori genetici come microsatelliti e amplificato frammento lunghezza polimorfismo (AFLP) i marcatori sono stati sviluppati anche per il parassita 7-9. Così, gli studi genetici in parassiti della malaria roditori possono essere eseguite per completare le ricerche sul Plasmodium falciparum. Qui, noi dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio in P. yoelii che sono stati pionieri di Drs. David Walliker, Richard Carter, ei suoi colleghi presso l&#39;Università di Edimburgo 10. Incroci genetici in P. yoelii e altri parassiti della malaria roditori sono condotte da infettando i topi Mus musculus con un inoculo contenente gametociti di due cloni geneticamente distinte che si differenziano per fenotipi di interesse e permettendo zanzare di nutrirsi di topi infettati 4 giorni dopo l&#39;infezione. La presenza di gametociti maschili e femminili nel sangue mouse è microscopicamente confermato prima della somministrazione. Entro 48 ore dopo il pasto, nel midgut della zanzara, i gametociti aploide differenziarsi in gameti maschili e femminili, fertilizzare, e forma uno zigote diploide (Fig. 1). Durante lo sviluppo di uno zigote in un ookinete, meiosi sembra verificarsi 11. Se lo zigote è il risultato di fertilizzazione incrociata tra gameti di due parassiti geneticamente distinte, scambi genetici (riassortimento cromosomiche e cross-over tra i non-sorella cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi;. Fig. 2) possono verificarsi, con conseguente ricombinazione di materiale genetico di loci omologhi. Ogni zigote subisce due successive divisioni nucleari, portando a quattro nuclei aploidi. Un ookinete sviluppa in un oocisti. Una volta che il oocisti matura, migliaia di sporozoiti (la progenie della croce) sono prodotti ed emessi in hemoceal zanzara. Sporozoiti vengono raccolte dalle ghiandole salivari e iniettato in un nuovo ospite murino, dove lo sviluppo fase pre-eritrocitaria e eritrocitaria avviene. Forme eritrocitaria sono clonati e classificati in relazione ai caratteri distintivi delle linee parentali prima mappatura linkage genetico. Infezioni controllo dei singoli cloni dei genitori vengono eseguite nello stesso modo come la produzione di un incrocio.

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Ed è applicabile ad altri parassiti della malaria roditori.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

La variazione nella risposta ai farmaci antimalarici e nella patogenicità dei parassiti della malaria riveste un'importanza biologica e medica. La mappatura per linkage ha condotto a...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un incrocio genetico del parassita della malaria nei roditori Plasmodium yoelii, al fine di generare progenie ricombinante. Questo risultato si ottiene innanzitutto inoculando un gruppo di topi con un campione misto contenente le due linee parentali del parassita da incrociare. I topi infetti vengono quindi utilizzati per nutrire delle zanzare, all'interno delle quali i gameti di ciascun ceppo parentale si fondono formando uno zigote diploide; in questa fase, la divisione meiotica può portare alla ricombinazione genetica, producendo così progenie ricombinante.Gli sporozoiti ottenuti vengono quindi raccolti dalle ghiandole salivari delle zanzare e re-iniettati in topi ricettori naïve al fine di ottenere parassiti della fase ematica, tra cui singoli cloni ricombinanti che possono essere isolati mediante diluizione limitata. In un esperimento di successo, dal 5 al 10% delle linee clonate saranno ricombinanti, caratterizzabili mediante genotipizzazione per marcatori genetici appropriati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla malaria, come ad esempio quali sono i determinanti genetici della resistenza ai farmaci e della trasmissibilità nella malaria?Parassiti a temperatura ambiente per due provette contenenti lo stadio ematico congelato, parassiti malarici da incrociare. In questo esempio, i due ceppi di parassiti malarici di roditore utilizzati sono Plasmodium yoelii e Plasmodium yoelii nigeriensis. Montare su una siringa un ago da 22 a 30 gauge e aspirare 400 microlitri di PBS pH 7,4 utilizzando la stessa siringa.Aspirare 100 microlitri di sangue infetto da Thor, capovolgere la siringa su e giù fino a quando il contenuto non è mescolato omogeneamente. Durante questa dimostrazione, verranno utilizzati animali anestetizzati al fine di minimizzare dolore e stress. L'anestesia viene eseguita iniettando 50 microlitri di un cocktail anestetico contenente 82,5 milligrammi per chilogrammo di chetamina e 7,5 milligrammi per chilogrammo di xilazina nel peritoneo di un topo.Monitorare i topi per verificare la profondità dell'anestesia e prevenire la mortalità. Con questa procedura, i topi rimarranno sotto anestesia per 20-30 minuti. Prima del risveglio, iniettare 200 microlitri di soluzione contenente parassiti direttamente nel peritoneo di un topo.Al termine, smaltire la siringa in un contenitore per materiali taglienti. Utilizzando questo metodo, infettare due topi con ciascuno dei due parassiti da incrociare da tre a cinque giorni dopo le iniezioni. I parassiti della fase ematica si svilupperanno nei topi infetti.Tagliare con forbici sterili l'estremit&agrave; della coda del topo dei topi donatori infettati con ceppi parassitari diversi. Raccogliere una goccia di sangue dalla coda del topo su un vetrino e preparare strisci sottili. Colorare lo striscio sottile di sangue con la colorazione di giemsa.Il colorante Guillem SA non colorerà i globuli rossi non infetti a causa delle cellule non infette. La mancanza di un nucleo em SAI colorerà il nucleo del parassita nei parassiti dei globuli rossi infetti; i globuli rossi appaiono sotto forma di stadi a anello, trofozoiti ski ons e maites in rottura. Una volta che l'anemia parassitaria raggiunge dall'1 al 5% in entrambi i topi, i parassiti dello stadio ematico possono essere raccolti per l'infezione con clone misto.Tagliare la punta della coda del topo nei topi donatori infettati con i diversi parassiti. Strizzare con forbici sterili come descritto in precedenza. Raccogliere un microlitro di sangue dalla coda del topo utilizzando una capillare di vetro in un millilitro di PBS sterile; utilizzare 20 microlitri della sospensione di sangue per analizzare la densità dei globuli rossi con cell ome.Utilizzando la densità degli eritrociti e le misurazioni para, diluire i campioni di sangue in una soluzione salina citrata fisiologica in modo da ottenere una concentrazione di eritrociti infetti pari a un milione ogni 100 microlitri. Combinare un campione di sangue infetto proveniente dai due donatori in rapporto uno a uno per ottenere un inoculo di clone misto. Successivamente, iniettare 100 microlitri del campione misto nel peritoneo di ciascun topo da infettare.Utilizzare due topi per infezioni con singolo clone, in modo da poter confermare la trasmissione riuscita di ciascun ceppo parentale. Le fasi sessuali del parassita, chiamate gametociti maschili e femminili, dovrebbero iniziare ad apparire nel sangue dei topi circa quattro giorni dopo l'infezione. Iniziare a monitorare i topi quotidianamente per rilevare la comparsa dei gametociti, prelevando sangue dalla coda come descritto in precedenza e preparando strisci sottili ematici dalla coda.I citi maschili e femminili sono riconoscibili a causa della presenza di granuli o pigmenti di grandi dimensioni. Il citoplasma dei citi gato maschili è rosa, mentre il citoplasma dei citi TER femminili è blu. Solo i citi gato maturi presentano una grande vacuolo.Una volta rilevati gli oociti maturi di entrambi i sessi, i topi possono essere utilizzati per nutrire le zanzare. Iniettare 50 microlitri di soluzione anestetica a base di chetamina e xilazina nel peritoneo di ciascun topo infetto. Una volta anestetizzati i topi, posizionarne uno con la pancia verso il basso sulla sommità di una gabbia contenente da 50 a 100 zanzare femmine Anis defense enzyme private dell’alimentazione zuccherina da 24 ore e permettere alle zanzare di nutrirsi per 30 minuti senza interruzioni.Eutanasia umanamente i topi immediatamente dopo il periodo di alimentazione. Se la trasmissione ha successo, nove giorni dopo l'alimentazione, i gametociti assunti dalle zanzare si saranno fusi in zigoti diploidi che maturano in oocisti, visibili nell'intestino medio degli insetti. Maggiore è il numero di oocisti rilevati, maggiori sono le probabilità che siano stati generati parassiti ricombinanti.Utilizzare un aspiratore per raccogliere da cinque a dieci zanzare infette dalla gabbia e trasferire le zanzare in un contenitore piccolo. Anestetizzare le zanzare utilizzando gas anidride carbonica e trasferirle in una capsula di Petri di vetro su ghiaccio. I maschi, le cui antenne sono visibilmente più folte rispetto a quelle delle femmine, devono essere scartati.Riempire due siringhe con PBS ed equipaggiarle con aghi da 26 gauge lunghi mezzo pollice. Depositare circa 100 microlitri di PBS da una siringa su un vetrino. Trasferire da cinque a dieci zanzare femmine anestetizzate sulla goccia di PBS e posizionare il vetrino su un microscopio stereoscopico utilizzando gli aghi.Rimuovere le ali e le zampe di ciascun insetto, quindi tenere l'insetto al torace e all'addome posteriore. Tirare il corpo fino a quando l'intestino medio, un organo simile a una sacca bianca, non viene rilasciato. Staccare l'intestino medio e scartare il resto del corpo durante le dissezioni.Assicurarsi di mantenere umidi i midgut utilizzando il PBS dalle aghi per dissezione. Posizionare un coprioggetto sui midgut una volta completata la dissezione. Esaminare i midgut al microscopio ottico con un ingrandimento di 100 volte.Gli OOS saranno riconoscibili come strutture circolari a parete spessa che si trovano sulla superficie esterna dei midgut. Contare il numero di OOS in ciascun midgut. Diciassette giorni dopo l’assunzione, gli sporozoiti rilasciati dal sistema dovrebbero aver migrato verso le ghiandole salivari delle zanzare, ovvero gli sporozoiti dei parassiti della malaria.Cellule sottili a forma di fuso per raccogliere gli sporozoiti. Per prima cosa, preparare una provetta di raccolta utilizzando forbici pulite. Tagliare il coperchio di una piccola provetta einor da 500 microlitri.Riscaldare la punta di un ago sterile da 19 gauge e forare il fondo del tubo. Riempire un terzo del tubo con parete di vetro per creare un filtro. Inserire il tubo filtro all'interno di un tubo einor più grande da 1,5 millilitri.Una volta che l'apparecchio per filtrazione è pronto, raccogliere e anestetizzare le zanzare come descritto in precedenza. Montare le zanzare a secco per la dissezione come in precedenza ed eliminare le zanzare, le teste, le ali, le zampe e gli addomi. Solo il torace contiene le ghiandole salivari infette.Utilizzando pinzette fini, trasferire il torace in un omogeneizzatore da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di PBS. Omogeneizzare il torace sul ghiaccio per rilasciare gli sporozoiti dalle ghiandole salivari e, mediante una pipetta di vetro, trasferire gli omogenati nell'apparato di filtrazione. Centrifugare il tubo del filtro per 10-20 secondi a 1000 giri al minuto.Dopo aver centrifugato gli omogenati, raccogliere il flusso passante utilizzando una siringa dotata di un ago da 22 a 30 gauge. Iniettare da 100 a 500 microlitri della sospensione di sporozoiti nel peritoneo di un topo. Iniziare a monitorare la parassitemia e la densità dei globuli rossi nei topi a partire da tre giorni dopo l'infezione.Scegliere un topo che presenta una parassitemia compresa tra lo 0,1 e l'1% e i cui globuli rossi infetti contengano principalmente parassiti singoli, come donatore per la procedura di clonaggio. Prelievarne una quantità adeguata di sangue in PBS, diluendo il sangue della coda in una soluzione fredda uno a uno di siero di vitello e soluzione di Ringer per mammiferi, in modo da ottenere una concentrazione compresa tra 0,6 e un globulo rosso infetto ogni 100 microlitri, e conservare l'inoculo sul ghiaccio. Disinfettare il sito di iniezione sulla coda con etanolo per via endovenosa.Iniettare 100 microlitri di sangue infetto diluito in ciascuno dei 100 topi. In questo modo, ogni singolo topo dovrebbe ricevere uno o zero parassiti. In un esperimento di successo, dal 20 al 50% dei topi mostrerà una parassitemia dello 0,1-0,5% all'ottavo giorno.Cinque a sette giorni dopo, analizzare i topi alla ricerca di parassiti in fase ematica esaminando strisci sottili di sangue fissati. I parassiti progenie dell'incrocio possono quindi essere sottoposti a genotipizzazione mediante PCR del DNA, estratto da campioni di sangue della coda, utilizzando marcatori genetici su diversi cromosomi, come microsatelliti e polimorfismi a singolo nucleotide. I parassiti i cui loci genetici indipendenti derivano dalle due linee parentali sono cloni ricombinanti.Il sangue degli animali infettati con parassiti ricombinanti può essere crioconservato per un uso futuro. In un esperimento di successo, dal cinque al dieci per cento dei topi totali avrà prole ricombinante indipendente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre un processo genetico nella malaria.Parassita più mezzo yoi. Questo metodo può essere ugualmente applicabile ad altre specie di parassiti.

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