Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la cinetica dell'esportazione nucleare di mRNA nelle cellule di mammifero. Ciò si ottiene mediante la prima micro iniezione di mRNA o DNA nei nuclei delle cellule di coltura dei tessuti dei mammiferi. Dopo la microiniezione, i campioni vengono fissati dopo vari periodi di incubazione.

L'mRNA viene quindi colorato mediante ibridazione fluorescente in situ o pesce. La fase finale della procedura consiste nell'visualizzare le cellule e quantificare la quantità di fluorescenza nel citoplasma e nel nucleo. In definitiva, il tasso di esportazione dell'mRNA può essere misurato attraverso una combinazione di microiniezione e microscopia a fluorescenza.

Ciao, sono SRG AV del laboratorio di Alex Palazzo presso il Dipartimento di Biochimica dell'Università di Toronto. Sono Stefan Toski, anche lui del Palazzo Lab. Sono Amy del laboratorio Palazzo e sono Khi Maha David del laboratorio Palazzo.

Oggi vi mostreremo una procedura per introdurre l'mRNA nei nuclei delle cellule di coltura di tessuti di mammifero mediante microiniezione. Dimostreremo anche come colorare l'mRNA mediante ibridazione fluorescente in C due. Utilizziamo queste procedure nel nostro laboratorio per studiare la cinetica dell'esportazione nucleare di mRNA nelle cellule di mammifero.

Quindi iniziamo. Prima della microiniezione, il DNA plasmatico precedentemente preparato in un tampone per iniezione compreso tra 50 e 200 microgrammi per millilitro. Successivamente, a Oregon Green 4 88 o OG coniugato a 70 kilodalton destrano alla miscela per consentire l'identificazione delle cellule iniettate.

Il destrano coniugato OG aiuterà a determinare la quantità di fluido iniettata nel nucleo e la quantità fuoriuscita nella centrifuga del citoplasma. I campioni a 13.000 G e quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti per pellettare eventuali particelle che potrebbero potenzialmente ostruire la punta dell'ago. Scegliere la linea cellulare di mammifero da microiniettare in base ai criteri descritti nel costo del protocollo scritto.

Sette celle vengono utilizzate per questo seme dimostrativo. Le cellule su coperchio lavato con acido scivolano in piastre di Petri da 30 millimetri almeno 24 ore prima della microiniezione. Idealmente, il monostrato cellulare dovrebbe essere confluente all'incirca dal 70 al 90% al momento dell'iniezione per consentire una facile identificazione delle cellule iniettate, il monostrato cellulare viene ferito prima dell'iniezione utilizzando un puntale per pipetta in plastica da 200 microlitri.

Incidere una ferita incrociata sul vetrino coprioggetti e lasciare che le cellule si riprendano nell'incubatore di coltura tissutale per almeno 15 minuti prima dell'iniezione. Per la microiniezione, utilizzare un microscopio invertito isolato su una tavola d'aria per ridurre al minimo le vibrazioni che possono essere interrotte dal processo di microiniezione. Utilizzando una punta per il caricatore di gel einor, rimuovere circa un microlitro dalla parte superiore del campione di centrifuga per evitare di danneggiare il pellet.

Inserire la punta della pipetta nella parte posteriore di un ago per microiniezione prefabbricato ed espellere il liquido. Il liquido verrà aspirato nella punta dell'ago per azione capillare. Un menisco vicino alla punta dovrebbe essere visibile entro cinque-30 secondi.

Posizionare l'ago pieno di liquido nella bacchetta e fissarlo al micromanipolatore. Con un angolo di 45 gradi, visualizzare l'ago utilizzando l'obiettivo 10 x e posizionarlo al centro del campo visivo vicino al piano focale. Utilizzando le manopole grossolane del micromanipolatore, la bacchetta è collegata da un tubo a una siringa di vetro, che viene utilizzata per generare la pressione necessaria per espellere il fluido dalla punta dell'ago.

Per mantenere una pressione costante, la siringa è montata su una fascetta stringitubo. Utilizzando due tappi di gomma e due morsetti metallici, sollevare l'ago di alcuni millimetri per evitare che venga danneggiato nei passaggi successivi, quindi spingere indietro il microscopio. Colonna, aumentare la pressione premendo lo stantuffo della siringa.

Da 0,5 a due centimetri cubi. Posizionare una capsula di Petri contenente un vetrino coprioggetto con un monostrato ferito. Sul tavolino di visualizzazione, tirare indietro il microscopio.

Pilastro in avanti in posizione verticale in modo che il condensatore sia allineato nello spillo per entrare nel liquido. Questo deve essere fatto con attenzione per evitare che l'ago si rompa sul vetrino coprioggetto. Utilizzando l'obiettivo 10 x, identificare il centro della ferita trasversale e posizionare l'ago sopra le cellule da iniettare.

Aumenta l'ingrandimento passando all'obiettivo 40x. Quindi abbassare e centrare l'ago utilizzando le manopole di regolazione fine nel joystick. Iniziare l'iniezione in un angolo della croce della ferita abbassando l'ago per entrare in contatto con il nucleo.

Una volta iniettata, una cella ha un notevole cambiamento di luminosità di fase. Continuare lungo un bordo della croce avvolta. Per una facile identificazione delle cellule iniettate durante la visualizzazione, è fondamentale che la pressione di iniezione sia regolata correttamente per ciascun ago.

La pressione deve essere abbastanza alta da perforare il plasma e le membrane nucleari, ma non così alta da uccidere le cellule. Micro iniettare le cellule lungo il bordo della ferita per un periodo di tempo fisso. Con la pratica, durante questo intervallo possono essere iniettate diverse centinaia di cellule.

Se si inietta il DNA plasmatico, incubare le cellule microiniettate a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per 20 minuti prima della fissazione, quindi terminare la trascrizione. Trattando le cellule con un microgrammo per millilitro alfa, una mantina si è disciolta nei mezzi di crescita. Questa concentrazione inibisce efficacemente la trascrizione dai micro plasmidi iniettati.

Rimetti le cellule nell'incubatore e consenti alle cellule di esportare l'mRNA appena sintetizzato. Un singolo ago può essere riutilizzato per iniettare più vetrini coprioggetto. Anche se l'ago deve essere sostituito quando il tipo di DNA o RNA che viene microiniettato è cambiato.

Inoltre, una volta rimosso l'ago dalla bacchetta, deve essere smaltito per ottenere una misurazione accurata della cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA. I campioni separati devono essere fissati a zero minuti, 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Dopo il trattamento con alfa manina al momento opportuno, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule due volte in due millilitri di soluzione di PBS.

È importante mantenere umidi i vetrini coprioggetti riducendo al minimo il tempo in cui non vengono immersi nel liquido. Fissare le cellule aggiungendo due millilitri di aldeide al 4% in PBS, incubare le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i campioni fissati altre due volte, permeare le cellule con due millilitri di Triton X 100 allo 0,1% in PBS, incubare nuovamente le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.

Infine, lavare i campioni altre due volte per preparare i campioni per l'ibridazione. Lavare le cellule due volte con un tampone di lavaggio di una soluzione XSSC contenente dal 25 al 60% di forma media. Quindi preparare la camera di colorazione per l'ibridazione coprendo il fondo di una piastra di Petri da 150 millimetri con acqua e facendo galleggiare sopra un pezzo di paraforma.

Rimuovere l'acqua capovolgendo il piatto, permettendo così al paraforma di aderire al fondo del piatto. Rimuovere manualmente eventuali bolle d'aria per ogni vetrino coprioggetto da macchiare. Pipettare 100 microlitri di gocce della soluzione di ibridazione sulla paraforma.

Si noti che la quantità di forma dovrebbe essere ottimizzata per il particolare professionista del pesce utilizzato con l'aiuto di una pinza. Rimuovere un vetrino coprioggetto con le celle fisse dalla piastra di Petri da 30 millimetri. Utilizzando la carta da filtro watman, asciugare il retro del vetrino coprioggetti e rimuovere il tampone in eccesso dal lato anteriore senza asciugare le celle.

Quindi posizionare il vetrino coprioggetti a faccia in giù sulla soluzione di pesce. Ripetere questa procedura per ogni vetrino coprioggetto. Dopo aver riposizionato il coperchio delle camere di colorazione, incubare i campioni per cinque-18 ore a 37 gradi Celsius.

Preparare diverse camere di lavaggio nello stesso modo in cui la camera di colorazione è stata preparata per ogni vetrino coprioggetti, pipettare un millilitro di tampone di lavaggio sulla paraforma della camera di lavaggio. Dopo l'incubazione, rimuovere i vetrini di copertura dalla camera di colorazione pipettando un millilitro di tampone di lavaggio. Accanto al vetrino coprioggetti, il liquido deve essere aspirato sotto ogni campione mediante azione capillare.

Quindi rimuovere i vetrini coprioggetti con una pinza e posizionarli su una goccia di tampone di lavaggio incubato a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare ogni vetrino coprioggetto altre due volte per un totale di tre lavaggi per ogni vetrino coprioggetti, pipettare da 10 a 30 microlitri di soluzione di montaggio con dappy su un vetrino precedentemente lavato. Ogni vetrino può ospitare due vetrini coprioggetto utilizzando una pinza e carta da filtro watman.

Asciugare il retro dei vetrini coprioggetti e rimuovere il liquido in eccesso dal lato anteriore del vetrino coprioggetti senza asciugare i campioni. Posizionare ogni vetrino coprioggetto a faccia in giù su una goccia di soluzione di montaggio. I campioni montati possono essere conservati a quattro gradi Celsius.

Qui gli effetti dell'alfa mantina sulla trascrizione del DNA plasmatico iniettato hanno mostrato NIH tre cellule T tre fibroblasti, che sono state pretrattate con concentrazioni variabili di alfa mantina. Sono stati iniettati con TFL s delta i, DNA plasmidico e OG coniugato 70 chilogrammi e destrano. Ogni riga corrisponde a un singolo campo visivo visualizzato per l'oRNA di destrano OG 70 kilodalton e T uts delta I.

È evidente che alte concentrazioni del farmaco hanno inibito completamente la produzione del trascritto T UTS delta I, mentre ciò non è stato osservato a concentrazioni più basse. Mostrato. Ecco un andamento temporale del costo dell'esportazione nucleare di mRNA. Sette cellule sono state iniettate con DNA plasmatico T UTS delta i e OG coniugato con 70 kilodalton destrano.

30 minuti dopo l'iniezione le cellule sono state trattate con alfa mantina e incubate a 37 gradi Celsius per zero minuti, 60 minuti e 120 minuti. Le cellule sono state quindi fissate e colorate con una sonda contro l'mRNA T UTS delta I. E con gli anticorpi contro il marcatore ER trappola alfa, ogni riga corrisponde a un singolo campo di cellule.

Per informazioni su come quantificare l'esportazione di mRNA, si prega di fare riferimento al testo online qui. Il punto temporale di 120 minuti è stato ingrandito Per dimostrare la colocalizzazione dell'mRNA TFS delta I nell'er, viene mostrata una sovrapposizione dell'mRNA T UTS delta I in verde e della trappola alfa in rosso. Le informazioni su come colorare l'mRNA con le proteine sono disponibili nel testo online.

Ti abbiamo appena mostrato come misurare la cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA mediante microiniezione. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che una microiniezione di successo richiede una preparazione adeguata. I passaggi chiave come il DNA e l'RNA, la preparazione del campione, l'estrazione degli aghi, l'allineamento dell'apparecchiatura ottica e la risoluzione dei problemi della microiniezione sono descritti nel nostro protocollo scritto.

Quando si esegue l'imaging e l'analisi dell'mRNA microiniettato, è importante che la quantificazione sia limitata alle cellule che hanno ricevuto più del 90% del fluido iniettato nel nucleo. Un'iniezione nucleare riuscita può essere valutata visualizzando la distribuzione del destrano verde d'organo nel nucleo e nel citoplasma. Si prega di fare riferimento al nostro protocollo online per ulteriori informazioni sulla progettazione di sonde fish e sull'utilizzo di software di analisi delle immagini per analizzare la distribuzione dell'mRNA nel citoplasma nel nucleo.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.