Name: La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Scopri la coltura di neuroni motori e sensoriali primari su scaffold di nanofibre elettrofilate allineate in poli-L-lattide. Questo metodo guida la crescita neuronale per applicazioni in rigenerazione nervosa.

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NIH K08 EB003996

1. Poli-L-lattico (PLLA) Spinning Soluzione <ol><li> Sciogliere 0,4 g PLLA in 9 ml di cloroformio, mescolando a fuoco basso. </li><li> Aggiungere 1 ml di dimetilformammide alla soluzione, portando la concentrazione finale della soluzione al 4% PLLA (w / v) in cloroformio: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Mettere la soluzione in un polipropilene o siringa di vetro con una punta metallica smussata 23ga. </li></ol> 2. Filatura di preparazione del substrato 1 <ol><li> Preparare una soluzione 8% (w / v) di 85:15 PLGA (poli-lattico-co-glicolico acido) in cloroformio, agitando a fuoco basso. </li><li> Cappotto pulito copertura in vetro scivola in PLGA coprendo la superficie di ogni vetrino con la soluzione di PLGA. Lasciare che il PLGA asciugare per un film sottile (ca. 30 min). </li></ol> 3. Electrospinning 2 <ol><li> Assicurare copertura in vetro rivestito PLGA scivola al collettore con nastro di carbonio conduttivo. Per le fibre allineate, il collettore è un motore ruota. Per le fibre di casuale, il collettore è un piatto fisso. </li><li> Luogo in pompa siringa con punta 20 cm dalla ruota collettore. Set pompa per circa 2 ml / ora e se si utilizza una ruota, impostare il motore a 300-400 giri al minuto. Se possibile, applicare un -2 kV polarizzazione CC al collettore e 15 kV a punta in metallo. In assenza di accesso ad una alimentazione bipolare, a terra il collettore. </li><li> Le fibre si getto dalla punta della siringa e raccogliere sulla ruota in movimento. Continuare a girare solo quando la densità desiderata delle fibre si ottiene. Strisciare la punta di metallo con un tovagliolo di carta, apposto su un non conduttivo asta periodicamente per evitare l'intasamento sulla punta. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> A seguito di filatura, 'fossato' i campioni elettrofilate pipettando una linea di PLGA intorno al perimetro dello slip cover. Lasciare che il PLGA ad asciugare. Esso deve mantenere l'allineamento delle fibre durante cultura. </li></ol> 5. Proteina di rivestimento <ol><li> Elettrofilate fibre di vetro e controlli devono essere rivestiti di proteine ​​prima di colture cellulari. Coprire i substrati in una soluzione proteica per almeno un'ora e poi aspirare la soluzione in eccesso e proseguire fino a quando i substrati aspirazione sono a secco. Le soluzioni possibili sono le proteine: PLL (poli-L-lisina) (100 mg / ml), laminina (25 mg / ml) o fibronectina (50 mg / mL). Se il PLL è usato, i substrati devono essere risciacquati in acqua sterile e asciugati due volte dopo il rivestimento iniziale. </li></ol> 6. E15 ottenere embrioni di ratto 3 * Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con la Guida NIH per la cura e dell'uso degli animali da laboratorio come approvato dalla University of Michigan Commissione Uso e cura degli animali. <ol><li> Preparazione: Verificare se l'animale è incinta. Scongelare 3 mL tripsina, 3 FBS ml e una bottiglia di caldo L15. Fuoco lucidare una pipetta Pasteur. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% per 30 min. </li><li> Preparare e caldo terreni in piastra (vedi tabella 1). </li><li> Eutanasia: eseguire un'iniezione IP di ketamina / xylazina. Attendere 10-15 minuti e controllare per mancanza di riflessi corneale e pedale ritiro. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire una iniezione di pentobarbital IC (FatalPlus). </li><li> Tenda la pelle dell'addome. Tagliare attraverso la pelle e dei muscoli per esporre la cavità addominale. Individuare l'utero e staccarlo al collo dell'utero e delle ovaie. </li><li> Rimuovere gli embrioni dall'utero con le forbici e metterli immediatamente in caldo L15. (Tutte le procedure che seguono sono maturati nell'ambito di un microscopio da dissezione e gli embrioni ei cavi sezionato deve essere immerso in acqua calda L15 in ogni momento.) Decapitare il embrioni chiudendo pinza intorno al mento e sotto l'osso occipitale del cranio. </li></ol> 7. Dissezione 3 <ol><li> Posizionare l'embrione su un lato. Proteggere il midollo spinale con un set di pinze mentre si utilizza l'altro insieme a spogliare arti e organi addominali. </li><li> Girare l'embrione e tenerla ferma con un set di pinze. Snip per tutta la lunghezza dell'embrione, dal collo alla coda, fino a quando il cavo tutto è esposto. </li><li> Afferrare l'estremità del cavo con attenzione e tirarlo su se stesso verso la coda da rimuovere. Il cavo tirerà libero con membrana e dei gangli spinali (DRG) allegato. </li><li> Se DRG espianto o dissociati cultura neuroni sensoriali deve essere eseguita, snip DRG il cordone e trasferirli in un piatto fresco di caldo L15. <ol><li> Per i DRG cultura espianto, passare alla fase 10,2 </li><li> Per dissociato cultura neuroni sensoriali, passare al punto 9 </li><li> Per la cultura del motoneurone, il DRG verrà rimosso con la membrana al passo 7,5 </li></ol></li><li> Rimuovere la membrana dal midollo spinale afferrandolo all'estremità superiore del cavo e peeling verso il basso, simile a rimuovere un calzino lungo. Ripetere l'operazione per tutti gli embrioni e poi tagliare le corde in piccoli (2-3 mm) pezzi. </li></ol><pclass motor neuron elaborazione>5,6,7 <ol><li> Versare i cavi tritato e L15 in una forma conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi. </li><li> Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina alle corde pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min. </li><li> Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet. </li><li> Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS. </li><li> Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle. </li><li> Preparare una soluzione al 9% di Optiprep in L15. Preparare un tubo con 3 ml di soluzione Optiprep per ogni due embrioni (se c'è un numero dispari di embrioni, arrotondare per eccesso). </li><li> Goccia la soluzione omogeneizzato sulla soluzione Optiprep, divide equamente tra tutti i tubi. Spin le provette a 2000 RPM per 15 minuti. </li><li> Raccogliere accuratamente la parte superiore da 2 ml ciascuna provetta e piscina in una conica da 50 ml. Riempire il conico con L15 e far girare a 1000 RPM per 5 minuti per sciacquare le cellule del Optiprep. </li><li> Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Passare al punto 10,1 </li></ol> 9. Sensoriale Neuron (SN) Elaborazione 7 <ol><li> Versare il DRG rimosso dal midollo spinale e L15 in un tubo conico e girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi. </li><li> Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina al DRG pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet. </li><li> Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS. </li><li> Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle. </li><li> Spin l'omogeneizzato a 1000 rpm per 5 min. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra SN (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Continuare a passo 10,1 </li></ol> 10. Placcatura e Cultura <ol><li> Per dissociato SN o MN cultura: <ol><li> Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere un volume adeguato di sospensione cellulare. Cellule dissociate dovrebbe essere placcato a bassa densità (25-50 cellule / mm 2). Consentire alle cellule di aderire per almeno un'ora prima di allagare i pozzetti con i media. </li></ol></li><li> Per i DRG cultura espianto: <ol><li> Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere DRG ai media. Disporre i DRG in modo che siano distribuiti uniformemente in tutto il substrato (circa 4 DRG si inserisce su un foglio 22x22 copertina mm). Lasciare che il DRG di aderire per almeno 4 ore prima di allagare i pozzetti con i media. </li></ol></li><li> Culture può essere mantenuta per un massimo di 4 giorni senza cambiare supporto. Per i più culture, la metà cambiamenti dei media dovrebbe essere fatto con mezzi di feed. Alimentazione dei supporti è la stessa composizione di terreni in piastra meno la L-glutammina. </li></ol> 11. Immunocitochimica 1,5,8 <ol><li> Fissaggio delle cellule: i media Aspirare e sostituirlo con caldo al 4% PFA (paraformaldeide) per 30 minuti. Quindi eseguire 3X 5 min 1x lavaggi PBS. </li><li> Blocco / permeabilizzazione: Preparare blocco / perm soluzione (1,25% siero albumina bovina in PBS 1X, 0,05% Triton X-100 e il 2,0% di siero normale di capra). Aspirare il PBS e applicare blocco / perm soluzione ai campioni per 30 minuti. Quindi eseguire 1X 5 min 1x lavaggi PBS. </li><li> Anticorpo primario: Preparare la soluzione primaria di anticorpi di lavoro (10% siero di capra normale, 1,25% di sieroalbumina bovina, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-100 e a 10 ml con PBS 1x). Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (vedi tabella 2). Linea di piatti diversi con parafilm. Mettere una goccia 200μl di soluzione dell'anticorpo primario sul parafilm per ciascun substrato. Invertire la substrati, galleggiante loro lato della cella verso il basso la soluzione di anticorpo primario di lavoro durante la notte (se la stanza è dotata di aria condizionata o particolarmente secchi, un pezzo di carta saturi d'acqua può essere aggiunta in un angolo del piatto per evitare l'evaporazione della soluzione di lavoro) . </li><li> Anticorpo secondario: Rimuovere i substrati dal primario (la soluzione di lavoro può essere raccolto, conservato a 4 ° C e riutilizzati) ed eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Applicare 200 microlitri anticorpo secondario diluito 1:200 in PBS (anche rovesciato su un piatto rivestito parafilm) per 4 ore. </li><li> Togliere dal secondario quindi eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Substrati montaggio su vetrini con Prolungare oro contenente DAPI o un altro contatore adatto nucleare macchia. </li></ol> 12. Rappresentante dei risultati: La morfologia tipica della allineate e casuale elfibre ectrospun sono mostrati in Figura 1. Noi di solito ottenere la purezza MN di&gt; neuroni del 90% 7,8 con questo protocollo e abbiamo mantenuto DRG culture per tutto il tempo una settimana, senza alcun significativa crescita dei fibroblasti. La figura 2 mostra l'aspetto tipico MN su vetro e fibre dopo 24 ore di cultura e immunocolorazione. DRG immunostained colto per tre giorni su vetro e fibre sono rappresentate nella figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Allineamento fibra viene manipolata per scelta del collezionista. A.) Allineati fibre filate su un collettore ruota in movimento e B.) fibre casuale filato su un collettore piano fisso. Barre di scala = 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Motoneuroni rappresentante colorate per TuJ1 (verde) e DAPI (blu) dopo 24 ore di cultura sul PLL A. patinata) fibre e B.) di vetro. Barre di scala = 20 micron. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. DRG macchiato rappresentante per neurofilamenti (verde) dopo 3 giorni di coltura su PLL rivestito A.), vetro e B.) fibre. Barre di scala = 200 micron. <table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione: </td><td> MN media: </td><td> DRG / SN media: </td></tr><tr><td> 10 mg ml -1 albumina </td><td> 12,5 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg ml -1 apo-transferrina </td><td> 50 microlitri </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td> 50 mg ml -1 β-estradiolo </td><td> 2,7 microlitri </td><td> 2,2 microlitri </td></tr><tr><td> 0,1 mg ml -1 biotina </td><td> 50 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg ml -1 catalasi </td><td> 8 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg ml -1 D-galattosio </td><td> 50 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 ml di idrocortisone mcg -1 </td><td> 3,7 microlitri </td><td> 2,9 microlitri </td></tr><tr><td> 0,63 mg ml -1 progesterone </td><td> 0,5 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg ml -1 putrescina </td><td> 50 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 mg ml -1 selenio </td><td> 3,4 microlitri </td><td> 4,1 microlitri </td></tr><tr><td> 2,5 mg ml -1 superossido dismutasi </td><td> 50 microlitri </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 fattore di crescita nervosa </td><td> - </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 ml </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> * 2 mM L-glutammina </td><td> 35 microlitri </td><td> 35 microlitri </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> a 50 mL </td><td> a 50 mL </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Aggiungi protagonista (*) i componenti per i media al momento dell'uso. I restanti componenti possono essere preparati come una soluzione di riserva e conservato a -20 ° C fino al momento 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaria (concentrazione) </td><td> Neuroni: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblasti: </td></tr><tr><td> anti-β-tubulina (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-neurofilamenti (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> NGFR anti-p75 (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tabella 2. La selezione dei anticorpo primario dipende gli obiettivi del ricercatore. Quanto sopra sono anticorpi diversi e le concentrazioni che abbiamo usato con successo nel nostro laboratorio. S-100 è particolarmente utile per identificare le cellule di Schwann e / o verificare la presenza di contaminanti fibroblasti, ma nota che esso deve essere usato in combinazione con NGFR p75 di distinguere tra cellule gliali e fibroblasts4. Abbiamo anche notato che NGFR p75 macchie neuriti molto leggermente, mentre neurofilamenti o TuJ1 sono una ottima scelta, se l'obiettivo è quello di visualizzare neuriti individuali. </pclass>

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo ha diversi punti critici. La prima riguarda la corretta produzione di substrati in fibra di elettrofilate. Nei liquidi, le fibre PLLA, PLGA film e fossato PLGA separerà dal coupon vetro di copertura come una singola unità. Se il PLGA viene omesso, le fibre PLLA non rimarrà un foglio - che si arricciano in un groviglio inutilizzabile. Così, il film PLGA è incluso come un substrato adatto per mantenere l&#39;allineamento delle fibre durante cultura. Il fossato viene aggiunto dopo spinning sia per garantire che le fibre siano saldamente fissate al film PLGA e di aggiungere la rigidità strutturale del film. Il fossato funge anche da manico utile quando i substrati sono manipolati durante il fissaggio, colorazione e montaggio. Triturazione è il secondo passo fondamentale. Ogni sforzo dovrebbe essere fatto per evitare la formazione di bolle. Inoltre, abbiamo ottenuto rendimenti molto più alti quando un incendio lucidato pipetta viene utilizzata in questa fase. Al fuoco lucido, la luce un becco Bunsen e allegare una lampadina per la pipetta. Passo la punta della pipetta rapidamente attraverso la fiamma 2-3 volte, mentre continua spremitura e rilasciando la lampadina - flusso d&#39;aria attraverso la pipetta aiuterà a prevenire la punta di chiudere completamente. Esaminare la punta della pipetta assicurando così il buco è ancora aperto e che i bordi appaiono leggermente arrotondati prima dell&#39;uso. Electrospinning è un processo molto versatile; i parametri electrospinning può essere modificata per produrre fibre con una varietà di morfologie. Tan et al. (2005) i dettagli di uno studio sistematico di parametri che influenzano il diametro del PLLA fibre elettrofilate. Wang et al. (2009) presenta uno studio dettagliato dei parametri che influenzano l&#39;allineamento delle fibre elettrofilate PLLA.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-estradiolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Superoxide dismutasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-neurofilamento</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Suero di capra normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di carbonio</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

la cultura del motore principale e neuroni sensoriali in media definiti in elettrofilate poli-l-lactide ponteggi nanofibre

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Electrospinning è una tecnica per la produzione di micro-a nano-scala fibre. Fibre possono essere elettrofilate con vari gradi di allineamento, da altamente allineati a completamente casuale. Inoltre, le fibre possono essere filata da una varietà di materiali, compresi i polimeri biodegradabili come il poli-L-lattico (PLLA). Queste caratteristiche rendono le fibre elettrofilate adatto per una varietà di applicazioni di ponteggi in ingegneria dei tessuti. Il nostro obiettivo è l&#39;uso di fibre elettrofilate allineati per la rigenerazione dei nervi. Abbiamo precedentemente dimostrato che allineare le fibre elettrofilate PLLA la conseguenza diretta di entrambi i neuroni sensoriali e motorie primarie in vitro. Riteniamo che l&#39;uso di un sistema primario di coltura cellulare è essenziale per la valutazione dei biomateriali ai neuroni modello reale trovato in vivo il più possibile. Qui, descriviamo le tecniche utilizzate nel nostro laboratorio di electrospin ponteggi fibroso e cultura espianti gangli dorsali, così come dissociata neuroni sensoriali e motori, su ponteggi elettrofilate. Tuttavia, il electrospinning e / o tecniche di coltura qui presentate possono essere facilmente adattati per essere utilizzati in altre applicazioni.

Allineati fibre elettrofilate diretta la crescita dei neuroni in vitro e sono una componente potenziale di ponteggi rigenerazione nervosa. Abbiamo descritto una procedura per la preparazione di substrati di fibre elettrofilate e il siero senza cultura di primaria ratto E15 sensoriali (DRG) e neuroni motori. Visualizzazione dei neuroni mediante immunocitochimica è anche incluso.

La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

L'electrospinning è una tecnica per la produzione di fibre su scala micro e nanometrica. Le fibre possono essere ottenute tramite electrospinning con vari gradi di allineamento, da altamente allineate...

Le fibre di electros bun allineate indirizzano la crescita dei neuroni in vitro e rappresentano una componente potenziale degli scaffold per la rigenerazione nervosa. In questo caso, vengono generati scaffold di fibre di electros BUN e su di essi vengono coltivati neuroni sensoriali e motori primari di ratto. In primo luogo, scaffold fibrosi vengono elettrofilati su coprioggetti di vetro.Neuroni primari vengono quindi ottenuti da ratti al giorno embrionale 15 e coltivati su impalcature di fibre elettrofilate. Ai neuroni viene consentito aderire e crescere, quindi vengono fissati e colorati mediante tecniche di immunoistochimica. I risultati delle analisi di imaging rivelano cambiamenti nella morfologia dei neuroni coltivati su fibre elettrofilate, indicando che la nanotopografia delle fibre elettrofilate può indirizzare la fuoriuscita dei neuriti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di linee cellulari trasformate, è che i neuroni primari e la coltura in vitro riproducono in modo più accurato il comportamento dei neuroni in vivo rispetto alle cellule trasformate. Queste tecniche offrono la possibilità di utilizzare fibre elettrofunzionali con altri tipi cellulari. In alternativa, gli utenti possono scegliere di utilizzare neuroni motori e sensoriali in coltura per altre finalità investigative.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché l'elettrofilatura è un processo delicato, che spieghiamo in modo più dettagliato nel nostro articolo video associato. Per preparare i substrati di fibre elettrofilate, iniziare preparando una soluzione all'8% di acido polilattico-co-glicolico 85 a 15 o PLGA in cloroformio e una soluzione al 4% di poli-L-lattide o PLLA in cloroformio, mescolando a bassa temperatura. Successivamente, ricoprire vetrini di vetro puliti con PLGA coprendo l'intera superficie di ciascun vetrino con la soluzione di PLGA, quindi lasciare asciugare il PLGA fino a formare un sottile film, processo che richiede circa 30 minuti.Una volta che il PLGA è asciutto, utilizzare nastro di carbonio conduttivo per fissare un PLG. Un cover slip rivestito su una ruota azionata da motore per generare fibre allineate o su una piastra stazionaria per fibre casuali. Posizionare una siringa contenente la soluzione di PLLA al 4% in una pompa con una punta, a 20 centimetri dal collettore.Impostare la pompa a circa 0,22 millilitri all'ora. Impostare il motore della ruota da 300 a 400 giri al minuto. Applicare un bias in corrente continua di meno due chilovolt al collettore e di più 15 chilovolt alla piastra conduttrice, che è a contatto con la punta metallica.In assenza di un collegamento a massa per l'alimentatore bipolare, il collettore avvia la pompa per siringa e le fibre fuoriescono dalla punta della siringa raccogliendosi sulla ruota rotante. Continuare a far ruotare fino a raggiungere la densità desiderata di fibre; per evitare l'intasamento della punta metallica, pulirla periodicamente con un tovagliolo di carta fissato a un'asta non conduttiva, seguendo la linea di pipettatura di PLGA lungo il perimetro del vetrino. Fondamentalmente, si crea un fossato intorno all'elettrospun.I campioni a forma di imbuto permettono al PLGA di asciugarsi. Questo manterrà l'allineamento delle fibre durante la coltura. Le fibre elettrofilate e i controlli in vetro devono essere rivestiti con proteine prima della coltura cellulare.Per fare ciò, coprire i substrati con poliolina, lisina, laminina o fibronectina per almeno un'ora. Quindi aspirare la soluzione in eccesso fino a quando i substrati non saranno asciutti. Se si utilizza lisina poliolina, il substrato deve essere risciacquato con acqua sterile e asciugato due volte dopo il rivestimento iniziale.Una volta asciutti, posizionare i substrati in piastre per colture cellulari a sei pozzetti per la coltura cellulare, al fine di preparare le cellule che verranno crescitate sulle fibre di elettrofilatura. Ottenere embrioni E15 da un ratto gravido sottoposto a eutanasia. Iniziare sterilizzando l'area con etanolo al 70% e quindi sollevando a tenda la pelle dell'addome.Tagliare attraverso gli strati di pelle e muscolo per esporre la cavità addominale. Individuare l'utero e staccarlo a livello della cervice e delle ovaie. Trasferire l'utero in una piastra sterile.Quindi rimuovere gli embrioni dall'utero con le forbici e posizionarli immediatamente in L 15 caldo. Dopo aver decapitato gli embrioni, posizionare un embrione su un lato proteggendo il midollo spinale con un paio di pinzette. Utilizzare l'altro paio per rimuovere arti e organi addominali.Successivamente, ruotare l'embrione e tenerlo fermo con un paio di pinzette. Rimuovere delicatamente il tessuto lungo l'embrione dal collo alla coda fino a quando tutto il midollo spinale non è esposto. Afferrare con cura l'estremità del midollo spinale, quindi tirarlo su se stesso verso la coda.Per rimuoverlo, il cordone verrà estratto liberamente con la membrana e i gangli delle radici dorsali attaccati. Se si deve eseguire un espianto di gangli delle radici dorsali o una coltura di neuroni sensoriali dissociati, staccare i gangli delle radici dorsali dal cordone e trasferirli in una nuova piastra con L 15 caldo. Per la coltura di neuroni motori.Afferrare la membrana dal midollo spinale all'estremit&agrave; anteriore del cordone e staccarla verso il basso. Similmente a come si toglie un calzino lungo, ripetere questo processo per tutti gli embrioni e quindi, utilizzando pinzette, tritare i cordoni in piccoli pezzi per ottenere colture di neuroni motori.Versare i midolli spinale tritati e l'L 15 in un tubo conico e centrifugare a 180 ×g per due o tre minuti. Per formare il pellet, rimuovere il soprannatante e aggiungere tre millilitri di tripsina ai midolli pelletizzati. Collocare il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per 20 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere tre millilitri di FBS nel tubo conico. Quindi centrifugare a 180 ×g per due o tre minuti per rimuoverlo. Nel frattempo, passare una pipetta di pasta COTA attraverso la fiamma e lucidarla con FBS aspirando il FBS nella pipetta ed espellendolo successivamente.Questo impedisce che frammenti di tessuto aderiscano al vetro durante la triturazione. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante. Quindi aggiungere un'intera pipetta Pasteur di L-15 nel tubo conico e triturare delicatamente utilizzando la pipetta rivestita con FBS fino a ottenere una soluzione omogenea senza grumi visibili.Evitare la formazione di bolle. Preparare un tubo con tre millilitri di 9%opre in L 15 per ogni due embrioni. Se il numero di embrioni è dispari, aggiungere una goccia.La soluzione omogeneizzata sulla parte superiore della soluzione OptiPrep, dividendo in modo uniforme l'omogenato tra tutti i tubi. L'omogenato formerà uno strato torbido visibile sulla parte superiore della soluzione OptiPrep. Centrifugare i tubi a 700 ×g per 15 minuti.Prelevare con attenzione i primi due millilitri da ogni provetta e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Riempire il tubo conico con L 15 e centrifugare a 180 ×g per cinque minuti per rimuovere l'opre dalle cellule. Rimuovere il soprannatante.Il pellet raramente è visibile ad occhio nudo. A questo stadio, Reese, sospendere le cellule in una piccola quantità di mezzo di semina. Contare le cellule utilizzando l'esclusione del blu di triam per identificare le cellule vive.Le cellule sono ora pronte per essere seminate. Si prevede di ottenere colture di neuroni sensoriali con una purezza superiore al 90%. Iniziare versando i gangli della radice dorsale rimossi dai midolli spinali e l'L 15 in un tubo conico.Centrifugare a 180 ×g per due o tre minuti per formare il pellet dei frammenti. Versare il sopranatante e aggiungere tre millilitri di trips nel pellet di DRG; incubare in un bagno a 37 °C. Dopo 10 minuti, rimuovere il tubo dal bagno termico e aggiungere tre millilitri di FBS al tubo; centrifugare a 180 ×g per due o tre minuti per riguadagnare il pellet.Nel frattempo, rivestire con FBS una pipetta di pasta vetrificata. Come in precedenza, utilizzare la pipetta rivestita con FBS per aggiungere una pipetta piena di L-15 al pellet e agitare delicatamente fino a ottenere una soluzione omogenea senza grumi visibili. Evitare la formazione di bolle dopo aver centrifugato l'omogenato a 180 ×g per cinque minuti.Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di mezzo di coltura per neuroni sensoriali. Contare le cellule utilizzando l'esclusione al blu di tripano per identificare le cellule vive. Le cellule sono ora pronte per essere seminate per la coltura di neuroni sensoriali o motori.Iniziare coprendo i substrati di fibre elettrofilate rivestiti con proteine con alcune gocce di mezzo. Quindi aggiungere un volume appropriato di sospensione cellulare. Le cellule dissociate devono essere seminate a bassa densità.Lasciare che le cellule aderiscano per almeno un'ora nell'incubatore prima di aggiungere il mezzo nei pozzetti e rimetterli nell'incubatore per la coltura. Le melanzane dei gangli delle radici dorsali coprono i substrati di fibre elettrofilate rivestite di proteine con alcune gocce di mezzo. Quindi aggiungere i gangli delle radici dorsali al mezzo.Disporre i gangli delle radici dorsali in modo che siano distribuiti uniformemente sul substrato. Circa quattro gangli delle radici dorsali possono essere posizionati su un cover slip di 22 per 22 millimetri. Collocare le colture dei gangli delle radici dorsali nell'incubatore a 37 gradi Celsius e lasciarle aderire per almeno quattro ore dopo l'incubazione.Inondare i pozzetti con il mezzo e riposizionarli nell'incubatrice. Le colture possono essere mantenute fino a quattro giorni senza cambio di mezzo. Per colture più lunghe, è necessario effettuare cambi parziali del mezzo con mezzo di alimentazione.Il mezzo di coltura ha la stessa composizione del mezzo di semina, privato del L-glutammato. Una volta che le cellule hanno raggiunto il punto temporale desiderato, può essere eseguita l'immunocitochimica secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato. Questa immagine al microscopio elettronico a scansione illustra la morfologia tipica di fibre elettrofilate allineate e casuali.L'allineamento delle fibre viene controllato mediante la scelta del collettore. Si noti che le fibre depositate su un collettore rotante sono uniformemente allineate. Al contrario, le fibre depositate su un collettore fisso presentano una morfologia casuale.Queste immagini mostrano la colorazione dei neuroni motori per la beta tubulina, mostrata in verde, e la colorazione nucleare con DPI in blu. Dopo 24 ore di coltura su fibre rivestite con PLL e su vetro con fibre, i neuroni motori presentano in genere pochi prolungamenti che si estendono dal corpo cellulare parallelamente alla direzione di allineamento delle fibre, che in questa immagine va da sinistra a destra. I prolungamenti principali delle cellule coltivate sulle fibre sono molto più lunghi rispetto ai prolungamenti principali delle cellule coltivate su vetro allo stesso tempo. I neuroni motori coltivati su vetro presentano tipicamente un numero maggiore di prolungamenti a 24 ore, che si estendono radialmente dal corpo cellulare. I neuroni coltivati su fibre. Il prolungamento principale è inoltre più corto su vetro rispetto a quelli osservati su fibre in queste immagini.I gangli delle radici dorsali sono colorati per i neurofilamenti mostrati in verde. Dopo tre giorni di coltura su vetro rivestito con PLL e fibre, i neuriti si estendono radialmente dal ganglio della radice dorsale. Si osserva inoltre un significativo sovrapposizione dei neuriti adiacenti sulle fibre.Anche i neuriti si irradiano radialmente dal ganglio. Tuttavia, successivamente cambiano direzione e seguono il verso delle fibre allineate. C'è un sovrapposizione significativamente minore tra neuriti adiacenti una volta che queste procedure sono state apprese.La elettrofilatura può essere completata in circa 30 minuti, mentre i neuroni motori e sensitivi possono essere ottenuti in circa due ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una tecnica sterile. L'uso di una pipetta levigata alla fiamma per il passaggio di iterazione è necessario per massimizzare la sopravvivenza neuronale.Inoltre, è importante incubare la molecola adesiva e le fibre elettrofilate per il tempo appropriato. Ad esempio, se le fibre sono rivestite con polilisina per meno di un'ora, il rivestimento sarà insufficiente a sostenere l'adesione cellulare. Tuttavia, se la polilisina viene lasciata agire troppo a lungo, ad esempio per tutta la notte, le fibre possono degradarsi.È inoltre importante ricordare che la maggior parte dei microscopi non consente la visualizzazione dei neuroni sulle fibre durante la coltura. Questo perché le fibre e i processi neuronali appaiono molto simili tra loro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare colture primarie di neuroni motori e sensitivi da ratti al giorno embrionale 15 su substrati di fibre elettrofilate.Ricordare che lavorare con alte tensioni può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare adeguate precauzioni per isolare l'operatore dall'apparato di elettrofilatura.

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Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Questo video mostra la creazione di un modello di tessuto neurale polarizzato in 3D utilizzando scaffold di seta-collagene. Descrive in dettaglio il processo di semina delle cellule neuronali su scaffold di seta porosa, l'incubazione per l'attaccamento cellulare, l'incorporazione dell'impalcatura con il collagene e sottolinea l'importanza della matrice di collagene di supporto nella formazione di un modello di tessuto neurale polarizzato 3D.

Sviluppo di un modello 3D ingegnerizzato basato su seta-collagene di tessuto neurale polarizzato

Questo protocollo combina elettrofilatura e microsfere per sviluppare scaffold di ingegneria tissutale per dirigere i neuroni. Il fattore di crescita nervoso è stato incapsulato all'interno di microsfere di PLGA e elettrofilato in scaffold fibrosi di acido ialuronico (HA).  La bioattività della proteina è stata testata seminando gli scaffold con i gangli della radice dorsale del pulcino primario e coltivandoli per 4-6 giorni.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

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