Una preparazione isolati retina per registrare Risposta Luce da Geneticamente etichetta cellule gangliari della retina

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte evocate dalla luce da cellule gangliari etichettate geneticamente nella retina isolata del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando la retina dall'occhio del topo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trattare la retina con un enzima per rimuovere il vitreo residuo.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel montare la retina con il lato delle cellule gangliari verso l'alto nella camera di registrazione, fissare la camera sul palchetto del microscopio e identificare le cellule gangliari marcate geneticamente. L'ultimo passaggio della procedura è ottenere una registrazione in modalità whole cell della cellula gangliare identificata e registrare le risposte evocate dalla luce. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le proprietà funzionali di un determinato tipo di cellula gangliare nella retina del mouse e definire i segnali che essa trasmette al cervello mediante registrazioni con patch clamp su singola cellula.

Ciao, mi chiamo Tiffany Schmidt e sono una studentessa laureata in neuroscienze nel laboratorio del Dott. Paulo Ka Fuji presso l'Università del Minnesota. Questa tecnica consente l'identificazione e la registrazione da una popolazione definita di cellule gangliari geneticamente marcate e successiva analisi morfologica. Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della visione, come il modo in cui sottotipi diversi di cellule gangliari elaborano caratteristiche chiave degli stimoli visivi prima di eseguire l'intervento chirurgico.

Per rimuovere la retina, il primo passo consiste nel preparare le otto soluzioni necessarie per l'esperimento. Gli ingredienti di tutte le soluzioni utilizzate nell'esperimento sono indicati nel testo allegato. Trasferire 200 millilitri di soluzione extracellulare in un becher da 250 millilitri per la conservazione della retina.

Collocare la soluzione extracellulare rimanente in un imbuto separatore per la perfusione per gravità durante la registrazione. Entrambe queste soluzioni devono essere mantenute saturate con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica in ogni momento. Per visualizzare i dendriti durante l'esperimento, aggiungere un tracciante fluorescente come LOR 5 94 alla soluzione intracellulare.

Se si prevede di eseguire un'immunohistochimica dopo la registrazione da cellula intera, aggiungere lo 0,3% di neurobiotina alla soluzione intracellulare. Una volta preparate le soluzioni necessarie, si eutanasia un topo mediante asfissia da anidride carbonica, si enuclea il bulbo oculare inserendo delicatamente una pinza angolata numero due dietro l'occhio e sollevando il bulbo oculare. Utilizzare forbici oftalmiche per rimuovere i muscoli estrinseci dell'occhio e per recidere il nervo ottico.

Posizionare il bulbo oculare in una piastra di Petri da 35 millimetri riempita con soluzione extracellulare. Rimuovere la cornea con forbici oftalmiche ed estrarre il cristallino utilizzando una pinza numero cinque. Utilizzare la pinza numero cinque per aprire la sclera e recidere il nervo ottico residuo nel punto in cui la retina incontra la sclera.

Staccare delicatamente la retina dalla coppa oculare facendo scorrere la pinzetta nello spazio tra retina e sclera. Per risparmiare tempo, eseguire ogni passaggio su entrambe le retine prima di passare al passo successivo; un passaggio fondamentale consiste nel rimuovere il vitreo aderente alla retina. Iniziare afferrando con la pinzetta il vitreo trasparente sopra la retina.

Se il vitreo viene rimosso con successo, si vedrà una piccola sostanza gelatinosa trasparente sulla punta della pinzetta. Tagliare ogni retina a metà per massimizzare la quantità di tessuto utilizzabile e per facilitare il montaggio della retina nella camera di registrazione. Posizionare le retine nella soluzione extracellulare ossigenata a temperatura ambiente e ridurre al minimo l'esposizione alla luce, consentendo solo una luce ambientale minima, come quella proveniente dai monitor dei computer; in queste condizioni, le retine rimangono vitali per circa sei ore.

Dopo la dissezione, prelevare 500 microlitri della soluzione extracellulare dalla soluzione in cui le retine extra sono in ebollizione. Diluire al suo interno un'aliquote della soluzione enzimatica collagenasi-ialuronidasi.

Mettere la soluzione enzimatica in una piastra di Petri da 35 millimetri e trasferire al suo interno una delle retine dissezionate. Ruotare continuamente la piastra di Petri per 15 minuti, soffiando delicatamente sulla soluzione una miscela gassosa al 95% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica. La soluzione enzimatica rimuove qualsiasi residuo di vitreo e facilita l'accesso allo strato delle cellule gangliari. Per retine provenienti da animali più giovani, con minor quantità di vitreo, o in caso di osservazione di effetti avversi, la digestione può essere abbreviata a cinque minuti.

Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica con la punta tagliata, rimuovere la retina dal mezzo contenente l'enzima. Lavare accuratamente la retina con soluzione extracellulare.

Trasferire la retina nella camera di registrazione. Con il livello dei fotorecettori rivolto verso il basso, rimuovere con delicatezza qualsiasi liquido residuo utilizzando una pipetta o un tessuto, quindi arrotolare i bordi della retina per appiattire il tessuto. Avere cura di toccare soltanto i margini della retina e non il livello delle cellule gangliari.

Per fissare la retina, posizionare un anello di platino con una rete di nylon sulla retina e quindi riempire immediatamente la camera con soluzione extracellulare. Montare la camera di registrazione sul palchetto del microscopio, quindi collegare il tubo per la perfusione per gravità della soluzione extracellulare, il tubo di aspirazione sotto vuoto e il filo di massa. Regolare la gravità in modo che la goccia cada a un millilitro al minuto o più velocemente.

Se la velocità di perfusione è troppo lenta, il tessuto non verrà sufficientemente ossigenato e la segnalazione sinaptica potrebbe essere interrotta. Il passaggio successivo consiste nel preparare l'elettrodo per la registrazione in configurazione whole cell. Selezionare una pipetta con una resistenza compresa tra tre e cinque megaohm.

Riempire la pipetta di registrazione con un’aliquota scongelata di soluzione intracellulare e inserirla nel supporto della pipetta utilizzando l’illuminazione a infrarossi e l’ottica a contrasto di interferenza differenziale o DIC con un obiettivo da 10x. Visualizzare la retina e la pipetta di registrazione. La luce a infrarossi viene utilizzata per minimizzare l’esposizione della retina alla luce visibile e per ridurre al minimo l’adattamento alla luce; passare quindi a un obiettivo da 40x e portare l’elettrodo in vista appena sopra il tessuto.

La linea di topi utilizzata in questo studio esprime EGFP nelle sue cellule gangliari, pertanto le cellule gangliari sono visibili mediante fluorescenza episcopica. La microscopia illumina la retina con fluorescenza episcopica a 480 nanometri. Se la retina è sana, dovrebbero essere visibili singole cellule gangliari.

Le retine non sane avranno nuclei grandi e granulari e devono essere scartate. Selezionare una delle cellule gangliari fluorescenti per la registrazione e utilizzare nastro da laboratorio per contrassegnare la cellula selezionata sul monitor del computer. Passare alle ottiche a infrarossi in modo che il corpo cellulare della cellula gangliare selezionata sia visibile.

Posizionare l'elettrodo di registrazione vicino alla cellula gangliare bersaglio. Pulire l'area immediatamente sovrastante la cellula applicando una leggera pressione positiva alla registrazione. La pressione sull'elettrodo viene applicata tramite una siringa di plastica da 12 cc collegata al portapipetta con un tubo di polietilene sull'amplificatore dello zero.

Eventuali offset di tensione. Posizionare l'elettrodo sulla cellula gangliare selezionata fino a quando non appare una piccola depressione sulla superficie cellulare. Con l'amplificatore in modalità voltage clamp, applicare un impulso di prova e monitorare la corrente che passa attraverso la pipetta.

Applicare una pressione negativa per creare un sigillo tra l'elettrodo e la cellula. Rilasciare la pressione negativa quando inizia a formarsi il sigillo e attendere finché la corrente di mantenimento non indichi un sigillo elettrico di gigaohm tra la membrana cellulare e la pipetta. Applicare lievi impulsi di pressione negativa fino a quando non compaiono transitori capacitivi, segnale che è stata ottenuta la modalità di registrazione in intera cellula, quindi rilasciare qualsiasi applicazione di pressione.

Se la resistenza di accesso è superiore a 30 megaohm, ciò può spesso essere migliorato applicando ulteriori impulsi molto delicati di pressione negativa. Una volta ottenuta la modalità whole cell, spegnere la luce infrarossa e coprire il microscopio con un panno nero. Lasciare adattare la cellula al buio per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, il preparato è pronto per la registrazione. In modalità clamp di corrente, attivare la stimolazione luminosa bianca a campo intero e registrare la risposta della cellula gangliare. Se la cellula gangliare deve essere stimolata più volte, la retina deve essere lasciata adattare al buio per il tempo necessario tra una stimolazione e l'altra.

Lo stimolo luminoso può inoltre essere modificato in questa fase per includere stimoli a pattern o cromatici al fine di valutare le proprietà di risposta delle cellule gangliari dopo la registrazione; passando tra la fluorescenza episcopica e l'ottica infrarossa DIC, il tracciante fluorescente nella soluzione intracellulare si sarà diffuso ai dendriti. Il tracciante può essere visualizzato in fluorescenza episcopica a 594 nanometri, e si possono esaminare i dendriti per determinare se la cellula gangliare è di tipo on-off o stratificata. Il neurobiotina aggiunto alla soluzione intracellulare si è diffuso nella cellula gangliare, quindi il passaggio successivo consiste nel preparare la retina per l'immunocitochimica.

Ritrarre delicatamente la pipetta per minimizzare il danneggiamento della membrana cellulare. Si noti che se si registra e si riempie una sola cellula gangliare retinica per preparazione, è quindi possibile effettuare correlazioni specifiche tra la cellula gangliare registrata e la sua morfologia dettagliata. Successivamente, posizionare la retina nella soluzione di paraformaldeide e fissare tutta la notte a quattro gradi Celsius dopo la fissazione notturna.

Lavare la retina fissata in PBS effettuando almeno sei cambi di soluzione PBS nell'arco di due ore o più. Dopo il lavaggio, trasferire la retina in una piastra contenente soluzione bloccante, porre la piastra su un agitatore e lasciarla a riposo per due ore. A temperatura ambiente, sostituire la soluzione bloccante con la soluzione strep evidence, rimettere la retina sull'agitatore e lasciarla incubare per due giorni a quattro gradi Celsius.

Dopo due giorni, risciacquare la retina in PBS eseguendo sei risciacqui di 20 minuti ciascuno per montarla. Posizionarla con il lato delle cellule gangliari rivolto verso l'alto su un vetrino utilizzando il Vector Shield. Coprire con un mezzo di montaggio, applicare un coprioggetto di vetro e sigillare con smalto per unghie; ora la cellula gangliare marcata può essere osservata al microscopio confocale.

Questa figura mostra cellule gangliari retiniche positive per GFP visualizzate in illuminazione fluorescente episcopica a 40 ingrandimenti a sinistra e in illuminazione DIC a destra. Se la retina è sana e la dissezione è stata eseguita correttamente, singole cellule gangliari sono visibili in DIC ad alto ingrandimento. Le retine non sane presenteranno nuclei grandi e granulari e devono essere scartate.

Questa figura mostra il tipo di risposta alla luce tipica di una cellula gangliare retinica fotosensibile intrinseca M due stratificata. A seconda del tipo di cellula gangliare retinica etichettata geneticamente in un determinato preparato, le proprietà della risposta varieranno. Se la risposta sinaptica di una determinata cellula gangliare è integra, la cellula dovrebbe rispondere all'inizio o alla fine dell'illuminazione con potenziali d'azione.

E nel caso di una cellula gangliare intrinsecamente fotosensibile, si osserva una depolarizzazione sostenuta; questa immagine di una cellula gangliare riempita con neurobiotina mostra la morfologia di una tipica cellula gangliare retinica intrinsecamente fotosensibile di tipo M1 con stratificazione in off. Dopo la registrazione in configurazione whole cell, l'immunohistochimica permette di correlare la morfologia dendritica con la risposta elettrofisiologica della cellula gangliare retinica. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordarsi di ossigenare adeguatamente il pozzetto retinico e di perfondere rapidamente il tessuto al fine di preservare le risposte sinaptiche.

Grazie per aver guardato questa dimostrazione.