Trasduzione lentivirale delle cellule progenitrici neurali per la regolazione epigenetica dell'espressione dell'alfa-sinucleina

Scongelare le cellule progenitrici neurali o NPC conservate con un crioprotettore in un blocco termico.

Queste NPC esprimono un aumento dell'alfa-sinucleina, un fattore chiave nella malattia di Parkinson.

Trasferire le cellule scongelate in una provetta contenente un terreno basale caldo per diluire il crioprotettore.

Centrifugare per pellettare le cellule, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in mezzi neurali.

Aggiungere la sospensione cellulare su una piastra multipozzetto rivestita con ECM e incubare per consentire l'adesione e la proliferazione cellulare.

Aggiungere vettori lentivirali contenenti RNA guida, Cas9-DNA metiltransferasi disattivata e un gene di resistenza agli antibiotici.

Incubare per facilitare l'ingresso virale, la trascrizione inversa dell'RNA virale, l'integrazione nel genoma ospite e l'espressione del transgene.

L'RNA guida dirige dCas9 al gene dell'alfa-sinucleina, dove la metilazione del DNA mediata dalla metiltransferasi riduce l'espressione dell'alfa-sinucleina.

Sostituire i terreni con mezzi neurali contenenti antibiotici per selezionare le cellule trasdotte, mentre le cellule non trasdotte vanno incontro ad apoptosi.

Posizionare un Cryovial con MD NP