Iniezione di peptidi autoassemblanti e cellule precursori neurali per la riparazione del midollo spinale in un modello di ratto

Fissare un ratto anestetizzato con una lesione del midollo spinale cervicale su un telaio stereotassico.

Il sito della lesione è costituito da assoni danneggiati e cavità piene di liquido circondate da cellule immunitarie infiltrate, cellule gliali e fibroblasti, che ostacolano la ricrescita assonale e il recupero funzionale.

Disinfettare e incidere la pelle sopra la colonna vertebrale. Sezionare i muscoli per esporre la dura, il rivestimento esterno del midollo spinale.

Asportare il tessuto cicatriziale dalla dura madre per rivelare il sito della lesione del midollo spinale.

Posizionare una microsiringa sopra la lesione, contenente peptidi autoassemblanti (SAP), e

iniettarla nel nucleo della lesione su un lato della linea mediana.

Ripetere l'iniezione sul lato opposto per una distribuzione uniforme.

Successivamente, iniettare cellule precursori neurali (NPC) nei siti circostanti la lesione, evitando il nucleo della lesione infiammata per migliorare la sopravvivenza dell'NPC.

Una volta iniettati, i SAP si autoassemblano in un'impalcatura che imita la matrice extracellulare e collega le cavità. Lo scaffold supporta la sopravvivenza delle NPC e la differenziazione in cellule neurali per il rimodellamento dei tessuti.

L'iniezione viene eseguita 14 giorni dopo la lesione del midollo spinale. Prima di iniziare l'intervento, preparare i SAPs a una concentrazione dell'1% in peso per volume in acqua sterile e riempire con la soluzione un capillare di vetro da 100 micrometri collegato a una siringa Hamilton.

Collegare la siringa di Hamilton al telaio stereotassico. Dopo aver anestetizzato il ratto, fissare la testa nel telaio stereotassico e disinfettare il sito chirurgico con iodio povidone e alcol al 70% come prima. Ancora una volta, dopo aver aperto la pelle, sezionare con cura la coppia di muscoli vertebrali e inserire i divaricatori.

Utilizzare un bisturi numero 15 per rimuovere il tessuto cicatriziale dalla dura madre e riesporre il sito della lesione. Quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire con cautela la dura madre. Infine, stereotassicamente, inserire il capillare di vetro a una profondità di due millimetri nel midollo spinale traumatizzato e iniettare i SAP.

Dopo aver iniettato i SAP, lasciare che il capillare rimanga nel sito di iniezione per un minuto prima della rimozione per consentire l'allungamento del tessuto per accogliere la soluzione iniettata. Quindi ripetere l'iniezione nel sito successivo. Qui, le NPC sono state isolate dalla zona paraventricolare di un topo rosso DS adulto e coltivate secondo le procedure precedentemente pubblicate.

Poco prima della microiniezione, diluire le NPC nel terreno di crescita a una concentrazione di 50 volte 10 per la terza cellula viva per microlitro per il trapianto di cellule e caricarle in un capillare di vetro su una siringa di Hamilton. Gli NPC vengono iniettati immediatamente dopo l'iniezione di SAP. Per fare ciò, inserire il capillare di vetro della siringa di Hamilton a 0,2 millimetri di rostrale dal sito della lesione e 1,5 millimetri sotto la superficie dorsale del midollo spinale.

Iniettare due microlitri della sospensione cellulare a una velocità di circa 0,5 microlitri al minuto. Al termine della prima iniezione, lasciare che il capillare rimanga nel midollo spinale per un minuto come prima. Quindi ritrarre il capillare, spostarlo in un sito adiacente e ripetere la procedura di iniezione. Dopo aver atteso un minuto, come prima, ritrarre il capillare e spostarlo di due millimetri coccolare sul sito della lesione.

Eseguire due iniezioni da due microlitri in questa posizione.