Trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali per la regolazione epigenetica dell'espressione dell'alfa-sinucleina

Scongelare le cellule progenitrici neurali o NPC conservate con un crioprotettore in un blocco termico.

Queste NPC esprimono un aumento dell'alfa-sinucleina, un fattore chiave nella malattia di Parkinson.

Trasferire le cellule scongelate in una provetta contenente un terreno basale caldo per diluire il crioprotettore.

Centrifugare per pellettare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in mezzi neurali.

Aggiungere la sospensione cellulare su una piastra multipozzetto rivestita con ECM e incubare per consentire l'adesione e la proliferazione cellulare.

Aggiungere vettori lentivirali contenenti RNA guida, Cas9-DNA metiltransferasi disattivata e un gene di resistenza agli antibiotici.

Incubare per facilitare l'ingresso virale, la trascrizione inversa dell'RNA virale, l'integrazione nel genoma ospite e l'espressione del transgene.

L'RNA guida dirige dCas9 al gene dell'alfa-sinucleina, dove la metilazione del DNA mediata dalla metiltransferasi riduce l'espressione dell'alfa-sinucleina.

Sostituire i terreni con mezzi neurali contenenti antibiotici per selezionare le cellule trasdotte, mentre le cellule non trasdotte vanno incontro ad apoptosi.

Posizionare un Cryovial con MD NPC in un blocco termico a 37 gradi Celsius per due minuti e trasferire le cellule scongelate in una provetta conica da 15 millilitri con 10 millilitri di DMEM-F12 caldo.

Centrifugare a 300 g per cinque minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di terreno N2B2 completo preriscaldato. Aggiungere due millilitri di N2B27 alla sospensione cellulare e piastra due millilitri di cellule in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti rivestita di BMM precedentemente preparata.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% CO_2 durante la notte. Quando le NPC MD sono al 70% di confluenza, trasdurle aggiungendo due microlitri di vettori d-Cas9-DNMT3A dell'RNA guida del lentivirus e agitare delicatamente la piastra. Dopo aver incubato le cellule nelle stesse condizioni di prima per 16 ore, sostituire il terreno N2B27 48 ore dopo la trasduzione.

Aggiungere N2B27 con cinque microgrammi per millilitro di puromicina