Name: Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Impara a misurare la cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero mediante microiniezione e ibridazione in situ fluorescente. Questo metodo consente la quantificazione precisa del trasporto dell'mRNA dal nucleo al citoplasma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Gomes E. per consigli utili e A. Wilde per averci permesso di utilizzare attrezzature varie. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di AFP dal Canadian Institute for Health Research (FRN 102725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microiniezione è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare una serie di diversi processi cellulari. A differenza di transfezione delle cellule convenzionali, microiniezione consente al ricercatore di introdurre efficacemente gli acidi nucleici all&#39;interno dei nuclei cellulari in tempi molto stretti. Come risultato, si può eseguire analisi cinetiche come determinare il tasso di esportazione mRNA, localizzazione mRNA, e la sintesi proteica. Inoltre, poiché il periodo dell&#39;esperimento è relativamente breve, si può esporre le cellule di composti tossici in intervalli di tempo brevi, senza incorrere in effetti pleiotropici. Inoltre, composti inibitori o stimolatori, come dominante negativo proteine, può essere co-iniettata con gli acidi nucleici. Infine, microiniezioni evitare il requisito per i reagenti di trasfezione, che spesso sono tossici per le cellule e possono turbare diverse funzioni cellulari. mRNA vs iniezioni di DNA plasmidico La scelta di quale acido nucleico per iniettare dipenderà da una serie di considerazioni. Dopo l&#39;iniezione plasmide DNA, l&#39;RNA polimerasi II non solo sintetizza mRNA, ma anche fattori recluta proteine ​​per la trascrizione nascente 12,13. Dal momento che questi fattori governano gli eventi come l&#39;elaborazione di mRNA, l&#39;esportazione nucleare e di localizzazione citoplasmatica, iniezioni di DNA plasmidico può essere utilizzato per valutare come la trascrizione è accoppiata a processi a valle. Anche se la trascrizione può essere accoppiato ad esportare nucleare 14, abbiamo trovato che l&#39;mRNA iniettata viene esportato un po &#39;più veloce in vivo mRNA trascritto 6. Le ragioni di ciò non sono chiare al momento, ma questo risultato potrebbe suggerire che come l&#39;mRNA di nuova sintesi emerge dalla RNA polimerasi II, può essere legato a complessi che ritardano l&#39;esportazione nucleare. Ci sono alcuni vantaggi con iniezioni mRNA. In primo luogo, il ricercatore non deve usare gli inibitori della polimerasi RNA, che potrebbe incidere come le cellule regolano il metabolismo generale di RNA. In secondo luogo, l&#39;RNA può essere modificato in vitro prima dell&#39;iniezione. Per esempio, mRNA può essere sintetizzato con le varie 5 &#39;analoghi cappuccio o poli (A) lunghezze di coda al fine di valutare come queste caratteristiche influiscono esportazione nucleare 6. In terzo luogo, l&#39;esatta quantità di RNA che viene iniettato può essere approssimativamente stimato. Seguendo il protocollo di cui sopra, si stima che circa 20.000 a 50.000 molecole vengono iniettati in ogni nucleo, che è relativamente piccolo rispetto al numero totale di trascrizioni in una tipica cellula di mammifero (400.000 a 850.000 molecole) 15. Il principale svantaggio con iniezioni di mRNA è che durante la microiniezione, qualche perdita di liquido ad iniezione nel citoplasma è inevitabile. Dal momento che l&#39;mRNA iniettato direttamente nel citoplasma è stabile per lunghi periodi (A. Palazzo, osservazione inedito), particolare attenzione deve essere presa per selezionare quali cellule sono quantificati. Generalmente si analizzano le cellule che hanno ricevuto&gt; 90% del fluido di iniezione nel nucleo, valutato mediante la distribuzione di OG-destrano.

<table><tbody><tr><td>Tampone di iniezione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl e 10 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Destrano Oregon Green 488-70kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Una soluzione madre di 10 mg/ml nel tampone di iniezione può essere conservata a lungo a -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Capillari in borosilicato</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta per caricare gli aghi di iniezione</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per iniezione</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>Tampone PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Tampone SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM citrato di sodio, pH 7.4</td></tr><tr><td>Paraformaldeide al 4%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>Una soluzione madre di paraformaldeide al 37% viene diluita in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100 allo 0,1% (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>Una soluzione madre di Triton X-100 al 10% viene diluita in PBS</td></tr><tr><td>Formammide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di destrano</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Complesso ribosidico di vanadile (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Carta filtrante Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrazioni</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasi RNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasi poli(A)</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di ibridazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/ml solfato di destrano, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM citrato di sodio, 0,5 mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, 60% formammide</td></tr></tbody></table>

analisi della cinetica di esportazione mrna nucleare in cellule di mammifero da microiniezione

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

Negli eucarioti, RNA messaggero (mRNA) è trascritto nel nucleo e devono essere esportati nel citoplasma per accedere al macchinario di traduzione. Anche se l&#39;esportazione nucleare di mRNA è stata ampiamente studiata in ovociti di Xenopus 1 e gli organismi geneticamente docile come lievito 2 e la linea cellulare derivata Drosophila S2 3, pochi studi erano stati condotti in cellule di mammifero. Inoltre, la cinetica di esportazione mRNA in cellule somatiche dei mammiferi poteva solo essere dedotta indirettamente 4,5. Per misurare la cinetica esportazione nucleare di mRNA nelle cellule di mammifero coltura tissutale, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiata con ibridazione in situ fluorescente (FISH). Questi test sono stati utilizzati per dimostrare che in cellule di mammifero, la maggior parte degli mRNA vengono esportati in modo splicing dipendente 6,7, o in modo che richiede specifiche sequenze di RNA come la regione sequenza segnale di codifica (SSCR) 6. In questo saggio, le cellule sono microiniettati sia con mRNA sintetizzato in vitro o DNA plasmide contenente il gene di interesse. Le cellule vengono incubate per microiniettati vari momenti poi fissa e la localizzazione sub-cellulare di RNA è valutata mediante FISH. A differenza di transfezione, dove la trascrizione avviene alcune ore dopo l&#39;aggiunta di acidi nucleici, la microiniezione di DNA o mRNA permette di espressione rapida e consente la generazione di precisi dati cinetici.

Qui si descrive un metodo che utilizza la potenza di microiniezione accoppiato con fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; al fine di misurare con precisione la cinetica esportazione nucleare di mRNA nelle cellule somatiche dei mammiferi.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

Negli eucarioti, l'RNA messaggero (mRNA) viene trascritto nel nucleo e deve essere esportato nel citoplasma per accedere al macchinario di traduzione. Sebbene...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero. Questo viene ottenuto microiniettando prima mRNA o DNA nei nuclei di cellule in coltura tissutale di mammifero. Dopo la microiniezione, i campioni vengono fissati a seguito di diversi periodi di incubazione.L'mRNA viene quindi colorato mediante ibridazione fluorescente in situ o FISH. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'acquisire immagini delle cellule e quantificare la quantità di fluorescenza nel citoplasma e nel nucleo. In definitiva, la velocità di esportazione dell'mRNA può essere misurata attraverso una combinazione di microiniezione e microscopia fluorescente.Ciao, sono SRG AV dal laboratorio di Alex Palazzo del Dipartimento di Biochimica dell'Università di Toronto. Sono Stefan Toski, anch'io del laboratorio Palazzo. Sono Amy del laboratorio Palazzo e sono Khi Maha David del laboratorio Palazzo.Oggi vi mostreremo un procedimento per introdurre mRNA nei nuclei di cellule di colture cellulari di mammifero mediante microiniezione. Inoltre, dimostreremo come colorare l'mRNA mediante ibridazione fluorescente in C due. Utilizziamo questi procedimenti nel nostro laboratorio per studiare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA nelle cellule di mammifero.Iniziamo. Prima della microiniezione, preparare il DNA plasmidico in tampone di iniezione a una concentrazione compresa tra 50 e 200 microgrammi per millilitro. Successivamente, aggiungere al mix Oregon Green 488 o OG coniugato con destrano da 70 chilodalton per consentire l'identificazione delle cellule iniettate.Il destrano coniugato con OG aiuterà a determinare la quantità di fluido iniettata nel nucleo e quella fuoriuscita nel centrifugo citoplasmatico. Centrifugare i campioni a 13.000 G e quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti per formare un pellet di qualsiasi materiale particolato che potrebbe ostruire la punta dell'ago. Scegliere la linea cellulare di mammifero da microiniettare in base ai criteri descritti nel protocollo scritto riguardo ai costi.Sette cellule vengono utilizzate per questo seme dimostrativo. Le cellule vengono posizionate su coprioggetti lavati con acido in piastre di Petri da 30 millimetri almeno 24 ore prima della microiniezione. Idealmente, il monostrato cellulare dovrebbe essere approssimativamente dal 70 al 90% confluenziale al momento dell'iniezione, per consentire una facile identificazione delle cellule iniettate; il monostrato cellulare viene ferito prima dell'iniezione utilizzando una punta di pipetta di plastica da 200 microlitri.Incidi una croce sulla lamellina e lascia le cellule riprendersi nell'incubatrice per colture cellulari per almeno 15 minuti prima dell'iniezione. Per la microiniezione, utilizza un microscopio invertito isolato su un tavolo antivibrante per ridurre al minimo le vibrazioni che potrebbero interferire con il processo di microiniezione. Utilizzando una punta da gel loader einor, preleva circa un microlitro dalla parte superiore del campione centrifugato per evitare di disturbare il pellet.Inserire la punta della pipetta nell'estremit&agrave; posteriore di un ago per microiniezione prefabbricato ed espellere il liquido. Il liquido verr&agrave; aspirato nella punta dell'ago per azione capillare. Entro cinque-trenta secondi dovrebbe essere visibile un menisco vicino alla punta.Inserire l'ago riempito di liquido nel supporto e fissarlo al micromanipolatore. A un angolo di 45 gradi, visualizzare l'ago utilizzando l'obiettivo 10x e posizionarlo al centro del campo visivo, vicino al piano focale. Utilizzando le manopole grossolane del micromanipolatore, il supporto è collegato tramite un tubo a una siringa di vetro, che viene utilizzata per generare la pressione necessaria per espellere il liquido dalla punta dell'ago.Per mantenere una pressione costante, la siringa viene montata su un morsetto per tubo. Utilizzando due tappi di gomma e due morsetti metallici, sollevare l'ago di alcuni millimetri per evitare che venga danneggiato nei passaggi successivi, quindi arretrare il microscopio. Pilastro, aumentare la pressione premendo lo stantuffo della siringa.Da 0,5 a due centimetri cubici. Posizionare una piastra di Petri contenente un'ansa con uno strato cellulare monolayer ferito. Sul palco di osservazione, arretrare il microscopio.Spostare in avanti il supporto fino alla posizione verticale, in modo che il condensatore si allinei con l'ago per entrare nel liquido. Questa operazione deve essere eseguita con attenzione per evitare che l'ago si rompa sul vetrino coprioggetto. Utilizzando l'obiettivo 10x, identificare il centro dell'incrocio delle spirali e posizionare l'ago sopra le cellule da iniettare.Aumentare l'ingrandimento passando all'obiettivo 40 x. Quindi abbassare e centrare l'ago utilizzando le manopole di regolazione fine del joystick. Iniziare l'iniezione in un angolo dell'incrocio della ferita abbassando l'ago fino al contatto con il nucleo.Dopo l'iniezione, una cellula presenta un evidente cambiamento nella luminosità di fase. Proseguire lungo un margine della ferita trasversale. Per facilitare l'identificazione delle cellule iniettate durante la visualizzazione, è fondamentale regolare correttamente la pressione di iniezione per ogni ago.La pressione deve essere sufficientemente elevata da perforare le membrane plasmatica e nucleare, ma non così elevata da uccidere le cellule. Microiniettare le cellule lungo il margine della ferita per un periodo di tempo fisso. Con la pratica, è possibile iniettare diverse centinaia di cellule durante questo intervallo.Se si inietta DNA plasmidico, incubare le cellule microiniettate a 37 gradi Celsius in un incubatore per colture cellulari per 20 minuti prima della fissazione, quindi arrestare la trascrizione. Trattare le cellule con un microgrammo per millilitro di alfa-amanitina disciolta nel mezzo di crescita. Questa concentrazione inibisce efficacemente la trascrizione dai plasmidi microiniettati.Rimettere le cellule nell'incubatore e lasciare che esprimano l'mRNA appena sintetizzato. Un singolo ago può essere riutilizzato per iniettare più lamelle. Tuttavia, l'ago deve essere sostituito quando cambia il tipo di DNA o RNA che viene microiniettato.Inoltre, una volta rimosso l'ago dalla bacchetta, quest'ultimo deve essere smaltito per ottenere una misurazione accurata della cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA. Campioni separati devono essere fissati a zero minuti, 15 minuti, 30 minuti, 60 minuti e 120 minuti. Dopo il trattamento con alpha manin al tempo appropriato, aspirare il mezzo di crescita e lavare le cellule due volte con due millilitri di soluzione PBS.È importante mantenere umide le lamelle riducendo al minimo il tempo in cui non sono immerse in liquido. Fissare le cellule aggiungendo due millilitri di aldeide al 4% in PBS e incubare le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato i campioni fissati altre due volte, rendere le cellule permeabili con due millilitri di Triton X-100 allo 0,1% in PBS, quindi incubare nuovamente le cellule per almeno 15 minuti a temperatura ambiente.Infine, lavare i campioni altre due volte per prepararli per l'ibridazione. Lavare le cellule due volte con un buffer di lavaggio costituito da una soluzione XSSC 1X contenente dal 25 al 60% di formammide. Quindi preparare la camera di colorazione per l'ibridazione coprendo il fondo di una piastra di Petri da 150 millimetri con acqua e facendo galleggiare sulla superficie un pezzo di paraformaldeide.Rimuovere l'acqua capovolgendo la piastra, in modo da far aderire il paraform al fondo della piastra stessa. Rimuovere manualmente eventuali bolle d'aria da ogni coprioggetto da colorare. Pipettare gocce da 100 microlitri di soluzione di ibridazione sul paraform.Si noti che la quantità di formaggio deve essere ottimizzata per il particolare pro di pesce in uso, con l'aiuto di pinzette. Rimuovere un'immersione con le cellule fissate dalla piastra di Petri da 30 millimetri. Utilizzando carta da filtro Watman, asciugare la parte posteriore dell'immersione ed eliminare il tampone in eccesso dal lato anteriore senza asciugare le cellule.Quindi posizionare il coprivetrino con la faccia rivolta verso il basso sulla soluzione contenente il pesce. Ripetere questo procedimento per ogni coprivetrino. Dopo aver rimesso il coperchio sulle camere di colorazione, incubare i campioni per cinque fino a diciotto ore a 37 gradi Celsius.Preparare diverse camere di lavaggio nello stesso modo in cui è stata preparata la camera di colorazione; per ogni coprioggetto, pipettare un millilitro di tampone di lavaggio sulla paraform della camera di lavaggio. Dopo l'incubazione, rimuovere i coprioggetti dalla camera di colorazione pipettando un millilitro di tampone di lavaggio. Accanto al coprioggetto, il liquido deve essere aspirato sotto ciascun campione per azione capillare.Quindi rimuovere le lamelle con pinzette e posizionarle ciascuna su una goccia di buffer di lavaggio incubata a temperatura ambiente per cinque minuti. Lavare ogni lamella altre due volte, per un totale di tre lavaggi per ogni lamella. Pipettare da 10 a 30 microlitri di soluzione di montaggio con dappy su un vetrino precedentemente lavato. Ogni vetrino può ospitare due lamelle utilizzando pinzette e carta filtro Watman.Asciugare il retro dei coprioggetti ed eliminare il liquido in eccesso dal lato anteriore del coprioggetto senza asciugare i campioni. Posizionare ogni coprioggetto con la faccia verso il basso su una goccia di soluzione di montaggio. I campioni montati possono essere conservati a quattro gradi Celsius.Qui gli effetti dell'alpha mantin sulla trascrizione del DNA plasmidico iniettato sono stati mostrati in cellule di fibroblasti NIH 3T3, precedentemente trattate con concentrazioni variabili di alpha mantin. Sono state iniettate con TFL s delta i, DNA plasmidico e OG coniugato con dextran da 70 chilodalton. Ogni riga corrisponde a un singolo campo visivo acquisito per il dextran da 70 chilodalton OG e per l'mRNA di T uts delta I.È evidente che alte concentrazioni del farmaco hanno completamente inibito la produzione del trascritto T UTS delta I, mentre questo effetto non è stato osservato a concentrazioni più basse. Riportato qui è un andamento temporale del costo dell'esportazione nucleare dell'mRNA. Sette cellule sono state iniettate con DNA plasmidico T UTS delta i e destrano coniugato con OG di 70 chilodalton.30 minuti dopo l'iniezione, le cellule sono state trattate con alfa mantina e incubate a 37 gradi Celsius per zero minuti, 60 minuti e 120 minuti. Le cellule sono quindi state fissate e colorate con una sonda contro l'mRNA di T UTS delta I e con anticorpi contro il marcatore del reticolo endoplasmatico trap alfa; ogni riga corrisponde a un singolo campo di cellule.Per informazioni su come quantificare l'esportazione di mRNA, si prega di consultare il testo online qui. Il punto temporale di 120 minuti è stato ingrandito per dimostrare la colocalizzazione dell'mRNA di TFS delta I nel reticolo endoplasmatico; viene mostrata una sovrapposizione dell'mRNA di T UTS delta I in verde e della TRAP alfa in rosso. Informazioni su come effettuare la colorazione simultanea di mRNA con proteine sono disponibili nel testo online.Abbiamo appena mostrato come misurare la cinetica dell'esportazione nucleare dell'mRNA mediante microiniezione. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che una microiniezione di successo richiede una preparazione adeguata. Passaggi fondamentali come la preparazione del DNA e dell'RNA, la preparazione del campione, la fabbricazione degli aghi, l'allineamento dell'apparecchiatura ottica e la risoluzione dei problemi di microiniezione sono descritti nel nostro protocollo scritto.Quando si esegue l'imaging e l'analisi di mRNA microiniettato, è fondamentale che la quantificazione sia limitata alle cellule che hanno ricevuto oltre il 90% del liquido iniettato nel nucleo. Una microiniezione nucleare di successo può essere valutata osservando la distribuzione della destrana verde organica nel nucleo e nel citoplasma. Si rimanda al nostro protocollo online per ulteriori informazioni sulla progettazione delle sonde per pesci e sull'uso di software di analisi delle immagini per studiare la distribuzione dell'mRNA nel citoplasma e nel nucleo.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica...

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Iniezione diretta intranucleari di cDNA è una tecnica di transfezione efficace per la post-mitotico delle cellule. Questo metodo fornisce un alto livello di espressione della proteina eterologa dai costrutti di cDNA singole o multiple e consente la funzione delle proteine ​​da studiare in un ambiente fisiologicamente rilevanti con una serie di saggi di singola cellula.

Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l'uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un'ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

Grazie alle loro grandi dimensioni e all'organizzazione relativamente semplice, le cellule nutrici di Drosophila sono ideali per gli studi di imaging di cellule vive. Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di composti esogeni nelle cellule e il protocollo presentato mostra la procedura con sonde oligonucleotidiche fluorescenti chiamate beacon molecolari (MB) utilizzate per visualizzare i trascritti di mRNA endogeno.

Microiniezione di cellule infermiere di Drosophila: un metodo di somministrazione intracellulare

Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da...

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

La biogenesi degli snRNA sillitipici è un processo complesso che coinvolge vari compartimenti cellulari. Qui, abbiamo impiegato la microiniezione di snRNA fluorescenti per monitorare il loro trasporto all'interno della cellula.

Analisi della localizzazione snRNA Spliceosomic nelle cellule umane di Hela utilizzando la microiniezione

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

Descriviamo un metodo per l'analisi dell'alterazione di N-glicani legati attraverso la vita inizi di glicoproteine ​​dopo la loro biosintesi in cellule di mammifero. Ciò si ottiene pulse-chase analisi di metabolicamente glicani etichettati, rilascio enzimatico da glicoproteine ​​e l'esame mediante HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

Impara a misurare la cinetica di esportazione nucleare dell'mRNA in cellule di mammifero mediante microiniezione e ibridazione in situ fluorescente. Questo metodo consente la quantificazione precisa del trasporto dell'mRNA dal nucleo al citoplasma.

Analisi della cinetica di esportazione mRNA nucleare in cellule di mammifero da Microiniezione

Esplora altri video