Rigenerazione assonale nel nervo sciatico di un topo a seguito di una lesione da schiacciamento

Inizia con il nervo sciatico isolato da un topo.

I neuroni all'interno del nervo sono stati trasfettati per esprimere proteine citoplasmatiche fluorescenti.

Il nervo è stato schiacciato per indurre una lesione, che è stata contrassegnata con una sutura.

I segmenti assonali danneggiati nel sito degenerano e i macrofagi reclutati rimuovono i detriti.

Le cellule di Schwann proliferano per formare tracce guida e secernere fattori neurotrofici che promuovono la ricrescita degli assoni. Gli assoni si estendono lungo queste tracce, rigenerando il nervo.

Fissare il nervo per preservare le strutture cellulari, quindi rimuovere tutti i tessuti non neuronali attaccati.

Lavare con un tampone per eliminare i fissativi residui.

Posizionare il nervo su un vetrino da microscopio, applicare un mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti.

Appiattire il nervo per posizionare gli assoni all'interno dello stesso piano focale per l'imaging.

Utilizzando un microscopio a epifluorescenza, tracciare gli assoni dal sito di schiacciamento alle loro estremità distali per

misurare la lunghezza della rigenerazione.

Separare i DRG insieme alle radici nervose e al nervo sciatico, con attenzione con micro forbici e micro pinze al microscopio da dissezione.

Quindi, trasferire il nervo sciatico direttamente in PFA al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius. Per visualizzare e misurare gli assoni sensoriali marcati con fluorescenza al microscopio di dissezione, rimuovere il tessuto attaccato e la membrana sul nervo sciatico fisso con micro forbici e micro pinze, con attenzione. Quindi, lavare il nervo con PBS tre volte.

Quindi, posiziona il nervo sciatico su un vetrino e tienilo dritto. Aggiungere 80 microlitri di soluzione anti-sbiadimento attorno al nervo, quindi stendere un vetrino coprioggetti su di esso. Appiattire l'intero tessuto montato con la pressione.

Successivamente, posizionare il tessuto appiattito sotto il microscopio a epifluorescenza invertito, dotato di un accessorio per l'acquisizione del mosaico e l'elaborazione delle immagini. Quando si misura la lunghezza degli assoni rigenerati, tracciare tutti gli assoni identificabili marcati in fluorescenza nel nervo sciatico dal sito di schiacciamento alle estremità degli assoni distali.