Name: Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Impara la crioconservazione di blocchi di tessuto corticale per ottenere culture neuronali primarie di alta qualità. Questo protocollo preserva la vitalità cellulare e supporta la generazione di neuroni, astrociti e precursori neuronali.

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Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti del Programma triennale Opportunità di ricerca presso UCI (AR e SP) e le sovvenzioni da parte dello Stato della California Iniziativa malattia di Alzheimer e il National Institutes of Health non concede. HD38466, e il morbo di Alzheimer Research Center non concede. AG16573 (JB)

1. Crioconservazione di tessuto corticale blocchi Materiale di preparazione <ol><li> Preparare la soluzione salina tampone 1X Hank (HBSS) diluendo in soluzione madre 10X in acqua sterile (1:9). HBSS conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare il 10% medio congelamento DMSO diluendo DMSO in HBSS (1:9). Il mezzo di congelamento dovrebbe essere fresca prima di crioconservazione e conservato a 4 ° C fino a freddo. </li><li> Una lama di rasoio in acciaio viene utilizzato per il taglio sistematico del tessuto. Prima dell'uso, la lama è sterilizzata da immersione in etanolo al 70% per 2 ore. Immediatamente prima della lavorazione dei tessuti, sciacquare la lametta con acqua sterile 3 volte. Evitare di lasciare il rasoio in acqua sterile per una quantità eccessiva di tempo, in quanto è soggetto a ossidazione. </li><li> Un contenitore di congelamento Nalgene viene caricato con cryovials (2,5 ml) e poi portato in un armadio sterile biologica. 1 ml di acqua refrigerata media congelamento è aggiunto ad ogni flacone. Il contenitore congelamento è quindi posto a 4 ° C per almeno 2 ore. </li></ol> Pulizia, Tagliere, e congelamento <ol><li> Il tessuto cerebrale essere congelati viene pulita di membrana meningea e vasi sanguigni. Utilizzare punte ago sterile per rimuovere i detriti con attenzione dal tessuto durante il lavoro in cima ad un impacco di ghiaccio. Tessuti lavabili devono essere risciacquati leggermente con HBSS freddo e trasferito in un nuovo piatto di Petri per tritare. </li><li> Lavorare su di un impacco di ghiaccio, utilizzare una lama di rasoio sterile di tagliare rapidamente il tessuto di circa 1 mm in 3 blocchi. Lavorare con piccole porzioni di tessuto pulito in un momento risultati in un migliore controllo della procedura di taglio, con conseguente blocchi di dimensioni più uniforme. </li><li> Aggiungere lentamente il tessuto tagliato in 50 ml di HBSS in un tubo da 50 ml. Lavare delicatamente la piastra Petri con HBSS al fine di raccogliere tutti i blocchi del tessuto residuo. Lasciare i blocchi di tessuto a scendere sul fondo del tubo, creando un poco compresso tessuto blocco pellet. </li><li> Mentre il tessuto è assestamento, portare il contenitore refrigerato precedentemente congelamento e cryovials nella cabina di sicurezza biologica. Stappare tutti cryovials per accelerare il processo di aggiunta dei tessuti. </li><li> Dopo che tutti i blocchi di tessuto si sono stabiliti, dolcemente aspirare il HBSS in eccesso, lasciando uno strato molto sottile di media al di sopra del pellet. Centrifugazione è sconsigliato in quanto causerà i blocchi del tessuto di aderire gli uni agli altri, diminuendo in modo significativo l'efficienza di congelamento. </li><li> Lentamente raccogliere 200 ul dalla parte inferiore del piede libero tessuto blocco pellet utilizzando punta della pipetta con orifizi larga (taglio punta con forbici sterili). Trasferire il materiale ad una provetta Microbank ™ e passare a quella successiva, il tessuto ancora raccogliere dal fondo del pellet. E 'essenziale che l'intera procedura di assegnazione dei tessuti non prende più di 3-4 minuti per contenitore di congelamento. Questo assicura che il tessuto è esposto a DMSO solo per un breve periodo di tempo prima del congelamento. Dopo aver trasferito il tessuto per le fiale, porre il recipiente freddo-80 ° C in un freezer per almeno 4 ore. In alternativa, il contenitore di congelamento può essere lasciato una notte a -80 ° C. Ripetere la procedura per eventuali contenitori congelamento rimanenti. </li><li> Trasferire il cryovials dal contenitore congelamento (s) ad un cryobox e posto in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> 2. Scongelamento e coltura di blocchi congelati di tessuto corticale Materiale di preparazione <ol><li> Un giorno prima di campioni di tessuto scongelamento, poli-L-lisina rivestito Petri / coprioggetto sono preparati. In generale, per i neuroni corticali prepariamo piatti rivestiti con 500 mg / ml o 1 mg / mL. Aggiungi sufficiente poli-L-lisina soluzione (made in tampone borato) per coprire completamente il fondo del piatto. Se coprioggetto di vetro sono necessari, in modo che siano completamente sommersi sotto la poli-L-lisina soluzione. Incubare per almeno 12 ore. Prima dell'uso, sciacquare i piatti con un buon quantitativo di acqua sterile per 3 volte, 5 minuti ciascuno. </li><li> HBSS calda è usata per pulire il tessuto scongelato e per dissociare il tessuto in sospensioni cellulari. Il volume di HBSS necessari variano a seconda della quantità di tessuto per essere scongelati, ma tipicamente 1 provetta Microbank ™ saranno diluiti in 50 mL di HBSS e sarà dissociato in 10 ml di HBSS. </li><li> Dulbecco Modified Eagle con medie del 10% di ferro integrato bovino siero bovino (EBS) e 1% antibiotici / antimicotici (AA) miscela (DMEM (++)) dovrebbe essere collocato in un bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Medio placcatura (NB (+++)) dovrebbero essere fresco prima dell'uso. Questo terreno è preparato con l'aggiunta di 1% antibiotico / antimicotico più B27 e integratori N2. </li></ol> Nota: i nomi media con l'aggiunta di croci (+) indicano l'aggiunta di additivi per la composizione di base dei media. In questo testo, DMEM (+ +) indica DMEM più 10% più 1% EBS AA, mentre NB (+++) denota NB plnoi l'1% AA più B27 più N2. Scongelamento e coltura <ol><li> Rimuovere il cryovials dal serbatoio di azoto liquido e scongelare rapidamente a 37 ° C a bagnomaria fino a quando solo una piccola pallina di ghiaccio si osserva all'interno del contenuto del flaconcino. </li><li> Delicatamente trasferire il contenuto della fiala da 50 mL HBSS caldo in un tubo conico. Utilizzare una punta larga orifizio per rimuovere delicatamente eventuali blocchi di tessuto residuo bloccato in provetta Microbank ™. Invertire il tubo di 3-4 volte e permettere al tessuto di raccogliere lentamente sul fondo. Tessuto deve risolvere in fretta, ma se i blocchi sono troppo piccoli non possono verificarsi e centrifugazione della luce (~ 200 g) è raccomandato. </li><li> Aspirare HBSS eccesso. </li><li> Aggiungere 10 ml di HBSS caldo al precipitato di tessuto e 300 ml di tripsina 0,25% e 50 ml di DNAase. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 5 minuti, poi posto in un agitatore orbitale impostato a 80 giri e 37 ° C per altri 5 min. </li><li> Dopo questo periodo, portare i blocchi di tessuto in una cappa di sicurezza biologica e utilizzare una pipetta 10 ml per agitare con cura i blocchi dei tessuti fino a una sospensione di cellule nuvoloso è formato. Disattivare la tripsina aggiungendo 10 ml di DMEM caldo (+ +) alla sospensione cellulare. </li><li> Centrifugare le cellule dissociate a 1200 x g per 5 min. Aspirare ed eliminare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM caldo (+ +) e quantificare il numero delle cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Cellule piastra sui piatti rivestiti di poli-L-lisina. In genere, una di 60 mm piatto sarà placcato con 1x10 6 cellule. </li><li> Permettono alle cellule di allegare al piatto / coprioggetto per circa 1 ora nel tessuto culturale incubatore. Si raccomanda di monitorare i progressi di attaccamento in un piatto ogni 10 minuti fino a quando l'attaccamento effettivo. Poi, gentilmente sostituire il mezzo con fresca DMEM (++). </li><li> Dopo 24 ore, sostituire la DMEM (+ +) con caldo NB (+++). Variazioni medie parziali (50%) sono effettuate ogni 5 giorni con fresca NB (+++). Culture sano di solito mostrano segni di differenziazione e di crescita dei processi dopo 24 ore. In queste condizioni, ed effettuando cambiamenti medie parziali ogni 4-5 giorni, le culture può essere mantenuta per periodi di tempo prolungati fino a 4-6 settimane. </li><li> Per la generazione di cellule precursore neuronali (NPC), un protocollo simile è usato con l'eccezione che dopo la centrifugazione, DMEM senza EBS viene utilizzato. Le cellule sono placcati in T-25 palloni DMEM/F12 (1:3) integrata con B27 e EGF (20 ng / ml) per permettere la formazione di neuropheres. Per differenziare i PNG, neurosfere sono placcati in laminina (10 ug / mL) coprioggetto rivestito in DMEM/F12 (1:3) di media integrato con N2. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Culture sani mostrano una significativa crescita e differenziazione dopo 5 giorni dopo lo scongelamento e di solito stabilizzarsi nella sua crescita da 10 giorni (Figura 1). Immuncocytochemical colorazione di queste culture astrociti rivela numerosi (Figura 2A) e neuroni (Figura 2B) per le colture primarie umane e di ratto neuronale. Questo protocollo è adatto anche per la generazione di NPC come free-floating neurosfere (Figura 3A), che in condizioni di differenziazione, risultato in colture miste di alta qualità (Figura 3 B, C). <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Le colture cellulari di tessuti umani congelati corticale. Blocchi congelati di tessuto corticale umano sono scongelati e placcato su vetrini rivestiti di poli-lisina e cresciuto per 10 giorni. Dal giorno 5 di espansione delle cellule è evidente e da giorno 10 confluenza è raggiunto. Scala grafica: 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Colorazione immunocitochimica di colture cellulari. (A) Le culture sono state colorate con la proteina marker gliale fibrillare acida gliale (GFAP, frecce di spessore). (B) I neuroni sono stati rilevati con il marcatore neuronale beta-tubulina III (TIII, frecce sottili). (C) Sia e delle culture umane nel ratto mostrano glia abbondante e neuroni dopo 10 giorni in coltura. Anticorpi primari: topo anti-GFAP (1:1000) e di coniglio anti-TIII (1:1000). Anticorpi secondari: anti-topo Alexa 594 (1:500) e anti-coniglio Alexa 488 (1:500). Nuclei colorazione: blu Hoestch (1:1000). Scala grafica: 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Generazione di neurosfere. (A) tessuto congelato è stato elaborato come descritto in precedenza e ha permesso di propagare come neurosfere. (B) neurosfere sono stati placcati in coprioggetto di vetro in condizioni di differenziazione e cresciuto per 10 giorni, con conseguente migrazione delle cellule dalla neurosfere. (C) Sia i neuroni e astrociti sono presenti ai margini in espansione di un neurosfere di differenziazione. Controcolorazione nucleare, gli anticorpi primari e secondari utilizzati come in Fig. 2.

<ol><li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li>
<li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li>
<li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li>
<li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Crioconservazione offre l&#39;opportunità di campioni di tessuto cerebrale preziosa banca per un uso futuro. Qui si descrive un protocollo semplice ma efficace per generare neuroni sia arricchito di culture e le cellule precursore neuronali da blocchi congelati tessuto cerebrale. Questa procedura evita i costi economici delle tecniche di crioconservazione tradizionali che utilizzano più costosi velocità controllata congelatori. Il protocollo permette la generazione di validi culture neuronali post-scongelamento, fornendo un mezzo rapido ma efficace per congelare i blocchi dei tessuti. L&#39;intero processo di congelamento può prendere così piccolo quanto 20 minuti. In aggiunta alle colture primarie neuronali, utilizzando questo metodo effettua il blocco del tessuto può anche essere scongelati per generare NPC cresciuta come libero neurosfere galleggiante. A questo proposito, la mancanza di siero nel nostro medio congelamento assicura che le cellule sono conservate in uno stato indifferenziato. In condizioni di differenziazione, neurosfere prodotta dall&#39;espansione surgelati mostrano tassi di differenziazione dei tessuti e del tutto paragonabile a neurosfere generate dal tessuto fresco.

<table><tbody><tr><td>Mezzo Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>Glucosio alto 1X</td></tr><tr><td>Siero di vitello bovino integrato</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>Per mezzo di coltura</td></tr><tr><td>Mezzo Neurobasal-A (1X), liquido</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>Supplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Supplemento per mezzo Neurobasal</td></tr><tr><td>Supplemento N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Supplemento per mezzo Neurobasal</td></tr><tr><td>Tripsina (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Dissociazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi 1 dal pancreas bovino (DNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Dissociazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Soluzione salina equilibrata di Hanks (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065</td><td>Pulizia del tessuto, lavaggi e mezzo di congelamento</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina - 500 mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Substrato per l'adesione delle cellule neuronali</td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico (100X), liquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Per prevenire contaminazioni</td></tr><tr><td>Punte di pipetta con orifizio largo (1-200 µl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>Per prevenire lo stress da taglio sulle cellule</td></tr><tr><td>Punte di pipetta graduate (101-1000 µl)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>Aghi guida di precisione 21 G1</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>Per pulire il tessuto</td></tr><tr><td>Pipetta da 10 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Confezionate singolarmente</td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio a tagliente singolo</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>Per tritare il tessuto</td></tr><tr><td>Piatto di Petri in polistirene 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>Per colture generiche</td></tr><tr><td>Piatto di Petri in polistirene 100 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>Per la pulizia del tessuto</td></tr><tr><td>Contenitore criogenico</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>Provette criogeniche da 2,0 ml</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>Per mezzo di congelamento</td></tr><tr><td>Etilene al 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Per sterilizzare la lama del rasoio</td></tr></tbody></table>

crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito culture neuronale

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In questo studio, abbiamo delineare un protocollo standardizzato per la crioconservazione di successo e scongelamento dei blocchi cortical tessuto cerebrale di generare altamente arricchito culture neuronali. Per questo protocollo di congelamento del mezzo utilizzato è del 10% dimetilsolfossido (DMSO) diluito in soluzione salina tampone di Hank (HBSS). Blocchi di tessuto corticale vengono trasferiti cryovials contenenti il ​​mezzo di congelamento e lentamente congelati a -1 ° C / min in un tasso di controllo contenitore di congelamento. Disgelo post-elaborazione e la dissociazione dei blocchi di tessuti congelati costantemente prodotto neuronale arricchito di culture che hanno evidenziato crescita rapida neuritiche durante i primi 5 giorni di cultura e di significativa espansione della rete neuronale entro 10 giorni. Colorazione immunocitochimica con il astrociti proteina marker gliale fibrillare acida (GFAP) e il marcatore neuronale beta-tubulina di classe III, ha rivelato un alto numero di neuroni e astrociti nelle culture. Generazione di colture di cellule neurali progenitrici del tessuto dopo blocco dissociazione portato a rapida espansione neurosfere, che ha prodotto un gran numero di neuroni e astrociti in condizioni di differenziazione. Questo protocollo permette la crioconservazione semplice per una rapida, conservazione efficiente e poco costoso di blocchi di tessuto cerebrale corticale, che concede una maggiore flessibilità per la generazione successiva di culture precursore neuronali, astrociti e cellule neuronali.

Qui, descriviamo un metodo efficiente per la crioconservazione e lo scongelamento dei blocchi di tessuto cerebrale corticale per generare altamente arricchito culture neuronali. Questo semplice protocollo fornisce la flessibilità per la generazione successiva di culture precursore neuronali, astrociti e cellule neuronali.

Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale

In questo studio, descriviamo un protocollo standardizzato per la crioconservazione e il disgelo efficaci di blocchi di tessuto cerebrale corticale per generare altamente...

Ciao, mi chiamo Alan e sono nel laboratorio del Dott. Horney Lu presso l'Università della California di Irvine, nel Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento. E io sono Bob. Oggi, il Dott. Haro vi mostrerà un protocollo rapido, efficiente e affidabile per la crioconservazione di routine di blocchi di tessuto corticale, al fine di ottenere successivamente colture primarie di neuroni di alta qualità.Iniziamo. Il tessuto pulito e tritato viene caricato in provette criogeniche contenenti un mezzo di congelamento al 10% di TMSO.Le provette criogeniche vengono inserite in un contenitore per congelamento e collocate a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Le provette criogeniche congelate vengono quindi trasferite nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per la coltura, la provetta criogenica di AC viene scongelata in un bagno d'acqua calda e risciacquata con HBSS caldo per rimuovere il DMSO residuo.Viene aggiunto HBSS fresco insieme a tripsina per la dissociazione, dopodiché viene aggiunto DMM con 10% EBS. Per arrestare l'attività enzimatica dissociativa, le cellule vengono centrifugate e il pellet viene risospeso in DMM fresco più 10% EBS e seminato in piatti pre-ricoperti con polilisina. Dopo 24 ore, il DMM viene sostituito con un mezzo neurobasale supplementato e le cellule vengono coltivate per 10 giorni.Questo protocollo utilizza una lametta di acciaio per tagliare il tessuto corticale prima dell'uso. La lametta deve essere sterilizzata in etanolo al 70% per almeno due ore. Una soluzione salina tampone di Hank (HBSS) 1x viene preparata diluendo una soluzione madre 10x in acqua sterilizzata; la soluzione HBSS 1x viene quindi conservata sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino all'elaborazione del tessuto.L'ossido di dimetilsolfuro o DMSO viene utilizzato come crioprotettore nel mezzo di congelamento. Questo protocollo prevede una diluizione al 10% in volume/volume di DMSO in H-B-S-S-D-M-S-O uno X, che deve essere mescolato completamente prima di essere conservato a quattro gradi Celsius. Per controllare la velocità di congelamento dei campioni si utilizza un contenitore per congelamento Nalgene.Il contenitore per il congelamento viene caricato con provette criogeniche da 2,5 millilitri che sono state etichettate in precedenza. È anche consigliabile etichettare i contenitori per il congelamento stessi, qualora se ne abbiano più di uno, e annotare il contenitore corrispondente sulla bile. Il mezzo di congelamento con DMSO al 10% precedentemente raffreddato, così come il contenitore per il congelamento, vengono portati all'interno di una cappa biologica sterile.Qui, un millilitro di mezzo crioprotettivo viene aggiunto lentamente a ciascun vial criogenico. Dopo aver verificato che i tappi siano ben chiusi, posizionare il contenitore per il congelamento con i viali a quattro gradi Celsius per almeno due ore, immediatamente prima dell'elaborazione del tessuto. La lametta precedentemente sterilizzata deve essere sciacquata accuratamente. Tre lavaggi di tre minuti ciascuno.L'uso di acqua sterilizzata dovrebbe essere sufficiente per rimuovere qualsiasi etanolo residuo. Questa procedura di lavaggio deve essere rapida poiché il rasoio è soggetto a ossidazione se immerso a lungo in acqua sterile. Prima della pulizia, il tessuto deve essere posizionato su un pacchetto di ghiaccio.Risciacquare leggermente con una X-H-B-S-S fredda per rimuovere eventuali detriti liberi. Aghi sterilizzati vengono utilizzati per pulire i pezzi di tessuto da eventuali membrane residue e vasi sanguigni. È necessario prestare attenzione a preservare l'integrità strutturale del tessuto durante la pulizia.Man mano che ciò aumenta, l'efficienza del taglio del tessuto pulito sarà visibilmente diversa rispetto a quella del tessuto grezzo e dovrebbe presentare la maggior parte delle membrane o dei vasi sanguigni rimossi. Una volta che un tessuto è stato pulito e risciacquato, si può iniziare il taglio. È importante effettuare tagli precisi del tessuto, creando blocchi di dimensioni approssimativamente pari a un millimetro cubo.I blocchi troppo grandi determinano una resa cellulare inferiore al momento della scongelazione. I blocchi più piccoli, tuttavia, devono essere sottoposti a un eccessivo trattamento di lavorazione. Il tessuto tritato può essere raccolto utilizzando una pipetta automatica e un po' di soluzione X-H-B-S-S fredda e isotonica.Assicurarsi di sciacquare la piastra con HBSS per recuperare tutti i tessuti raccolti. Il tessuto viene quindi aggiunto a un grande volume di HBSS 1X e lasciato sedimentare sul fondo, formando un pellet allentato. Questo passaggio elimina eventuali detriti residui presenti durante la sedimentazione del tessuto in HBSS. Recuperare il contenitore per congelamento precedentemente raffreddato e le provette criogeniche prima di distribuire il tessuto.Assicurarsi di togliere il tappo da tutte le provette per accelerare il processo di riempimento del tessuto. L'esposizione al DMSO a temperatura ambiente non deve superare i 10 minuti. È consigliabile lavorare con un contenitore per il congelamento alla volta, fino a quando tutto il tessuto non è stato utilizzato.Iniziare ad aspirare il sopranatante di un tessuto lento, posizionando il cono della pipetta il più vicino possibile al pellet senza disturbarlo. Quindi applicare una punta con orifizio da 200 microlitri a una pipetta. Non utilizzare una punta con orifizio più piccolo, poiché comprometterebbe la struttura dei blocchi che si depositano sul fondo del pellet del blocco di tessuto.Prelevare 200 microlitri di tessuto lentamente. Aggiungere questo tessuto a una provetta criogenica e procedere con la successiva fino a quando tutte le provette non saranno piene. Potrebbe essere necessaria una regola dei 10 minuti.Posizionare rapidamente il contenitore di congelamento nei vial criogenici e inserirli in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per almeno quattro ore o durante la notte, se il tempo è limitato. Dopo un tempo sufficiente, rimuovere il contenitore di congelamento dal congelatore e distribuire i vial criogenici in una scatola criogenica nel minor tempo possibile. Posizionare la scatola criogenica su un supporto all'interno di un contenitore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.Rimuovere una provetta criogenica dall'azoto liquido nel modo più rapido possibile, limitando al minimo l'esposizione delle scatole criogeniche alla temperatura ambiente, che farebbe sciogliere rapidamente il campione immergendolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Mantenere sempre il tappo al di sopra del livello dell'acqua. Controllare frequentemente e continuare lo scongelamento fino a quando si osserva una piccola massa di ghiaccio.Prima di portarla nella cappa di sicurezza, sterilizzare la provetta criogenica con etanolo al 70%. Procedere aggiungendo il tessuto scongelato a un grande volume di HBSS caldo uno X, se del tessuto rimane sulle pareti della provetta criogenica. Raccogliere delicatamente con HBSS.Dopo aver raccolto tutti i tessuti, capovolgere il tubo da tre a quattro volte e lasciare sedimentare il tessuto sul fondo. Questo passaggio garantisce una diluizione sufficiente del DMSO.Una volta che il tessuto si è depositato, aspirare il più possibile il sopranatante. Quindi aggiungere 10 millilitri di H-B-S-S fresco e caldo 1X. Aggiungere 300 microlitri di tripsina al 0,25% e 50 microlitri di DNAasi.Procedere alla dissociazione del tessuto con agitazione delicata, ottenendo una sospensione cellulare torbida dopo il completamento della dissociazione. Arrestare l'attività enzimatica aggiungendo DMEM caldo più siero bovino arricchito al 10% (EPS) ed effettuare la centrifugazione delle sospensioni cellulari a 1200 ×g per cinque minuti. Risospendere il pellet cellulare in DMEM fresco più 10% EBS e seminare su piastre rivestite con polilisina.Lasciare che le cellule si attacchino alle piastre per 30 minuti. Quindi sostituire il mezzo con DM fresco più 10% EBS. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo contenente DM con mezzo neurobasale integrato con N due e B 27 e coltivare per 10 giorni.Abbiamo appena descritto un protocollo vasto, efficiente e affidabile per la comune criopreservazione di blocchi di tessuto corticale. Buona fortuna.

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Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l'espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .

Dissezione del locale Ca2 + segnali in cellule coltivate di targeting per membrana Ca2 + indicatori

Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

Generazione di neurosfere da neuroni ippocampali primari misti e corticali isolati da E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

In questo studio, forniamo una tecnica dettagliata per un sistema di coltura organoide corticale semplice ma robusto che utilizza colture hPSC standard prive di alimentatore. Questo è un protocollo rapido, efficiente e riproducibile per la generazione di organoidi che modellano aspetti della senescenza cerebrale in vitro.

Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro

Uno stock congelato di neuroni pronto all'uso è un potente strumento per valutare le funzioni sinaptiche. Qui, introduciamo una semplice coltura primaria a bassa densità da stock congelati utilizzando una piastra a 96 pozzetti.

Coltura primaria a bassa densità facile e riproducibile utilizzando stock congelati di neuroni ippocampali embrionali

Impara la crioconservazione di blocchi di tessuto corticale per ottenere culture neuronali primarie di alta qualità. Questo protocollo preserva la vitalità cellulare e supporta la generazione di neuroni, astrociti e precursori neuronali.

Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale

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