Manipolazione delle cellule della placca neurale attraverso la nanoiniezione in utero in un modello murino embrionale

Metti al sicuro una topolina incinta anestetizzata con l'utero esposto contenente embrioni di pre-neurulazione. In questa fase, la placca neurale è aperta ed esposta direttamente al liquido amniotico.

Posizionare gli embrioni selezionati su una capsula di Petri con una membrana elastica per stabilizzarli. Fissare gli embrioni e applicare soluzione salina per l'idratazione.

Allineare la sonda ecografica sull'embrione e misurare il diametro della cavità amniotica per calcolare il volume di iniezione ottimale.

Posizionare un ago per nanoiniezione contenente una soluzione lentivirale ad alto titolo sopra l'embrione bersaglio con un angolo quasi perpendicolare.

Iniettare un piccolo volume preciso nella cavità amniotica, ritrarre delicatamente l'ago e rimuovere la sonda ecografica.

Spingi delicatamente gli embrioni all'interno del topo.

Il lentivirus iniettato si fonde con le cellule della placca neurale, rilasciando il suo materiale genetico, che subisce la trascrizione inversa nel DNA e viene integrato nel genoma ospite.

Ciò consente una manipolazione genica stabile nelle cellule della placca neurale, supportando potenziali applicazioni terapeutiche.

Usando una pinza, tieni il tessuto tra gli embrioni ed estrai con cautela entrambe le corna uterine dall'addome. Conta e numera gli embrioni, dall'ovaio alla cervice o dalla cervice all'ovaio, su entrambi i lati.

Successivamente, con un batuffolo di cotone umido, spingere delicatamente tutti gli embrioni nella cavità addominale, tranne i primi tre da iniettare. Quindi, posizionare una goccia di PBS su una membrana elastica incollata all'apertura centrale rotonda di una piastra di Petri modificata disponibile in commercio e tenerla immediatamente sopra gli embrioni. Inserire una pinza chiusa nell'incisione dell'elastico, quindi rilasciare la pinza per aprire l'incisione elastica, facendo cadere il liquido sugli embrioni.

Usando una pinza, tirare la sezione dell'utero corrispondente ai tre embrioni attraverso l'elastico e appoggiare delicatamente la capsula di Petri sull'addome del topo. Utilizzando quattro piedini di argilla, fissare e fissare la capsula di Petri sopra l'addome per ridurre la pressione sul topo e ridurre anche la sensibilità dell'imaging alla respirazione e al battito cardiaco del topo. Successivamente, utilizzando una pinza e un batuffolo di cotone umido, regolare l'utero e l'elastico per assicurarsi che l'elastico sia sigillato attorno alla pelle del topo, prevenendo la fuoriuscita di PBS.

Successivamente, per fissare l'utero, premere il cilindro di argilla modellabile verso il basso a destra degli embrioni o dell'utero e aggiungere il PBS alla capsula di Petri fino a quando gli embrioni e l'utero non sono completamente coperti dal PBS. Per facilitare la registrazione delle iniezioni, immergere la sonda ecografica nel PBS e regolare il mouse o il tavolo operatorio in modo che il primo embrione sia allineato con la sonda ecografica. Scansiona tutti e tre gli embrioni e ispeziona le cavità amniotiche.

Quindi, utilizzando l'ecografo, misurare il diametro della cavità amniotica per determinare il volume di iniezione appropriato. Utilizzando il controller di iniezione, impostare i volumi di iniezione determinati e la velocità di iniezione su rallentare, con una velocità di iniezione di 23 nanolitri al secondo. Dopo aver abbassato l'ago nel PBS, utilizzando le ruote principali sul sistema di binari, premere Svuota sul controller del nanoiniettore fino a quando il liquido non raggiunge la punta dell'ago.

Quindi, sollevare l'ago dal PBS e premere Inietta per verificare che venga scaricata una goccia del volume desiderato approssimativo. Abbassare nuovamente l'ago nel PBS e spostare il nanoiniettore con la rotella Y-plane sul micromanipolatore per allineare l'ago con la sonda ecografica e l'embrione. Regolare l'angolo dell'ago con la rotella dell'angolo di iniezione per garantire un angolo di iniezione quasi perpendicolare rispetto alla parete uterina.

Quindi, utilizzando la rotella di iniezione sul micromanipolatore, inserire l'ago nella cavità amniotica con un solo movimento. Se la punta dell'ago scompare dall'immagine ecografica, spostare la sonda in avanti o indietro per riportare l'ago a fuoco. Quindi, iniettare il volume desiderato premendo Inject per il numero appropriato di volte.

Dopo che il volume richiesto è stato iniettato, attendere da 5 a 10 secondi prima di ritrarre l'ago con un movimento delicato.

Quindi, sollevare la sonda ecografica e l'ago dal PBS utilizzando il micromanipolatore, allontanando l'ago dall'operatore per evitare danni e lesioni.

Usando una pinza, rimetti il primo e il secondo embrione nell'addome spingendoli delicatamente attraverso l'elastico.

Dopo che tutti gli embrioni con cavità amniotiche ottimali sono stati iniettati, spingi delicatamente gli embrioni e l'utero nell'addome del topo.