Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale
11 novembre 2010
Qui, descriviamo un metodo efficiente per la crioconservazione e lo scongelamento dei blocchi di tessuto cerebrale corticale per generare altamente arricchito culture neuronali. Questo semplice protocollo fornisce la flessibilità per la generazione successiva di culture precursore neuronali, astrociti e cellule neuronali.
Ciao, mi chiamo Alan e sono un laboratorio del Dr.Horney Lu presso l'Università della California Irvine nel Dipartimento di Neurobiologia e Comportamento. E io sono Bob. Oggi, il Dr.Haro vi mostrerà un protocollo veloce, efficiente e affidabile per la crioconservazione di routine di blocchi di tessuto corticale per la successiva degenerazione di colture neuronali primarie di alta qualità.
Quindi iniziamo. Il tessuto pulito e tritato viene caricato in fiale criogeniche contenenti un TMSO del 10%. Mezzo di congelamento.
Le fiale criogeniche vengono caricate in un contenitore di congelamento e poste a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per almeno quattro ore. Le fiale criogeniche congelate vengono quindi poste in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per la coltura, la fiala criogenica AC viene sciolta in un bagno di acqua tiepida e risciacquata con HBSS caldo per rimuovere il DMSO rimanente.
L'HBSS fresco viene aggiunto insieme alla prova per la dissociazione, dopodiché viene aggiunto il DMM con il 10% di EBS. Per fermare l'attività enzimatica dissociativa, le cellule vengono centrifugate e il pellet risospeso in DMM fresco più il 10% di EBS e piastrate su piastre di polilisina pre-rivestite. Dopo 24 ore, il DMM è passato a un mezzo neurobasale integrato ed è cresciuto per 10 giorni.
Questo protocollo utilizza una lama di rasoio in acciaio per tritare il tessuto corticale prima dell'uso. Il rasoio deve essere sterilizzato in etanolo al 70% per almeno due ore. Una soluzione salina tamponata HBSS di Hank viene creata diluendo una soluzione madre 10 x in acqua sterilizzata, quella X-H-B-S-S viene quindi mantenuta in ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino alla lavorazione dei tessuti.
L'ossido di dimetilsulfo o DMSO viene utilizzato come crioprotetto nel mezzo di congelamento. Questo protocollo utilizza un volume del 10% e una diluizione del volume di DMSO in un X-H-B-S-S-D-M-S-O dovrebbe miscelarsi completamente prima di essere conservato a quattro gradi Celsius. Nalgene e il contenitore di congelamento vengono utilizzati per controllare il tasso di congelamento dei campioni.
Il contenitore di congelamento è caricato con fiale criogeniche da 2,5 millilitri che sono state precedentemente etichettate. È anche una buona idea etichettare i contenitori di congelamento stessi se ne hai più di uno e annotare il contenitore corrispondente sulla bile. Il DMSO precedentemente raffreddato al 10%, il terreno di congelamento e il contenitore di congelamento vengono portati in una cappa di sicurezza biologica sterile.
Qui un millilitro di terreno di congelamento viene aggiunto lentamente a ciascuna delle fiale criogeniche Dopo essersi assicurati che i tappi siano ben saldi, posizionare il contenitore di congelamento con le fiale a quattro gradi Celsius per almeno due ore appena prima della lavorazione dei tessuti. La lama del rasoio precedentemente sterilizzata deve essere risciacquata accuratamente. Tre, tre minuti di lavaggio.
L'uso di acqua sterilizzata dovrebbe essere sufficiente per rimuovere l'etanolo residuo. Questa procedura di lavaggio dovrebbe essere rapida poiché il rasoio è soggetto a ossidazione a causa dell'immersione prolungata e dell'acqua sterile. Prima della pulizia, un fazzoletto deve essere posizionato su un impacco di ghiaccio.
Risciacquare leggermente con uno freddo X-H-B-S-S per rimuovere eventuali detriti galleggianti. Gli aghi sterilizzati vengono utilizzati per pulire i pezzi di tessuto da eventuali membrane e vasi sanguigni rimanenti. È necessario prestare attenzione per preservare l'integrità strutturale del tessuto durante la pulizia.
Man mano che questo aumenterà, l'efficienza del taglio del tessuto pulito sarà visibilmente diversa da quella del tessuto grezzo e dovrebbe essere rimossa la maggior parte delle membrane o dei vasi sanguigni. Una volta che un fazzoletto è stato pulito e risciacquato, può iniziare il taglio. È importante eseguire tagli netti del tessuto creando blocchi di circa un millimetro cubo.
I blocchi troppo grandi hanno una resa cellulare inferiore allo scongelamento. I blocchi più piccoli, tuttavia, dovrebbero essere evitati anche l'elaborazione eccessiva. Il tessuto tagliato può essere raccolto utilizzando una pipetta automatica e una X-H-B-S-S.
Assicurati di risciacquare il piatto con HBSS per recuperare tutto il tessuto raccolto. Il tessuto viene quindi aggiunto a un grande volume di un X-H-B-S-S e lasciato cadere sul fondo, creando un pellet a pasta larga. In questo modo si puliscono i detriti rimanenti che potrebbero essere presenti mentre il tessuto si deposita nell'HBSS, si recupera il contenitore di congelamento precedentemente raffreddato e le fiale criogeniche prima di allocare il tessuto.
Assicurati di stappare tutte le fiale per accelerare il processo di riempimento del tessuto. L'esposizione al DMSO a temperatura ambiente deve essere limitata a non più di 10 minuti. È una buona idea lavorare con un contenitore di congelamento alla volta fino a quando tutto il tessuto non è esaurito.
Iniziare ad aspirare il supernato di un tessuto sciolto, pellettare il mais il più vicino possibile al pellet senza disturbarlo. Quindi inserire un puntale dell'orifizio largo 200 microlitri in una pipetta. Non utilizzare un orifizio della punta più piccolo in quanto comprometterebbe la struttura dei blocchi che vanno sul fondo del pellet del blocco di tessuto.
Raccogliere lentamente 200 microlitri di tessuto. Aggiungi questo fazzoletto a una fiala criogenica e passa alla successiva fino a riempire tutte le fiale. Potrebbe essere necessaria una regola dei 10 minuti.
Posizionare rapidamente il contenitore di congelamento in fiale criogeniche in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi per almeno quattro ore o durante la notte se il tempo è limitato. Dopo un tempo sufficiente, rimuovere il contenitore di congelamento dal congelatore e allocare le fiale criogeniche in una scatola criogenica il più rapidamente possibile. Posizionare la scatola criogenica in un rack per scatole di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Rimuovere una criofiale dall'azoto liquido il più rapidamente possibile, limitando le crioscatole L'esposizione a temperatura ambiente scioglie rapidamente il campione immergendolo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Tenendo sempre il tappo fuori dall'acqua. Controllare frequentemente e continuare a scongelare fino a quando non si osserva una piccola P di ghiaccio.
Prima di portarlo nell'armadio di sicurezza, sterilizzare la criovile con etanolo al 70%. Procedere ad aggiungere il tessuto di scongelamento a un grande volume di quello caldo X-H-B-S-S se il tessuto rimane sulle pareti del crio vile. Raccolto delicatamente con HBSS.
Una volta raccolto tutto il tessuto. Capovolgere il tubo tre o quattro volte e lasciare che il tessuto si depositi sul fondo. Questo passaggio garantisce una diluizione sufficiente del DMSO.
Una volta che il tessuto si è stabilizzato, aspirare la maggior quantità possibile di super natin. Quindi aggiungi 10 millilitri di uno fresco caldo X-H-B-S-S a questo. Aggiungere 300 microlitri di tripsina allo 0,25% e 50 microlitri di DNA.
Procedere alla dissociazione del tessuto con una leggera agitazione, creando una sospensione cellulare torbida dopo che il tessuto è stato dissociato. Arrestare l'attività enzimatica aggiungendo DM a caldo più il siero bovino arricchito al 10% di sospensioni cellulari di centrifusione EPS a 1200 G per cinque minuti. Risospendere il pellet della cella in DMEM fresco più 10% EBS e placcare su piastre rivestite di polilisina.
Lasciare che le cellule si attacchino ai piatti per 30 minuti. Quindi sostituire il supporto con DM nuovo più 10% EBS. Dopo 24 ore, sostituire i terreni contenuti in DM con terreni neurobasali integrati con N due e B 27 e far crescere per 10 giorni.
Abbiamo appena descritto in dettaglio un protocollo vasto, efficiente e affidabile con una conservazione di routine del pianto dei blocchi di tessuto corticale. Quindi buona fortuna.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la criopreservazione efficiente e lo scongelamento di blocchi di tessuto cerebrale corticale, facilitando la generazione di colture neuronali arricchite. Il protocollo permette la successiva coltivazione di culture neuronali, astrocitiche e di cellule precursori neuronali.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Preservazione dei tessuti
Sfondo
- La criopreservazione è essenziale per mantenere la vitalità del tessuto cerebrale.
- Le tecniche di scongelamento efficienti sono cruciali per una coltura cellulare di alta qualità.
- Le colture neuronali sono vitali per vari studi neurobiologici.
- I protocolli devono garantire un danno minimo all'integrità del tessuto durante l'elaborazione.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo di criopreservazione affidabile per il tessuto corticale.
- Migliorare la resa delle colture neuronali primarie.
- Fornire un protocollo flessibile per generare vari tipi di cellule da tessuto preservato.
Metodi utilizzati
- Preparazione di blocchi di tessuto corticale utilizzando una lama di rasoio sterilizzata.
- Uso del 10% di DMSO nei mezzi di congelamento per la criopreservazione.
- Scongelamento del tessuto in un bagno d'acqua calda per minimizzare la formazione di cristalli di ghiaccio.
- Dissolazione del tessuto scongelato utilizzando tripsina e DNase per la coltura cellulare.
Principali risultati
- Il protocollo preserva con successo la vitalità del tessuto corticale.
- Sono state ottenute colture neuronali di alta qualità dopo lo scongelamento.
- È stata dimostrata la flessibilità nella generazione di diversi tipi di cellule.
- Sono stati stabiliti metodi efficienti per l'elaborazione del tessuto.
Conclusioni
- Il metodo di criopreservazione descritto è efficace per il tessuto cerebrale corticale.
- Questo protocollo può essere adattato per varie applicazioni di coltura neuronale.
- Gli studi futuri possono basarsi su questo metodo per la ricerca neurobiologica avanzata.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized cryopreservation of cortical tissue blocks enables reliable generation of highly enriched neuronal cultures, supporting consistent early discovery and assay development in neurobiology-focused R&D. This protocol increases operational flexibility and resource efficiency by decoupling tissue collection from downstream culture initiation, reducing biological variability and supporting scalable, reproducible workflows. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking robust, bankable sources of primary neuronal and glial cells for target validation and screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent access to high-quality neuronal and astrocyte cultures for mechanistic studies.
- Supports functional target validation by providing reproducible primary cell systems.
- Facilitates biological de-risking through standardized tissue processing and storage.
- Improves predictive confidence in early-stage neurobiology research.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible cell sources for assay standardization and optimization.
- Enables scalable preparation of neuronal cultures for compound screening workflows.
- Supports quantitative readouts and reproducibility across experimental batches.
- Reduces batch-to-batch variability by allowing synchronized culture initiation.
Translational & Preclinical Research
- Facilitates generation of neural precursor cell cultures for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling flexible timing of culture generation.
- Aligns with translational biomarker studies requiring consistent primary cell sources.
- Reduces risk of biological drift in long-term research programs.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation protocol positions tissue banking as a foundational capability from early discovery through preclinical research, enabling on-demand generation of neuronal and glial cultures for diverse R&D needs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis with standardized primary cultures.
- Screening: Provides assay-ready cells for reproducible compound evaluation and quantitative analysis.
- Analytics: Enables consistent measurement of neuritic growth and network expansion across experiments.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker studies using neural precursor-derived cultures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue resource for multiple projects and cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal assays.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and primary cell culture techniques.
- Needs access to controlled-rate freezing equipment and liquid nitrogen storage.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or species.
- Cell yield and viability depend on precise block sizing and handling as described.
