Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le risposte evocate dalla luce da cellule gangliari geneticamente marcate nella retina isolata del topo. Ciò si ottiene sezionando prima la retina dall'occhio del topo. Il secondo passo della procedura consiste nel trattare la retina con un enzima per rimuovere il vitreo rimanente.

Il terzo passo della procedura consiste nel montare le cellule gangliari della retina con il lato rivolto verso l'alto nella camera di registrazione, montare la camera sul tavolino del microscopio e identificare le cellule gangliari geneticamente marcate. La fase finale della procedura consiste nell'ottenere una registrazione dell'intera cellula gangliare identificata e registrare le risposte evocate dalla luce. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le proprietà funzionali di una cellula gangliare definita, digitano nella retina del topo e definiscono i segnali che trasmette al cervello attraverso registrazioni di patch clamp a singola cellula.

Ciao, mi chiamo Tiffany Schmidt e sono una studentessa laureata in neuroscienze nel laboratorio del Dr.Paulo Ka Fuji presso l'Università del Minnesota. Questa tecnica consente l'identificazione e la registrazione di una popolazione di cellule gangliari definita e geneticamente marcata e la successiva analisi morfologica. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo visivo, come ad esempio il modo in cui diversi sottotipi di cellule gangliari elaborano le caratteristiche chiave degli stimoli visivi prima di eseguire l'intervento chirurgico.

Per rimuovere la retina, il primo compito è quello di mescolare le otto soluzioni necessarie per l'esperimento. Gli ingredienti di tutte le soluzioni utilizzate in questo esperimento sono riportati nel testo di accompagnamento. Trasferire 200 millilitri della soluzione extracellulare in un becher da 250 millilitri per la conservazione della retina.

Mettere la soluzione extracellulare rimanente in un imbuto separatore per la profusione per gravità durante la registrazione. Entrambe queste soluzioni devono essere mantenute sempre sature con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Per visualizzare i dendriti durante l'esperimento, aggiungere un tracciante fluorescente come LOR 5 94 alla soluzione intracellulare.

Se si prevede di eseguire l'immunoistochimica dopo la registrazione dell'intera cellula, aggiungere lo 0,3% di neurobiotina alla soluzione intracellulare. Una volta preparate le soluzioni necessarie, sopprimere un topo per asfissia da anidride carbonica, nucleare il bulbo oculare inserendo delicatamente una pinza angolata numero due dietro l'occhio e sollevando il bulbo oculare. Usa le forbici oftalmologiche per pulire i muscoli extraoculari e per tagliare il nervo ottico.

Posizionare il bulbo oculare in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con soluzione extracellulare. Tagliare la cornea con le forbici oftalmologiche ed estrarre la lente utilizzando una pinza numero cinque. Usa la pinza numero cinque per aprire la sclera e recidere il nervo ottico rimanente nel punto in cui la retina e la sclera si incontrano.

Estrarre delicatamente la retina dalla conchiglia oculare facendo scorrere la pinza nello spazio tra la retina e la sclera. Per risparmiare tempo, esegui ogni passaggio su entrambe le retine Prima di passare al passaggio successivo, un passaggio cruciale è rimuovere il vitreo attaccato alla retina. Inizia usando il forcipe per afferrare il vitreo trasparente sopra la retina.

Se il vitreo viene rimosso con successo, vedrai una piccola sostanza gelatinosa chiara sulla punta della pinza. Taglia ogni retina a metà per massimizzare la quantità di tessuto utilizzabile e per facilitare il montaggio della retina nella camera di registrazione. Posizionare le retine nella soluzione extracellulare ossigenata a temperatura ambiente e ridurre al minimo l'esposizione alla luce lasciando solo una minima luce ambientale, come la luce degli schermi dei computer, le retine rimangono vitali per circa sei ore.

Dopo la dissezione, prelevare 500 microlitri della soluzione extracellulare dalla soluzione in cui le retine in eccesso stanno gorgogliando. Diluire in esso. Un'aliquota della soluzione dell'enzima collagenasi ialuronidasi.

Mettere la soluzione enzimatica in una capsula di Petri da 35 millimetri e trasferire una delle retine sezionate nel Petri. Ruotare la capsula di Petri per 15 minuti per tutto il tempo, fondendo delicatamente il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica nella soluzione. La soluzione enzimatica rimuove il vitreo residuo e consente un accesso più facile allo strato di cellule gangliari Per le retine di animali più giovani con meno vitreo, o se si osservano effetti avversi, la digestione può essere ridotta a cinque minuti.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata. Rimuovere la retina dal terreno contenente l'enzima. Lavare abbondantemente la retina in soluzione extracellulare.

Trasferire la retina nella camera di registrazione. Con lo strato di fotorecettori rivolto verso il basso, rimuovere il liquido rimanente con una pipetta o un fazzoletto e stendere i lati della retina per appiattire il tessuto. Facendo attenzione a toccare solo i bordi della retina e non lo strato di cellule ganglionari.

Per ancorare la retina, posizionare un anello di platino con rete di nylon sopra la retina, quindi riempire immediatamente la camera con soluzione extracellulare. Montare la camera di registrazione sul tavolino del microscopio e quindi collegare il tubo per la perfusione per gravità della soluzione extracellulare, il tubo di aspirazione a vuoto e il filo di terra. Regola la gravità in modo che goccioli a un millilitro al minuto o più velocemente.

Se la velocità di perfusione è troppo lenta, il tessuto non sarà sufficientemente ossigenato e la segnalazione sinaptica potrebbe essere interrotta. Il passaggio successivo consiste nell'impostare l'elettrodo per la registrazione di patch a celle intere. Selezionare una pipetta con una resistenza compresa tra tre e cinque mega ohm.

Riempire la pipetta di registrazione con un'aliquota scongelata di soluzione intracellulare e inserirla nel portapipetta utilizzando l'illuminazione a infrarossi e il contrasto interferenziale differenziale o l'ottica DIC sotto un obiettivo 10x. Visualizza la retina e la pipetta di registrazione. La luce infrarossa viene utilizzata per ridurre al minimo l'esposizione della retina alla luce visibile e per ridurre al minimo l'adattamento alla luce, passare a un obiettivo 40x e portare l'elettrodo in vista appena sopra il tessuto.

La linea murina utilizzata in questo studio esprime EGFP nelle sue cellule ganglionari, e quindi le cellule gangliari sono visibili sotto epifluorescenza. La microscopia illumina la retina con epifluorescenza a 480 nanometri. Se la retina è sana, le singole cellule gangliari dovrebbero essere visibili.

Le retine malsane avranno grandi nuclei granulari e dovrebbero essere scartate. Selezionare una delle cellule gangliari fluorescenti per la registrazione e utilizzare il nastro adesivo da laboratorio per contrassegnare la cellula selezionata sul monitor del computer. Passa all'ottica a infrarossi in modo che il corpo della cellula gangliare selezionata sia visibile.

Posizionare l'elettrodo di registrazione vicino alla cella gangliare desiderata. Pulire immediatamente l'area che copre la cella applicando una leggera pressione positiva alla registrazione. La pressione dell'elettrodo viene applicata tramite una siringa di plastica da 12 cc collegata al portapipetta con tubo in polietilene sullo zero dell'amplificatore.

Eventuali offset di tensione. Posizionare l'elettrodo sulla cella gangliare selezionata fino a quando non appare una fossetta sulla superficie della cella. Con l'amplificatore in modalità voltage clamp, applicare un impulso di prova e monitorare la corrente che passa attraverso la pipetta.

Applicare una pressione negativa per creare una tenuta tra l'elettrodo e la cella. Rilasciare la pressione negativa quando la guarnizione inizia a formarsi e attendere che la corrente di mantenimento sia indicativa di una giga tenuta elettrica tra la membrana della cella e la pipetta. Applicare impulsi delicati di pressione negativa fino a quando non compaiono transitori capacitivi che indicano che è stata ottenuta la modalità di registrazione dell'intera cella, quindi rilasciare qualsiasi applicazione di pressione.

Se la resistenza di accesso è superiore a 30 mega ohm, questa può spesso essere migliorata da ulteriori impulsi molto delicati di pressione negativa. Dopo aver ottenuto la modalità cella intera, spegnere la luce infrarossa e coprire il microscopio con un panno nero. Lasciare che la cella si adattili all'oscurità per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, la preparazione è pronta per la registrazione. In modalità current clamp, attivare la stimolazione a luce bianca a campo intero e registrare la risposta della cellula ganglionaria. Se la cellula gangliare deve essere stimolata più volte, la retina deve essere lasciata scurire e adattarsi secondo necessità tra le stimolazioni.

Lo stimolo luminoso può anche essere modificato a questo punto per includere stimoli patternati o cromatici al fine di valutare le proprietà di risposta delle cellule gangliari dopo la registrazione, il tracciante fluorescente nella soluzione intracellulare si sarà diffuso ai dendriti passando dall'epifluorescenza all'ottica infrarossa DIC. Il tracciante può essere visualizzato sotto epifluorescenza a 594 nanometri ed è possibile esaminare i dendriti per determinare se la cellula gangliare è accesa o stratificata. La neurobiotina che è stata aggiunta alla soluzione intracellulare si è diffusa nella cellula ganglionaria, e quindi il passo successivo è quello di preparare la retina per l'immunoistochimica.

Ritrarre delicatamente la pipetta in modo da ridurre al minimo l'interruzione della membrana cellulare. Si noti che se si registra e si riempie solo una cellula gangliare retinica per preparazione, è possibile stabilire correlazioni specifiche tra la cellula gangliare registrata e la sua morfologia dettagliata. Quindi, posizionare la retina nella soluzione di aldeide Paraform e fissare per una notte a quattro gradi Celsius dopo la fissazione durante la notte.

Sciacquare la retina fissa in PBS effettuando almeno sei cambi di soluzione PBS nel corso di due o più ore. Dopo il risciacquo, trasferire la retina in una piastra contenente soluzione bloccante, mettere la piastra su uno shaker e lasciarla riposare per due ore. A temperatura ambiente, sostituire la soluzione bloccante con la soluzione anti-streptococco e rimettere la retina sullo shaker e lasciarla incubare per due giorni a quattro gradi Celsius.

Dopo due giorni, sciacquare la retina in PBS facendo sei risciacqui di 20 minuti ciascuno per montare la retina. Posizionarlo con il lato della cellula gangliare rivolto verso l'alto su un vetrino utilizzando lo scudo vettoriale. Montaggio del coperchio del supporto con un coperchio in vetro, slittamento e sigillatura con smalto per unghie, la cellula gangliare marcata può ora essere osservata al microscopio confocale.

Questa figura mostra le cellule gangliari retiniche positive alla GFP visualizzate sotto illuminazione fluorescente epi con ingrandimento di 40 volte a sinistra e sotto illuminazione DIC a destra. Se la retina è sana e la dissezione ha avuto successo, le singole cellule gangliari sono visibili sotto DIC ad alto ingrandimento. Le retine malsane avranno grandi nuclei granulari e dovrebbero essere scartate.

Questa figura mostra il tipo di risposta alla luce tipica di un M due sulla stratificazione di cellule gangliari retiniche intrinsecamente sensibili alle foto. A seconda del tipo di cellula gangliare retinica geneticamente marcata in una data preparazione, le proprietà di risposta differiranno. Se la risposta sinaptica di una data cellula gangliare è intatta, allora la cellula dovrebbe rispondere all'inizio della luce o sfalsata con potenziali d'azione.

E nel caso di una cellula gangliare intrinsecamente fotosensibile, una depolarizzazione sostenuta, questa figura di una cellula gangliare riempita di neurobiotina mostra la morfologia di una tipica cellula gangliare retinica stratificata M1 e intrinsecamente fotosensibile. Dopo la registrazione di cellule intere, l'immunoistochimica consente una correlazione della morfologia dendritica e della risposta elettrofisiologica della cellula gangliare retinica. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di ossigenare bene la retina e di perfondere rapidamente il tessuto per preservare le risposte sinaptiche.

Grazie per aver guardato questa dimostrazione.