JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 3:13 min • August 29th, 2025
Prendi una miscela di virus contenente un gene desiderato per la trasduzione e un colorante tracciante in un tampone.
Aspirare la miscela virus-colorante in un capillare a punta fine.
Prendi una topolina incinta anestetizzata con una regione addominale rasata.
Disinfettare la pelle con etanolo, seguito da una soluzione di betadina.
Fai un'incisione sulla linea mediana per esporre la cavità addominale e posiziona un film di paraffina su di essa.
Esporre le corna uterine e versarvi sopra del tampone per prevenire la secchezza.
Prendi nota dell'ordine e della posizione degli embrioni. Regolare la posizione dell'embrione all'interno del sacco uterino per accedere ai siti di iniezione.
Iniettare la miscela virus-colorante nel midollo spinale e nei ventricoli cerebrali.
Garantire un'iniezione accurata visualizzando la distribuzione del colorante.
Rimetti le corna uterine nella cavità addominale e versa un po' di tampone.
Sutura la cavità addominale, seguita dalla pelle.
Il virus iniettato entra nella cellula ospite, rilasciando il gene bersaglio e consentendone l'espressione.
Iniziare caricando una punta capillare personalizzata contenente da quattro volte 10 a 11 particelle virali di rivestimento del virus adeno-associato di tipo 1 per il bersaglio desiderato ed etichettata con colorante Fast Green su un tubo aspiratore. Aggiungere 15 microlitri di particelle virali adeno-associate marcate nel capillare.
Successivamente, confermare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi in un topo gravido embrionale anestetizzato giorno 14,5 e disinfettare la pelle. Usa una pinza per iride seghettata curva e forbici diritte in carburo di tungsteno per praticare un'incisione cutanea lungo la linea mediana. Utilizzando una pinzetta Dumont dritta per afferrare la parete peritoneale, continuare lungo la linea alba con le forbici Vannas dritte e posizionare un pezzo di pellicola di paraffina fenestrata sull'apertura addominale e utilizzare un dispositivo simile a un cucchiaio per esporre le corna uterine senza danneggiare gli embrioni all'interno delle corna.
Dopo aver applicato alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius sulle corna uterine, ispezionare gli embrioni per danni o malformazioni all'interno del sacco uterino. Girare con cura gli embrioni all'interno delle loro sacche fino a raggiungere la posizione desiderata per ogni iniezione. Quando gli embrioni sono a posto, iniettare uno o due microlitri della soluzione di particelle virali marcata Fast Green in ogni embrione.
Dopo che tutti gli embrioni sono stati iniettati, riposizionare le corna uterine nella cavità addominale e aggiungere alcune gocce di PBS a 37 gradi Celsius nell'addome. Quindi utilizzare suture in poliammide 6-0 per chiudere la parete peritoneale e suture in poliammide 3-0 e pinze emostatiche Halsted's Mosquito per chiudere la pelle.