Valutazione degli effetti neuroprotettivi di un composto di prova contro la tossicità dell'alfa-sinucleina nei neuroni embrionali di ratto

Inizia con una coltura primaria del mesencefalo da embrioni di ratto, contenente neuroni dopaminergici che sovraesprimono l'alfa-sinucleina mutata.

Sostituire il terreno nei pozzetti di trattamento con un terreno nuovo contenente il composto in esame e quello nei pozzetti di controllo con un terreno semplice. Quindi incubare.

Nel controllo, l'alfa-sinucleina forma aggregati tossici nei neuroni dopaminergici, causando la retrazione dei neuriti e portando alla morte neuronale.

Nel trattamento, il composto in esame interagisce con l'alfa-sinucleina, ne impedisce l'aggregazione, preserva la struttura dei neuriti e fornisce neuroprotezione.

Fissare e permeabilizzare le cellule, quindi bloccare i siti di legame non specifici.

Incubare con anticorpi primari per marcare tutti i neuroni, con marcatura aggiuntiva per i neuroni dopaminergici.

Lavare le cellule e aggiungere anticorpi secondari marcati con fluorofori specifici per gli anticorpi primari.

Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita, conta i neuroni dopaminergici marcati in modo differenziale, quindi passa a un microscopio confocale per misurare la lunghezza dei neuriti.

Un numero più elevato di neuroni dopaminergici con neuriti i